Penentuan Secara Cepat Enam Komponen Efektif di Cistanche Tubulosa Dengan Spektroskopi Inframerah Dekat

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

Xinhong Wang, Xiaoguang Wang dan Yuhai Guo

Abstrak:

Penentuan kuantitatif beberapa komponen efektif dalam suatu tanaman biasanya membutuhkan produk alami asli dalam jumlah yang sangat besar. Dalam penelitian ini, kami mengusulkan metode cepat dan non-destruktif untuk penentuan simultan echinacosida, verbascoside, manitol, sukrosa, glukosa, dan fruktosa dalamCistanche tubulosadengan spektroskopi inframerah-dekat (NIRS). Near-infrared diffuse reflectance spectroscopy (DRS) dan high-performance liquid chromatography (HPLC) dilakukan pada 116 batch sampel Cistanche tubulosa. Data DRS diolah menggunakan metode standard normal variety (SNV) dan multiplicative scatter correction (MSC). Regresi kuadrat terkecil parsial (PLSR) digunakan untuk membangun model kalibrasi untuk komponen yang diminati di Cistanche tubulosa. Semua model kemudian dinilai dengan menghitung root mean square error of kalibrasi (RMSEC), koefisien korelasi kalibrasi (r). Nilai r dari keenam model kalibrasi ditentukan lebih besar dari 0,94, menunjukkan bahwa setiap model dapat diandalkan. Oleh karena itu, model NIR kuantitatif yang dilaporkan dalam penelitian ini dapat memenuhi syarat untuk secara akurat mengukur kandungan enam komponen obat dalamCistanche tubulosa.

Kata kunci: Cistanche tubulosa; kromatografi cair kinerja tinggi; spektroskopi inframerah-dekat; kuadrat terkecil parsial

pengantar

Benteng(Hoffmg. Et Link) adalah genus fanerogami abadi dari keluarga tumbuhan Orobanchaceae. Sebagian besar spesies yang termasuk dalam genus Cistanche telah digunakan sebagai tanaman obat selama ribuan tahun di Cina; memiliki reputasi sebagai tonik superior; dan dikenal sebagai "Ginseng dari Gurun" [1,2].Cistanche tubulosaadalah parasit obligat dari akar tanaman abadi Tamarix Chinensis. Telah didokumentasikan dalam Farmakope Cina sebagai sumber otentik Cistanches Herba (nama Cina: Roucongrong) dari edisi 2005 [3]. Penelitian farmakologi modern pada spesies Cistanche dimulai pada 1980-an [4]. Penyelidikan farmakologis menunjukkan bahwa ekstrak tanaman Cistanche memiliki spektrum aktivitas yang luas, seperti menyembuhkan defisiensi ginjal dan konstipasi pikun, meningkatkan kemampuan belajar dan menghafal, penyakit anti-Alzheimer, meningkatkan kekebalan, anti-penuaan, anti-kelelahan, dll. [1,5–7]. Dalam tiga dekade terakhir, studi farmakologis yang komprehensif dan sistematis telah dikombinasikan dengan penyelidikan fitokimia untuk menjelaskan bahan dasar efek menguntungkan dari akar tanaman Cistanche. Survei ini menunjukkan bahwa glikosida fenilethanoid (PhGs) adalah komponen efektif utama dalam tanaman Cistanche memainkan peran kunci untuk pengobatan defisiensi ginjal, impotensi [8], anti-penuaan [9], dan penyakit anti-Alzheimer [10]. Isi dua PhG (echinacoside dan verbascoside) diperlukan dalam Farmakope Cina. Sementara itu, karbohidrat seperti manitol, sukrosa, glukosa dan fruktosa pada tanaman Cistanche memiliki fungsi pencahar dan gugus karbohidrat tanaman Cistanche telah digunakan untuk pengobatan sembelit [11].

Sumber daya alam liarCistanche tubulosaterutama didistribusikan di daerah sekitar Gurun Taklamakan di Daerah Otonomi Xinjiang selatan di Cina. Serupa dengan banyak spesies lain yang digunakan sebagai obat tradisional Cina (TCM), C. tubulosa memiliki nilai ekonomi yang besar dan hampir punah di habitat liarnya karena pengumpulan yang berlebihan. Budidaya C. tubulosa dimulai pada 1990-an di Cina untuk memastikan pasokan bahan baku untuk Cistanches Herba serta melindungi sumber daya tanaman liar. Pada 2017, hampir 13 ribu ha C. tubulosa yang dibudidayakan ada di Prefektur Hotan di Xinjiang [12,13]. Kemajuan teknologi penanaman menuntut perluasan budidaya serta peningkatan kualitasCistanche tubulosa.

Tujuan utama berkultivasiCistanche tubulosaadalah untuk menghasilkan Cistanches Herba, yang kaya akan komponen-komponen yang efektif. Namun, kandungan komponen efektif dalam Cistanches Herba, seperti PhGs dan oligosakarida, dapat dipengaruhi secara signifikan oleh banyak faktor selama produksi [12,13]. Sebuah sistem deteksi real-time kualitas C. tubulosa harus dieksplorasi. Oleh karena itu, perlu dikembangkan metode throughput yang tinggi untuk memenuhi kebutuhan menganalisis sejumlah besar sampel dalam waktu singkat. Secara tradisional, penentuan komponen utama yang efektif, seperti PhG dan karbohidrat, dalam C. tubulosa biasanya dicapai dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) [14,15]. Meskipun akurat dan dapat diandalkan, ini memakan waktu dan melelahkan untuk pengumpulan dan pemrosesan data. Selain itu, banyak waktu dan usaha juga diperlukan untuk preparasi sampel yang biasanya melibatkan penghancuran, ekstraksi, dan filtrasi, dari pengujian HPLC. Oleh karena itu, diperlukan prinsip yang jelas dan alat yang mudah dioperasikan untuk mendapatkan jumlah data yang relatif besar. Untungnya, spektroskopi inframerah-dekat (NIRS) telah banyak digunakan untuk menilai produk pertanian [16], makanan [17], sampel medis [18], dan produk farmasi [19] karena cepat dan tidak merusak. Oleh karena itu, NIRS dapat secara tepat sesuai dengan persyaratan untuk pengukuran TCM yang efisien, dan tidak mengherankan bahwa NIRS telah diterapkan untuk identifikasi kualitatif [20,21] dan kuantifikasi senyawa [22] dalam TCM.

Dalam penelitian ini, kandungan enam komponen efektif, termasuk echinacoside, verbascoside, manitol, sukrosa, glukosa, dan fruktosa dalam 116 batch sampel C. tubulosa yang dikumpulkan dari Prefektur Hotan di Xinjiang antara tahun 2013–2015 ditentukan terlebih dahulu dengan HPLC. Selanjutnya, model kalibrasi keenam komponen tersebut dibuat dengan metode regresi kuadrat terkecil parsial (PLSR). Model-model ini kemudian divalidasi dengan koefisien korelasi dan kesalahan prediksi dalam set kalibrasi. Hasilnya menunjukkan bahwa metode yang dikembangkan dapat digunakan sebagai metode yang dapat diandalkan untuk analisis kuantitatif C. tubulosa.

Hasil

Analisis HPLC

Isi echinacoside dan verbascoside ditentukan dengan metode HPLC-UV yang terdefinisi dengan baik dalam literatur [3,23] dan empat karbohidrat (manitol, sukrosa, glukosa, dan fruktosa) ditentukan dengan metode HPLC-ELSD yang terdefinisi dengan baik di literatur [24] untuk semua 116 sampel. Persiapan sampel dan metode penentuan dijelaskan dalam Bagian 3.1 dan 3.3. Gambar 1 menunjukkan kromatogram karakteristik dari standar campuran. Dapat dilihat bahwa keenam komponen efektif dipisahkan dari dasar dan oleh karena itu dapat dikuantifikasi. Metode HPLC divalidasi sebelum pengujian sampel. Hasil utama dari metode HPLC tercantum dalam Tabel 1. Hubungan linier yang menguntungkan (r=0,9998) dan pemulihan (98,5 persen ) dari metode penentuan echinacosida ditunjukkan dalam hasil, hasil yang sama seperti semua lima komponen. Oleh karena itu, isi dari enam komponen efektif dapat ditentukan secara akurat. Semua rentang konten yang ditentukan dirangkum dalam Tabel 1.

Analisis NIRS

Gambar 2 menunjukkan spektrum NIR (4000–10,000 cm−1 ) dari sampel C. tubulosa. Puncak serapan yang signifikan muncul dari 4000 cm-1 hingga 7500 cm-1 di semua sampel, sementara fluktuasi lembut muncul dari 7500 cm-1 hingga 10.000 cm-1. Penyimpangan dasar dari spektrum NIR terjadi karena sampel mudah dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel dan warna (Gambar 2A). Pretreatment matematis dari spektrum digunakan untuk mengurangi pengaruh informasi yang tidak perlu sampai tingkat tertentu. Pretreatment matematis meliputi derivasi pertama (turunan pertama), derivasi kedua (turunan kedua), variasi normal standar (SNV) dan koreksi pencar multiplikasi (MSC). Gambar 2B menunjukkan turunan ke-2 dari spektrum NIR C. tubulosa, dan variasi signifikan yang terjadi dari tiga wilayah, 4000–4500 cm−1, 5000–5500 cm−1, dan 7000–7500 cm−1, terlihat jelas .

Pembentukan Model Kalibrasi Kuantitatif

Regresi kuadrat terkecil parsial (PLSR) adalah metode pemodelan klasik dan telah banyak diterapkan dalam model kuantitatif karena kualitas hasilnya yang tinggi. Keuntungan dari PLSR termasuk kemampuan peramalan yang baik dan kesederhanaan relatif. PLSR juga telah banyak diterapkan dalam pembentukan model kalibrasi kuantitatif TCM [25]. Berdasarkan spektrum NIR pra-perlakuan, dan model analisis kuantitatif NIR untuk enam komponen efektif dalam C. tubulosa ditetapkan menggunakan metode PLSR dengan data analisis HPLC sebagai nilai sebenarnya. 116 sampel secara acak dibagi menjadi set kalibrasi dan validasi dengan rasio 3:1. Kondisi yang paling cocok untuk kalibrasi dipilih dengan RMSEC rendah dan koefisien korelasi tinggi.

Pemilihan Pita Gelombang untuk Model Kalibrasi

Pemilihan pita gelombang yang sesuai merupakan langkah penting untuk membangun model kalibrasi. Dalam studi ini, spektrum interval NIR dari 4000–7500 cm-1 (direkomendasikan oleh perangkat lunak analis TQ) dan 4000–10.000 cm-1 dibandingkan. Diamati bahwa kisaran ini tidak cocok untuk kalibrasi pada interval antara 4000 cm-1 dan 7500 cm-1 dari Tabel 2. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, interval spektral untuk enam konstituen kimia adalah semua dipilih dari interval 4000 hingga 10.000 cm-1 dengan membandingkan kinerja RMSEC dan koefisien korelasi.

Pemilihan Jumlah Faktor Optimal untuk Model Kalibrasi

PLSR menjelaskan jumlah maksimum variabilitas dalam data dengan mengurangi dimensi data spektrum dengan perhitungan faktor. Masalah "kekurangan" muncul karena informasi yang tidak memadai yang dihasilkan dari sejumlah faktor yang terbatas; namun, memilih faktor yang lebih besar dari nilai optimal yang diperkenalkan dalam model akan menimbulkan masalah "kelebihan kecocokan". Baik "kekurangan" atau "kelebihan" akan mengurangi kekuatan prediksi model yang sudah ada [22]. Gambar 3 menunjukkan hubungan antara RMSECV dan faktor untuk keenam senyawa. Oleh karena itu, kami memilih faktor-faktor yang sesuai dengan nilai RMSECV terendah. Pemilihan faktor yang optimal untuk model kalibrasi tercantum dalam Tabel 3.

Pemilihan Pretreatment Spektral untuk Model Kalibrasi

Faktor lain yang berpengaruh paling penting untuk model kalibrasi adalah pretreatment spektral yang ditujukan untuk mengurangi pengaruh hamburan dan penyimpangan baseline, meningkatkan rasio signal-to-noise, dan menghilangkan variasi yang tidak teratur. Koreksi hamburan multiplikasi (MSC) dan metode standar normal variate (SNV) digunakan untuk menghilangkan pengaruh hamburan radiasi biasa. Untuk mengatasi efek penyimpangan dasar, spektrum turunan 1 dan 2 dibandingkan dan derivasi ke-2 dipilih [26]. Untuk efek yang diinginkan, kami menghaluskan spektrum dengan algoritma filter Savitzky-Golay (SG) sebelum derivasi untuk mencegah pembesaran noise. Tabel 3 menunjukkan informasi tentang pretreatment spektral dan hasilnya untuk model kalibrasi.

Evaluasi Model yang Ditetapkan

Model kalibrasi NIRS yang baik harus memiliki nilai RMSEC dan RMSEP yang rendah, serta koefisien korelasi yang tinggi (r) dan perbedaan kecil antara RMSEC dan RMSEP [27-29]. Model kalibrasi dari enam senyawa yang dipilih ditetapkan sesuai dengan prosedur yang disebutkan di atas (Tabel 3). Nilai RMSEC dan r untuk set kalibrasi echinacosida masing-masing adalah 27,6 dan 0,9808. Parameter kinerja model senyawa kimia lainnya tercantum dalam Tabel 3, dari mana kita dapat menyimpulkan bahwa model yang ditetapkan menghasilkan hasil prediksi yang memuaskan, dan dapat digunakan untuk analisis kuantitatif cepat C. tubulosa. Plot pencar enam senyawa kimia ditunjukkan pada Gambar 4 untuk membuat model kalibrasi lebih deskriptif dan diamati secara visual. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4, perbedaan kecil terjadi antara nilai prediksi dan terukur, karena sebagian besar titik didistribusikan di sekitar kurva regresif dengan persamaan sebagai y=x. Oleh karena itu, kinerja prediksi yang sangat baik diamati pada Gambar 4.

Bahan dan metode

Persiapan Sampel

Seratus enam belas sampel C. tubulosa dikumpulkan dari Prefektur Hotan di wilayah otonomi Xinjiang dari 2013 hingga 2015. Semua sampel dibudidayakan, tetapi dikumpulkan pada tahap pertumbuhan yang berbeda. Berat segar sampel berkisar antara 20 g sampai 1000 g. Setelah dijemur, sampel yang sudah kering digerus dan diayak dengan ayakan 60-mesh [3,23].

Pengumpulan Data Spektroskopi NIR

Spektrum NIR sampel dikumpulkan pada interval 8 cm-1 di atas wilayah spektral 4000–10.000 cm-1 dengan Sistem Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Madison, WI, USA) dilengkapi dengan adaptor pemantulan serat optik genggam. Setiap spektrum diperoleh dengan rata-rata 64 scan. Semua sampel dibiarkan untuk menyeimbangkan suhu kamar (25. C) sebelum pemindaian spektrum NIR untuk memastikan bahwa sampel dianalisis pada suhu yang sama. Kelembaban di laboratorium dijaga pada tingkat sekitar.

Pengumpulan Data HPLC

Persiapan Ekstraksi

Satu gram bubuk C. tubulosa diekstraksi dengan 50 mL metanol 50 persen dalam labu berbentuk kerucut dengan ultrasonikasi (500 W, 40 kHz) selama 30 menit. Ekstrak disimpan pada suhu 4 C. Supernatan ekstrak disaring untuk mendapatkan sampel untuk analisis HPLC [3,23].

Penentuan Echinacosida dan Verbascoside Secara Simultan dengan HPLC-UV

Analisis kromatografi cair dilakukan pada sistem UHPLC Shimadzu (Shimadzu, Kyoto, Jepang) yang terdiri dari dua unit pengiriman pelarut LC-20ADXR, pompa LC-20AD, sampel SIL-20ACXRauto , oven kolom CTO-20AC, detektor DAD SPD-M20A, degasser DGU-20A3R, dan pengontrol ICBM-20A.

Kolom Grace Prevail Carbohydrate ES (150 × 2,1 mm, 2,7 mm) yang digunakan untuk pemisahan kromatografi dipertahankan pada 35 C. Fase gerak terdiri dari asetonitril (A) dan 0.1 persen asam format berair (B) dan diberikan mengikuti program gradien sebagai berikut: 0–7 menit, gradien linier 10-20 persen A; 7–15 menit, 20 persen A; dan 15-20 menit, gradien linier 20-10 persen A. Kecepatan sesama fase gerak adalah 0,4 mL/menit. Pemantauan UV dilakukan pada 330 nm.

Penentuan Manitol, Sukrosa, Glukosa, dan Fruktosa Secara Simultan dengan HPLC-ELSD

HPLC dilakukan pada sistem LC seri Agilent 1100 (Palo Alto, CA, USA) yang terdiri dari degasser aG1322A, pompa kuaterner G1311A, autosampler G1311A, pengontrol suhu kolom G1316A, dan detektor DAD G1315B.

Kolom ES Sigma Prevail Carbohydrate (4,6 × 250 mm, 5 m) digunakan untuk pemisahan kromatografi dan dipertahankan pada suhu kolom 25 C. Fase gerak terdiri dari asetonitril dan air (77:23, v/v) dan sekutu isokratis disuplai dengan kecepatan 0,7 mL/menit. Efluen dipantau menggunakan evaporative light scattering detector (ELSD) dengan parameter default [23,24].

Pengolahan data

TQ Analyst (versi 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, USA) digunakan untuk melakukan pembagian set kalibrasi dan validasi, perlakuan awal matematis spektrum, penetapan model kalibrasi, dan perhitungan lainnya. Origin (versi 9.1) digunakan untuk membuat angka.

Kesimpulan

Ucapan Terima Kasih: Karya ini didukung oleh Proyek Perencanaan Sains dan Teknologi Nasional China (2015BAD29B00-04).

Kontribusi Penulis: Xinhong Wang menyusun dan merancang eksperimen. Xinhong Wang dan Xiaoguang Wang melakukan eksperimen. Xinhong Wang dan Yuhai Guo menulis koran.

Benturan Kepentingan: Para penulis menyatakan bahwa tidak ada benturan kepentingan.

Referensi

1. Jiang, Y.; Tu, PF Analisis konstituen kimia dalam spesies cistanche. J. Kromatografi. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]

2. Xu, R.; Chen, J.; Chen, S.-L.; Liu, T.-N.; Zhu, W.-C.; Xu, J. Cistanche deserticola Ma dibudidayakan sebagai tanaman baru di Cina. gen. sumber daya. Tanaman Evol. 2008, 56, 137-142. [CrossRef]

3. Penyuntingan Komite Farmakope Tiongkok. Farmakope Cina, edisi 2005; Pers Industri Kimia: Beijing, Cina, 2005; Jilid 1, hal. 90.

4. Kobayashi, H.; Komatsu, J. Konstituen herba cistanchE (1). Yakugaku Zasshi 1983, 103, 508–511. [CrossRef] [PubMed]

5. Lagu, ZH; Lei, L.; Tu, PF Kemajuan dalam penelitian aktivitas farmakologi pada tanaman cistanche terengah-engah. dll. Dagu. Tradisi. Herba. Narkoba 2003, 34, 473–476.

6. Xiong, T.; Kadota, S.; Tani, T.; Namba, T. Efek antioksidan fenilethanoid dari Cistanche deserticola. Biol. Farmasi. Banteng. 1996, 19, 1580–1585. [CrossRef] [PubMed]

7. Xuan, GD; Liu, CQ Penelitian tentang efek glikosida fenilethanoid (PEG) dari Cistanche deserticola pada anti-penuaan pada tikus tua yang diinduksi oleh D-galaktosa. J.Cin. Med. ibu. 2008, 31, 1385–1388.

8. Sato, T.; Kozima, S.; Kobayashi, K.; Kobayashi, H. Studi farmakologi pada Cistanchis Herba. I. Pengaruh konstituen Cistanchis Herba pada seks dan perilaku belajar pada tikus kronis stres. Yakugaku Zasshi 1986, 105, 1131-1144. [CrossRef]

9. Shen, CY; Jiang, JG; Yang, L.; Wang, DW; Zhu, W. Bahan aktif anti-penuaan dari herbal dan nutraceuticals yang digunakan dalam pengobatan tradisional Tiongkok: mekanisme farmakologis dan implikasinya terhadap penemuan obat. sdr. J. Farmakol. 2016, 11, 1395–1425. [CrossRef] [PubMed]

10. Li, N.; Wang, J.; Bu, J.; Gu, Z.; Jiang, C.; Yu, L.; Fu, X. Efek Neuroprotektif Terapi Herba Cistanches pada Pasien dengan Penyakit Alzheimer Sedang. jelas. Komplemen Berbasis. Alternatif Med. 2015, 2015. [CrossRef] [PubMed]

11. Gao, JY; Jiang, Y.; Dai, F.; Han, ZL; Liu, HY; Bao, Z.; Zhang, TM; Tu, PF Studi Konstituen pencahar di Cistanche deserticola YC Ma. Mod. Dagu. Med. 2015, 17, 307–310.

12. Tu, PF; Chen, QL; Jiang, Y.; Guo, YH; Yang, TX; Wang, XY; Aierkan, M.; Li, XB; Du, Y.; Nan, ZD; dkk. Teknik budidaya Cistanche tubulosa dan inangnya Tamarix spp. Mod. Dagu. Med. 2015, 17, 349–358.

13. Tu, PF; Jiang, Y.; Guo, YH; Tian, ​​YZ; Li, XB; Wang, XY; Wei, J.; Chen, QL; Aierkan, M. Mengembangkan industri ekologi herba cistanches untuk memajukan peradaban ekologis kawasan gurun barat. Mod. Dagu. Med. 2015, 17, 297–301.

14. Lu, DY; Zhang, JY; Yang, ZY; Liu, HM; Li, S.; Wu, BJ; Ma, ZG Analisis kuantitatif herba cistanches menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi yang digabungkan dengan deteksi susunan dioda dan spektrometri massa resolusi tinggi yang dikombinasikan dengan metode kemometrik. J.Sep.Sci. 2013, 36, 1945-1952. [CrossRef] [PubMed]Molecules 2017, 22, 843 9 dari 9

15. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Diferensiasi herba cistanches dengan sidik jari dengan kinerja tinggi kromatografi cair-dioda array deteksi-spektrometri massa. J. Kromatografi. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]

    ---