Peroksidasi Lipid Lisosom Mengatur Imunitas Tumor

Penghambatan lisosom yang ditimbulkan oleh inhibitor palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1) seperti DC661 dapat menyebabkan kematian sel, tetapi mekanismenya belum sepenuhnya dipahami. Jalur kematian sel yang terprogram (autophagy, apoptosis, necroptosis, ferroptosis, dan pyroptosis) tidak diperlukan untuk mencapai efek sitotoksik DC661. Penghambatan cathepsin, atau khelasi besi atau kalsium, tidak menyelamatkan sitotoksisitas yang disebabkan oleh DC661-. Penghambatan PPT1 menginduksi peroksidasi lipid lisosom (LLP), yang menyebabkan permeabilisasi membran lisosom dan kematian sel yang dapat dibalikkan oleh antioksidan N-asetilsistein (NAC) tetapi tidak oleh antioksidan peroksidasi lipid lainnya. Transporter sistein lisosom MFSD12 diperlukan untuk transportasi NAC intralysosomal dan penyelamatan LLP. Penghambatan PPT1 menghasilkan imunogenisitas intrinsik sel dengan ekspresi permukaan calreticulin yang hanya dapat dibalik dengan NAC. Sel yang diberi perlakuan DC661-membuat sel T naif menjadi prima dan meningkatkan toksisitas yang dimediasi sel T. Tikus yang divaksinasi dengan sel yang diobati dengan DC661-menimbulkan kekebalan adaptif dan penolakan tumor pada tumor "imun panas" namun tidak pada tumor "imun dingin". Temuan ini menunjukkan bahwa LLP mendorong kematian sel lisosom, suatu bentuk kematian sel imunogenik yang unik, menunjukkan jalan menuju kombinasi rasional antara imunoterapi dan penghambatan lisosom yang dapat diuji dalam uji klinis.

Manfaat cistanche tubulosa-Antitumor

Perkenalan

Dengan aktivitas yang menggembirakan dalam uji klinis yang melibatkan inhibitor lisosomal hidroksiklorokuin (HCQ) (1), identifikasi protein palmitoyl thioesterase 1 (PPT1) sebagai target molekuler turunan klorokuin (2), dan peluncuran inhibitor PPT1 baru ke dalam uji klinis percobaan (3, 4), terdapat kebutuhan untuk memahami mekanisme dimana inhibitor lisosom menginduksi kematian sel dan efek penghambatan lisosom pada kekebalan tumor. Mekanisme kanonik kematian sel lisosom yang dijelaskan untuk HCQ melibatkan permeabilisasi membran lisosom (LMP), kebocoran cathepsin, dan aktivasi apoptosis yang dimediasi caspase (5, 6). Kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa inhibitor lisosom DC661 menembus sel-sel dalam lingkungan mikro tumor yang bersifat asam dan melokalisasi ke lisosom lebih efisien daripada HCQ (2, 7). DC661 menghasilkan kematian sel yang kuat di banyak lini sel kanker (2). DC661 mengikat dan menghambat PPT1, menghilangkan asam lisosom, dan menghambat autophagy. DC661 juga menginduksi LMP dan meningkatkan kadar caspase 3 yang terpecah (2, 7). Dalam beberapa tahun terakhir, mekanisme baru kematian sel yang mempunyai konsekuensi imunogenik telah didefinisikan dan mencakup nekroptosis, ferroptosis, dan piroptosis (8). Autophagy yang bergantung pada lisosom telah terbukti menurunkan MHC kelas I (9), serta komponen imunoproteasome (10), menunjukkan bahwa penghambatan autophagy dapat meningkatkan pemrosesan antigen. Namun, efek imunogenik dari penghambatan lisosom dan kematian sel belum sepenuhnya diketahui. Untuk mengatasi kesenjangan pengetahuan ini, kami menyelidiki efek DC661 pada mekanisme kematian sel kanonik untuk menentukan apakah kematian sel lisosom adalah bentuk kematian sel atau sekadar pendahulu dari salah satu mekanisme lain yang sudah ada. Kami menemukan bahwa HCQ dan DC661 menginduksi peningkatan signifikan hanya pada sejumlah kecil protein dalam proteom melanoma dan sebagian besar adalah protein terkait autophagy dan apoptosis. Inhibitor kematian sel terprogram (apoptosis, nekroptosis, ferroptosis, dan piroptosis) tidak mengurangi efek sitotoksik setelah kerusakan lisosom oleh DC661. Peroksidasi lipid lisosom (LLP) adalah pendorong utama kematian sel yang diinduksi LMP terkait dengan ekspresi calreticulin (CALR) pada permukaan sel. Bentuk kematian sel ini hanya dapat dibalik dengan menggunakan antioksidan N-acetylcysteine ​​(NAC). Aktivitas NAC terganggu oleh penghambatan importir sistein lisosom MFSD12. LLP menimbulkan fenotip imunogenik yang mendorong pembunuhan yang dimediasi sel T. Temuan ini menunjukkan bahwa kematian sel lisosom merupakan bentuk unik dari kematian sel imunogenik.

tanaman cistanche meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Hasil

Penghambatan lisosom menginduksi perubahan signifikan pada proteom yang terkait dengan autophagy dan apoptosis. Untuk mengetahui efek sitotoksik dari penghambat lisosom, kami menilai kelangsungan hidup melanoma A375P, karsinoma usus besar RKO, dan garis sel kanker pankreas MIA PaCa-2 yang diobati dengan penghambat vakuolar H+-ATPase bafilomycin-A1 (1 {{52}0 nM); Inhibitor PPT1 DC661 (3 μM) atau HCQ (10 μM atau 30 μM); palmitat mimesis heksadesil sulfonil fluorida (HDSF; 60 μM); inhibitor cathepsin pepstatin A (PepA; 10 ug/mL), E64 (PepA; 10 ug/mL), atau PepA+E64; dan pengganggu membran lisosom Leu-Leu metil ester hidrobromida (20 μM) selama 48 jam. Hanya bafilomycin-A1 dan DC661 yang menyebabkan penurunan viabilitas sel secara signifikan di seluruh lini sel kanker (Gambar 1A dan Gambar Tambahan 1A; materi tambahan tersedia online dengan artikel ini; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), dengan produksi DC661 penurunan viabilitas sel yang lebih besar dibandingkan bafilomycin-A1. Berdasarkan data ini dan sifat farmakologis turunan klorokuin, kami memfokuskan penelitian kami pada turunan klorokuin sebagai alat untuk memahami kematian sel lisosom. Analisis proteom global yang tidak memihak diterapkan pada sel melanoma A375P yang diobati dengan DC661 (3 μM) atau HCQ yang kurang kuat (10 μM atau 30 μM) selama 24 jam. Dari 4.264 protein terkuantifikasi dengan tingkat kepercayaan tinggi, hanya 87 dan 55 protein yang meningkat secara signifikan dengan DC661 (3 μM) dan HCQ (30 μM), masing-masing; selain itu, 14 dan 15 protein menurun secara signifikan dengan DC661 (3 μM) dan HCQ (30 μM), masing-masing (perubahan lipatan absolut lebih besar dari 2; q <0,05) dengan DC661 (3 μM) atau HCQ (30 μM), masing-masing , jika dibandingkan dengan pengendalian kendaraan. Dosis HCQ yang lebih rendah (10 μM) tidak menunjukkan perubahan protein yang signifikan dibandingkan dengan kontrol kendaraan. 50 protein teratas yang meningkat secara signifikan setelah pengobatan DC661 terutama terkait dengan autophagy dan apoptosis, dan perubahan serupa diamati untuk dosis HCQ yang lebih tinggi (Gambar 1B). Karena alasan ini, kami memilih untuk memfokuskan penelitian lebih lanjut pada DC661 yang lebih kuat. Contoh dari beberapa perubahan protein terbesar yang terkait dengan autophagy dan apoptosis adalah protein pengikat pajak 1 (TAX1BP1; meningkat 15-kali lipat); BCL2-protein berinteraksi 3 (BNIP3; meningkat 6-kali lipat); tetangga protein gen 1 BRCA1 (NBR1; meningkat 12-kali lipat); sequestosome-1 (SQSTM1/p62; meningkat 5-kali lipat); koaktivator reseptor nuklir 4 (NCOA4; meningkat 3-kali lipat); dan LC3B (MAP1LC3B; meningkat 3-kali lipat). Apolipoprotein B-100 (APOB; meningkat 66-kali lipat) berasal dari serum janin anak sapi dan tidak diteliti lebih lanjut. Immunoblotting mengkonfirmasi bahwa pengobatan dengan DC661 atau konsentrasi HCQ yang lebih tinggi menghasilkan peningkatan yang nyata dalam ekspresi reseptor muatan autophagy NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62, dan NCOA4 dengan cara yang bergantung pada dosis dan waktu (Gambar Tambahan 1, B dan C). CRISPR/Cas9 KO dari PPT1 dalam sel A375P melakukan fenokopi efek DC661 pada protein ini bila dibandingkan dengan rekan WT mereka (Gambar Tambahan 1D). Namun, ekspresi reseptor muatan autophagy dan peningkatan relatif yang disebabkan oleh pengobatan DC661 bervariasi pada kanker usus besar, kanker pankreas, dan garis sel melanoma lainnya di mana DC661 menunjukkan sitotoksisitas (Gambar Tambahan 1E). Hal ini menunjukkan bahwa reseptor muatan autophagy itu sendiri, meskipun meningkat pada tingkat protein, tidak mungkin bertanggung jawab atas kematian sel setelah pengobatan DC661. Untuk mengkonfirmasi hal ini, kami fokus pada reseptor muatan autophagy TAX1BP1 dan BNIP3 karena mereka telah mengetahui efek proapoptosis pada sel kanker (Gambar 1C). TAX1BP1 adalah adaptor muatan autophagy (11) dan juga mengatur apoptosis yang disebabkan oleh inhibitor sintesis protein atau agen perusak DNA dalam sel kanker (12). Knockdown TAX1BP1 oleh siRNA (Gambar 1D) tidak memengaruhi sitotoksisitas yang diinduksi DC661-dalam pengujian viabilitas jangka pendek (Gambar 1E) dan jangka panjang (Gambar 1F). Hasil ini menunjukkan bahwa TAX1BP1 tidak memainkan peran penting dalam sitotoksisitas yang dimediasi DC. BNIP3 adalah protein proapoptosis yang merusak bioenergi mitokondria dan mengatur mitofag (13). Penghancuran efektif BNIP3 (Gambar 1G) tidak memengaruhi sitotoksisitas yang diinduksi DC{131}}(Gambar 1, H, dan I). Hasil ini menunjukkan bahwa efek sitotoksik DC661 tidak tergantung pada ekspresi BNIP3. Selanjutnya, kami mempelajari efek menipisnya sel gen autophagy kanonik yang diperlukan untuk produksi autophagosome pada kemanjuran DC661 dengan merobohkan unc-51 seperti autophagy activating kinase 1 (ULK1) dan autophagy-related gene 7 (ATG7). Knockdown efektif ULK1 atau ATG7 (Gambar Tambahan 2, A dan B) menghambat fluks autofagik (Gambar Tambahan 2C) tetapi tidak mempengaruhi sitotoksisitas yang diinduksi DC{146}}(Gambar 1, J–M). Hasil ini menunjukkan bahwa tidak adanya mesin autophagy inti yang penting tidak menghilangkan efek sitotoksik DC661. Penghambatan lisosom oleh DC661 menginduksi beberapa jalur kematian sel yang terprogram. Sudut pandang kanonik adalah bahwa kematian sel lisosom disebabkan oleh apoptosis (5). Immunoblotting mengungkapkan bahwa pengobatan DC661 menghasilkan aktivasi caspase-3, -7, dan -9 serta pembelahan PARP-1, yang mengonfirmasi bahwa DC661 mengaktifkan apoptosis (Gambar 2A). Inhibitor pan-caspase Z-VAD-FMK mencegah aktivasi caspase oleh DC661 tetapi tidak menghambat akumulasi LC3B dan p62, menunjukkan bahwa aktivasi apoptosis dan blokade autophagy dapat dipisahkan setelah penghambatan lisosom (Gambar 2B). Memblokir apoptosis dengan ZVAD-FMK tidak meningkatkan atau membatasi sitotoksisitas DC661, menunjukkan bahwa apoptosis dapat diabaikan untuk kematian sel lisosom (Gambar 2, C, dan D). Efek sitotoksik DC661 serupa pada sel sumsum tulang primer Bax/Bak double-KO yang tidak mampu menjalani apoptosis dan sel WT (Gambar 2E). Blokade apoptosis tidak memengaruhi sitotoksisitas yang diinduksi DC pada kanker usus besar dan sel kanker pankreas (Gambar Tambahan 2, D–F). Karena kami menemukan bahwa apoptosis dapat diabaikan untuk kematian sel yang diinduksi DC{173}}, kami menyelidiki apakah DC661 menginduksi nekroptosis, bentuk lain dari kematian sel terprogram yang diatur oleh protein kinase yang berinteraksi dengan reseptor (RIPK) dan protein mirip domain garis keturunan kinase campuran ( MLKL). Tingkat bentuk RIPK dan MLKL terfosforilasi dan teraktivasi meningkat setelah pengobatan DC661 dari 0,1-1 μM (Gambar 2F). Pada 3 μM DC661 tidak terdapat RIPK1 terfosforilasi tetapi MLKL terfosforilasi persisten, menunjukkan bahwa, pada konsentrasi yang lebih tinggi ini, bentuk kematian sel tambahan dapat terjadi. Perlakuan awal dengan penghambat RIPK1 necrostatin-1 atau necrostatin-1s atau penghambat MLKL nekrosulfonamida mencegah fosforilasi RIPK1 setelah pengobatan DC661 (1 μM) dalam sel melanoma (Gambar 2G) tetapi gagal menyelamatkan DC{{192 }}menginduksi sitotoksisitas pada sel melanoma (Gambar 2H) atau sel kanker usus besar atau kanker pankreas (Gambar Tambahan 2G). Temuan ini menunjukkan bahwa nekroptosis diaktifkan tetapi tidak dapat menyebabkan kematian sel yang dimediasi DC.

Gambar 1. Penghambatan autophagy lisosom menginduksi perubahan signifikan pada apoptosis dan protein autophagy. (A)

Lisosom adalah salah satu tempat penyimpanan utama zat besi. Metabolisme zat besi intraseluler yang tidak teratur ditambah dengan penurunan kapasitas reduktif dapat memicu kematian sel nonapoptosis yang dikenal sebagai ferroptosis. Ciri khas ferroptosis adalah peningkatan regulasi prostaglandin-endoperoksida sintase 2 (PTGS2), pengatur transpor kation homolog 1 (CHAC1), dan sisteinil-tRNA sintetase (CARS) (14). Ketiga penanda ferroptosis ini diregulasi secara transkripsi dengan pengobatan DC661 (Gambar 3A), menunjukkan bahwa penghambatan lisosom menginduksi ferroptosis. DC661 menginduksi pergeseran fluoresensi pada sel A375P yang diobati dengan C11-BODIPY, menunjukkan peroksidasi lipid, karakteristik ferroptosis. Pergeseran yang diinduksi DC661-ini secara signifikan dibalik dengan adanya ferroptosis inhibitor ferrostatin-1 atau lip roxstatin-1 yang diberikan pada konsentrasi efektif (Gambar 3B dan Gambar Tambahan 3A), yang selanjutnya menunjukkan bahwa DC661 ferroptosis yang diinduksi. Namun, penghambatan ferroptosis tidak menyelamatkan sitotoksisitas yang terkait dengan DC661 (Gambar 3, C dan D). Pengobatan bersama sel kanker dengan iron chelator deferoxamine (DFO) dan DC661 tidak menyelamatkan sitotoksisitas DC661 (Gambar 3E). Pengobatan dengan ferrostatin-1, lip roxstatin-1, atau DFO tidak menyelamatkan penghambatan DC661 terhadap kelangsungan hidup jangka pendek atau pertumbuhan klonogenik jangka panjang pada sel kanker melanoma, usus besar, dan pankreas (Gambar Tambahan 3, B –E, dan Gambar Tambahan 4, A–D). Data ini menunjukkan bahwa ferroptosis diaktifkan tetapi dapat diabaikan karena kematian sel yang dimediasi DC. Piroptosis adalah bentuk kematian sel terprogram yang terkait dengan respons inflamasi yang melibatkan aktivasi kaspase yang memproses gastrin (GSDM), yang memungkinkan pembentukan pori pada membran plasma dan selanjutnya pelepasan pola molekul terkait kerusakan, seperti mobilitas tinggi. kotak grup 1 (HMGB1). Perawatan DC661 pada beberapa lini sel melanoma (A375P, A375, WM35, dan WM793) menghasilkan aktivasi inisiator caspase-8 dan -9 dan algojo caspase-7, khas untuk piroptosis, dan menghasilkan pembelahan GSDME full-length, serupa dengan penginduksi piroptosis yang diketahui PLX4720 dan PD0325901 (Gambar Tambahan 5A). DC661 menghasilkan pelepasan HMGB1 ekstraseluler yang lebih kuat daripada penghambat piroptosis, BRAF, dan penghambatan MEK yang diketahui dalam 1% FBS (15), yang mencerminkan konsekuensi fungsional dari piroptosis teraktivasi. Selanjutnya, kami menguji apakah penghambatan piroptosis oleh GSDME KO akan memperbaiki efek sitotoksik DC661. Pengobatan DC661 menginduksi akumulasi LC3II dan SQSTM1/p62 dan aktivasi caspase, tetapi pelepasan HMGB1 hampir sepenuhnya dibatalkan dalam sel manusia GSDME-KO WM35, menunjukkan bahwa konsekuensi fungsional dari penghambatan piroptosis telah tercapai (Gambar 3F). Namun, pengobatan DC661 menghasilkan sitotoksisitas yang sama pada YUMM1.7 WT, vektor kosong (EV), dan sel Gsdme KO1 dan KO2 dalam kondisi FBS 10% dan 1% (Gambar 3G dan Gambar Tambahan 5B). Salah satu akibat umum dari berbagai bentuk kematian sel adalah pelepasan LDH. DC661 menghasilkan peningkatan pelepasan LDH yang signifikan, dan ini tidak dapat dibalikkan dengan apoptosis, nekroptosis, atau penghambatan ferroptosis (Tambahan Gambar 5C). Hasil ini menunjukkan bahwa DC661 menginduksi beberapa mode kematian sel, termasuk apoptosis dan piroptosis serta nekroptosis dan ferroptosis, namun tidak satu pun dari mode kematian sel ini diperlukan untuk kematian sel yang diinduksi DC661-. Penghambatan cathepsin atau khelasi kalsium tidak mencegah kematian sel akibat permeabilisasi membran lisosom. Setelah menunjukkan bahwa aktivasi caspase (yang diperlukan untuk apoptosis dan piroptosis) dapat diabaikan untuk kematian sel yang diinduksi DC661-, kami berhipotesis bahwa pelepasan cathepsin dari lisosom dapat menyebabkan kematian sel yang bergantung pada caspase. Penghambatan kimia (DC661) atau genetik (PPT1 siRNA [siPPT1]) terhadap PPT1 menghasilkan permeabilisasi membran lisosom (LMP), sedangkan HDSF, penghambat PPT1 ireversibel yang kurang kuat dan cepat habis dalam kultur sel, tidak dapat menginduksi LMP, sebagaimana diukur oleh galectin-3–puncta positif (Gambar 4A). LMP menghasilkan pelepasan cathepsin dan isi lisosom lainnya ke dalam sitoplasma dan dianggap sebagai ciri proksimal utama kematian sel berbasis lisosom. LMP yang diinduksi oleh DC661 dikaitkan dengan peningkatan signifikan aktivitas cathepsin-L sitoplasma, yang secara signifikan diblokir dengan inhibitor protease sistein E64 (Gambar 4B). Laporan sebelumnya menunjukkan bahwa pelepasan cathepsin dari lisosom yang retak mendorong aktivasi caspase, yang menyebabkan kematian sel apoptosis (16-18). Penghambatan cathepsin lengkap tidak mencegah pembelahan caspase (Gambar 4C) dan tidak menyelamatkan sitotoksisitas yang diinduksi DC661- dalam uji viabilitas jangka pendek dan jangka panjang pada melanoma (Gambar 4, D dan E), kanker usus besar, dan pankreas sel kanker (Gambar Tambahan 6, A – C). Hasil ini bertentangan dengan pandangan kanonik tentang kematian sel lisosom yang didorong oleh kematian sel yang dimediasi cathepsin. Selain pelepasan cathepsin dari lisosom yang bocor, pelepasan kalsium dari lisosom juga terlibat dalam disfungsi seluler ketika PPT1 terganggu (19). Perawatan DC661 menghasilkan pelepasan kalsium secara ekstensif, yang dihilangkan dengan perlakuan awal dengan chelator kalsium permanen sel (Ca{101}}), BAPTA-AM. (Gambar 4F). Khususnya, BAPTA-AM tidak mencegah LMP yang diinduksi DC{105}}(Gambar 4G) atau pembelahan caspase (Gambar Tambahan 6, D, dan E) dan, yang paling penting, tidak menyelamatkan sitotoksisitas yang diinduksi DC{108}}( Gambar 4H). Temuan ini juga diamati pada lini sel RKO dan MIA PaCa-2, yang mana tidak ada perbedaan signifikan pada nilai IC50 yang diamati dengan BAPTA-AM dan DC661 (Gambar Tambahan 6F), yang menunjukkan bahwa kematian sel terkait LMP adalah tidak bergantung pada kalsium atau cathepsin.

Gambar 2. DC661-menginduksi apoptosis dan nekroptosis. (A)

Gambar 3. DC661-ferroptosis dan piroptosis yang diinduksi. (A)

LLP menggerakkan LMP. Setelah menetapkan bahwa penghambat jalur kematian sel utama (apoptosis, nekroptosis, ferroptosis, dan piroptosis), cathepsin (PepA dan E64), dan khelator ion (BAPTA-AM [Ca2+] dan DFO [Fe{{3} }]) tidak mencegah kematian sel oleh DC661 dan menemukan bukti peroksidasi lipid oleh C-11-BODIPY, kami melakukan analisis lipidom global pada 2 dan 4 jam setelah pengobatan DC661. DC661 menginduksi peningkatan 3- hingga 10-kali lipat secara dini dan berkelanjutan di setiap kelas lisofosfolipid (Gambar 5A). Sebaliknya, perubahan minimal atau tidak ada perubahan terlihat pada kelas fosfolipid, termasuk fosfatidilkolin, fosfatidletanolamin, fosfatidilserin, fosfatidilinositol, fosfatidilgliserol, dan asam fosfatidat (Tambahan Gambar 7A). Spesies lisofosfolipid dapat dihasilkan oleh ROS, yang mengoksidasi rantai asam lemak jenuh yang kemudian dipecah oleh fosfolipase (20). Untuk menentukan apakah antioksidan dapat mencegah kerusakan lipid yang dimediasi ROS, kami menyelidiki sitotoksisitas yang diinduksi DC661- dengan adanya N-acetylcysteine ​​(NAC) pemulung pan-ROS (21, 22) dan inhibitor peroksidasi lipid yang diduga Trolox (23 ) dan vitamin C (asam askorbat) (24, 25). Berbeda dengan agen lain yang diuji sejauh ini, pengobatan bersama dengan NAC menyelamatkan sitotoksisitas terkait DC{24}}di beberapa lini sel (Gambar 5B dan Gambar Tambahan 7B). Uji CFU jangka panjang menunjukkan bahwa NAC, tidak seperti semua inhibitor kematian sel, khelator ion, dan inhibitor cathepsin yang diuji di sini, mencegah efek sitotoksik DC661 pada sel A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10, dan MC38 ( Gambar 5C dan Gambar Tambahan 7C). Menariknya, Trolox dan vitamin C tidak menyelamatkan sitotoksisitas DC661 pada melanoma manusia, kanker kolorektal, sel kanker pankreas dan murine melanoma dan sel kanker kolorektal (Gambar 5D dan Gambar Tambahan 7, D – H). Perbedaan ini mendorong kami untuk menguji apakah NAC, Trolox, dan vitamin C mempengaruhi LMP. Hasil kami menunjukkan bahwa NAC adalah satu-satunya antioksidan yang secara signifikan mengurangi LMP yang diinduksi DC661-(Gambar 5E). Kami berhipotesis bahwa LLP mendorong produksi LMP oleh DC661, yang dapat dikembalikan oleh NAC tetapi tidak oleh Trolox dan vitamin C. Untuk mempelajari proses LLP kami menggunakan probe fluoresen FOAM-LPO (26), yang secara khusus melokalisasi ke lisosom dan menghasilkan pergeseran spektral dari 586 ke 512 nm (merah ke hijau) saat terkena lipid peroksida. Kami menemukan bahwa DC661 menginduksi LLP dibandingkan dengan kontrol (Gambar 5F). NAC mengurangi peroksidasi lipid dalam lisosom sel melanoma yang diobati dengan DC661-, sementara Trolox dan vitamin C gagal mengurangi LLP (Gambar 5F). NAC, Trolox, dan vitamin C saja tidak berpengaruh signifikan terhadap peroksidasi lipid. Knockdown PPT1 (Gambar Tambahan 8A), atau perlakuan dengan HCQ konsentrasi tinggi (Gambar Tambahan 8B) juga menginduksi LMP yang dapat dibalik oleh NAC, sedangkan penghambatan kimia ULK1 tidak menginduksi LMP (Gambar Tambahan 8C). Yang penting knockdown siPPT1 juga mencakup LLP yang dapat dibalik dengan NAC (Gambar Tambahan 8D) Hasil ini menunjukkan bahwa penghambatan PPT1 menginduksi LLP yang dapat diselamatkan oleh NAC dan kemungkinan besar menjadi penyebab LMP yang diinduksi penghambatan PPT1-. Lebih lanjut, temuan ini menunjukkan bahwa LLP sangat penting untuk kematian sel lisosom.

Tanaman cistanche ramuan Cina-Antitumor

Impor sistein ke lisosom oleh MFSD12 melemahkan kematian sel lisosom. Dari 3 inhibitor peroksidasi lipid, hanya NAC yang mencegah LLP. Sebuah laporan baru-baru ini menunjukkan bahwa domain superfamili fasilitator utama yang mengandung 12 (MFSD12) merupakan komponen penting dari pengimpor sistein untuk lisosom dan melanosom (27). Kami beralasan bahwa NAC, atau sistein metabolitnya, diangkut ke lisosom melalui MFSD12, di mana sistein dioksidasi menjadi disulfida, sistein. Untuk menguji hipotesis ini, kami membandingkan kemampuan NAC untuk menyelamatkan sitotoksisitas DC661 dalam sel siNT dan siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP. Hasil kami menunjukkan bahwa NAC menyelamatkan LMP yang diinduksi DC661-dalam sel siNT tetapi tidak menyelamatkan LMP dalam sel siMFSD12 (Gambar 6A). NAC mengurangi LLP sel DC661-yang diobati dengan siNT-A375P tetapi tidak pada sel siMFSD12. sel siMFSD12 yang diobati dengan DMSO atau NAC mengalami peningkatan LLP basal (Gambar 6B) dibandingkan dengan sel siNT. Sementara NAC menyelamatkan sitotoksisitas DC661 dalam sel siNT, kemampuan NAC untuk menyelamatkan sitotoksisitas DC661 sepenuhnya dibatalkan dalam sel siMSFD12 (Gambar 6C). Ini menunjukkan bahwa knockdown MFSD12 memblokir efek sitoprotektif NAC terhadap DC661. NAC dideasetilasi oleh asilase di sitosol (28). Untuk menentukan apakah pengobatan NAC menghasilkan akumulasi sistein atau sistin dalam lisosom, kami menggunakan teknik imunopresipitasi lisosom (Lyso-IP) (29) untuk memurnikan lisosom dari sel A375P yang diobati dengan DMSO dan NAC (Gambar 6D dan Gambar Tambahan 9A) dan dilakukan metabolomik yang ditargetkan untuk mengukur NAC dan metabolit terkait. Seperti yang diharapkan, NAC terdeteksi pada lisat sel utuh yang diberi NAC dan fraksi tidak terikat terkait. Kadar L-sistein meningkat secara substansial dalam lisosom yang diobati dengan NAC. L-sistin hanya terdeteksi dalam lisosom yang diobati dengan NAC. Yang mengejutkan, kami tidak menemukan peningkatan (penurunan) glutathione yang signifikan pada kelompok yang diobati dengan NAC (Gambar 6E); Hal ini mengejutkan karena secara umum diyakini bahwa pengobatan NAC menginduksi peningkatan produksi glutathione, mengoreksi keseimbangan redoks. Hasil ini menunjukkan bahwa sistein yang diimpor ke lisosom melalui importir MFSD12 sangat penting untuk menyelamatkan LLP, LMP, dan kematian sel lisosom. LLP bersifat imunogenik. Beberapa bentuk kematian sel teregulasi yang disebabkan oleh DC661 (piroptosis, nekroptosis, ferroptosis) telah diidentifikasi sebagai imunogenik. Sebelumnya, kematian sel imunogenik telah dijelaskan untuk obat kemoterapi berdasarkan ciri khasnya, yang meliputi tampilan pola molekuler terkait kerusakan, termasuk ekspresi CALR pada permukaan sel dan pelepasan protein HMGB1 dan adenosin trifosfat (ATP) (30). CALR bertindak sebagai sinyal "makan-aku" ketika terkena permukaan sel selama stres sel. Pelepasan HMGB1 dan ATP ekstraseluler bertindak sebagai sinyal "temukan saya" yang dikenali oleh sel fagositik. Kami membandingkan dua model: sel B16F10, yang pada model tumor syngeneic hampir seluruhnya tidak memiliki limfosit yang menginfiltrasi tumor, dan sel MC38, yang pada model tumor syngeneic memang memiliki limfosit yang menginfiltrasi tumor. Pertama, kami menunjukkan bahwa pengobatan DC661 atau siPpt1 secara signifikan menginduksi ekspresi CALR permukaan yang dapat sepenuhnya dibatalkan dengan pengobatan NAC dalam sel MC38 (Gambar 7, A, dan B). Temuan serupa diamati pada sel B16F10 (Gambar 7C). Penghambat jalur kematian sel utama (apoptosis, nekroptosis, ferroptosis, dan piroptosis) gagal mencegah ekspresi permukaan CALR (Gambar 7D). Untuk menentukan apakah kematian sel imunogenik yang disebabkan oleh DC661 disebabkan oleh peningkatan regulasi MHC kelas I, sel B16F10 dan MC38 diobati dengan DC661 (3 μM) atau DMSO selama 24 jam. Kami menemukan bahwa pengobatan DC661 tidak meningkatkan ekspresi MHC kelas I dan peningkatan regulasi imunoproteasome (Gambar 7E dan Gambar Tambahan 9, B dan C).

Gambar 4. Penghambatan cathepsin atau khelasi kalsium tidak mencegah kematian sel yang disebabkan oleh DC661-. (A)

Untuk memahami efek penghambatan autophagy pada priming sel T, kami melakukan percobaan in vitro priming dan coculture menggunakan splenosit C57BL6/J seperti yang dijelaskan sebelumnya (31). Untuk pelapisan dasar, kami mengekspos splenosit ke sel B16F10 atau MC38 yang diberi DC661- atau DMSO. Selanjutnya, splenosit prima ini dikultur dengan sel B16F10 atau MC38 hidup, dan sitotoksisitas diukur (Gambar 8A). Splenosit yang dilengkapi dengan sel B16F10 yang diberi perlakuan DC661-menghasilkan peningkatan IFN- yang signifikan dibandingkan dengan splenosit yang dipaparkan dengan sel B16F10 yang diberi perlakuan DMSO. Pembunuhan yang dimediasi oleh sel T dari sel B16F10 yang berproliferasi meningkat secara signifikan pada splenosit prima DC661-bila dibandingkan dengan splenosit prima DMSO (Gambar 8, B dan C). Sel MC38 yang diobati dengan DC661 menghasilkan lebih banyak sitotoksisitas sel IFN dan prima bila dibandingkan dengan sel B16F10 (Gambar 8, D, dan E). Perawatan NAC dengan DC661 mampu sepenuhnya menghilangkan pelepasan IFN- dari splenosit dan menumpulkan sitotoksisitas sel T prima (Gambar 8, F, dan G). Penghancuran calreticulin oleh siCalr dalam sel MC38 (Gambar Tambahan 9D) membatalkan kemanjuran pengobatan DC661 dan secara signifikan mengurangi sitotoksisitas sel T prima (Gambar 8, H, dan I). Secara keseluruhan, data ini mendukung peran mekanistik dari peningkatan regulasi CALR terkait LLP dalam meningkatkan kekebalan sel T antitumor. Selanjutnya, kami memperluas temuan in vitro ini ke studi vaksinasi antitumor in vivo pada model tikus yang imunokompeten dan imunodefisiensi. Untuk pengujian ini, sel B16F10 atau MC38 yang dicairkan secara in vitro atau DC661-disuntikkan secara sc di sisi kiri untuk melindungi tikus C57BL/6 atau NOD/SCID yang imunokompeten terhadap tantangan ulang dengan sel tumor hidup dari jenis yang sama yang disuntikkan. 7 hari kemudian ke sayap kanan (Gambar 9A). Sel B16F10 yang diobati dengan DC661-gagal mencegah penolakan tumor meskipun telah dilakukan pengujian in vitro, menunjukkan bahwa DC661 menginduksi kematian sel imunogenik (Gambar 9B dan Gambar Tambahan 9E). Sebaliknya, inokulasi satu sisi dengan sel MC38 yang diberi perlakuan DC661- mendorong penolakan total terhadap sel MC38 hidup yang ditanamkan pada sisi yang berlawanan (Gambar 9C dan Gambar Tambahan 9F). Untuk menentukan apakah kekebalan adaptif sangat penting untuk efek vaksin DC661 terhadap tumor MC38, kami mengulangi percobaan pada tikus NOD/SCID. Yang mengejutkan, kami menemukan bahwa sel MC38 yang diobati dengan DC661-tidak menyebabkan penolakan terhadap tumor tantangan pada tikus NOD/SCID yang imunodefisiensi (Gambar 9D dan Gambar Tambahan 9G), yang menunjukkan bahwa kekebalan adaptif diperlukan untuk efek vaksin yang diamati. Untuk menguji kekuatan temuan ini, kami memilih lini sel kanker tikus imunogenik lain yang terkenal, CT26, dan melakukan percobaan vaksinasi seperti di atas. Seperti yang diharapkan, implantasi sel CT26 yang diberi DC661-di satu sisi tikus menghasilkan efek seperti vaksin dan mencegah pertumbuhan sel CT26 hidup yang ditanamkan di sisi lainnya (Gambar 9E dan Gambar Tambahan 9H). Temuan kami menunjukkan bahwa LLP yang diinduksi DC661- sangat penting untuk kematian sel imunogenik yang dimediasi LMP, yang dibalik dengan impor sistein ke dalam lisosom oleh transporter lisosom MFSD12 (Gambar 9F).

Diskusi

Penghambatan lisosom tampaknya menjadi pendekatan terapi yang menjanjikan dalam studi praklinis, dan uji klinis HCQ telah menghasilkan hasil yang menggembirakan namun beragam (1, 32). PPT1 adalah target molekuler HCQ, dan inhibitor PPT1 yang lebih kuat, seperti DC661 (2) dan GNS561 (3), menginduksi kematian sel yang dimediasi LMP secara in vitro. Mekanisme pasti kematian sel lisosom dan perannya dalam imunogenisitas tumor belum sepenuhnya dijelaskan. Imunitas antitumor ditingkatkan ketika penghambatan autophagy dikombinasikan dengan imunoterapi (9, 10, 31). Mekanisme yang diusulkan untuk imunogenisitas intrinsik sel setelah penghambatan autophagy termasuk MHC kelas I dan peningkatan regulasi imunoproteasome, yang keduanya mendukung peningkatan pemrosesan dan presentasi antigen. Selain itu, hilangnya protein autophagy atau penghambatan autophagy oleh klorokuin menambah respons sel CD8+ T dengan meningkatkan level permukaan MHC kelas I dalam sel dendritik (33). Kami sebelumnya menunjukkan bahwa penghambatan PPT1 sistemik dapat mempolarisasi ulang makrofag dari fenotip M2 ke M1. Inhibitor PPT1 dapat meningkatkan tingkat STING, menyebabkan pelepasan IFN dan peningkatan pembunuhan yang dimediasi sel T pada model melanoma (31). Di sini, kami menunjukkan bahwa LLP sendiri menghasilkan bentuk kematian sel imunogenik intrinsik sel tumor. Kami menemukan bahwa penghambatan lisosom menyebabkan sangat sedikit perubahan protein dalam sel kanker, dan peningkatan protein yang paling signifikan termasuk reseptor muatan autophagy dan regulator apoptosis. Pendekatan kami yang menargetkan beberapa gen di seluruh fungsi menunjukkan bahwa protein yang diinduksi obat kemungkinan besar bukan pengatur utama kematian sel. Penghambatan genetik ULK1 atau ATG7 juga tidak menyelamatkan sitotoksisitas DC661. Kami menunjukkan bahwa penghambatan lisosom mengaktifkan berbagai bentuk kematian sel terprogram, termasuk apoptosis, nekroptosis, ferroptosis, dan piroptosis, namun masing-masing hal ini dapat diabaikan untuk sitotoksisitas yang diinduksi obat. Sebagai catatan, mekanisme kematian sel yang terprogram dapat tumpang tindih dan penargetan bersama dari beberapa mekanisme kematian sel dapat memberikan sitoproteksi terhadap kematian sel setelah permeabilisasi membran lisosom. Penelitian kami telah mengesampingkan mekanisme yang bergantung pada cathepsin dan kalsium untuk kematian sel lisosom dan menyoroti pentingnya LLP sebagai penentu penting kematian sel. Kami menemukan bukti LLP yang dapat dibalik oleh antioksidan yang diangkut ke lisosom, NAC dan sangat penting untuk permeabilisasi membran lisosom dan sitotoksisitas. NAC adalah satu-satunya agen yang mampu memitigasi atau membalikkan kematian sel yang disebabkan oleh DC661-, dan kapasitas ini bergantung pada keberadaan transporter sistein lisosomal MFSD12. Kurangnya penetrasi lisosom mungkin menjadi alasan mengapa penghambat peroksidasi lipid diduga lainnya, Trolox dan vitamin C, tidak mampu mencegah sitotoksisitas DC661. NAC diubah menjadi sistein, yang diimpor ke lisosom dan dioksidasi menjadi bentuk disulfida, sistin. Sistin diekspor ke sitosol oleh transporter lisosom lain, sistinosis, di mana ia direduksi menjadi sistein yang meremobilisasi sumber nutrisi internal, mengaktifkan kembali target kompleks rapamycin 1, dan mendorong autophagy (34). Siklus reduksi oksidasi dari sistein menjadi sistin (lisosom) dan kembali menjadi sistein (sitosol) bisa menjadi mekanisme penyelamatan NAC terhadap sitotoksisitas DC661 atau cedera lisosom yang lebih umum pada konteks penyakit lain di mana NAC telah terbukti berguna secara terapeutik (35) . NAC tidak hanya membalikkan LLP dan LMP yang diinduksi DC661- tetapi juga ekspresi permukaan calreticulin penanda kematian sel imunogenik. Ekspresi permukaan sel protein CALR diperlukan untuk peningkatan sitotoksisitas yang dimediasi sel T yang diinduksi oleh splenosit prima DC661-, menunjukkan bahwa penghambatan lisosom menghasilkan bentuk spesifik imunogenisitas intrinsik sel.

Sementara penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa penghambatan lisosom dapat meningkatkan aktivitas antitumor dari penghambatan pos pemeriksaan kekebalan pada tumor panggul yang sudah ada (9, 31), penelitian kami adalah yang pertama dalam pengetahuan kami yang menunjukkan efek seperti vaksin untuk tumor MC38 tetapi tidak untuk tumor B16 pada tumor MC38. sel tumor diobati dengan DC661 sebelum implantasi. Hal ini menunjukkan bahwa kematian sel lisosom dapat menginduksi imunogenisitas intrinsik sel, namun perubahan ini sendiri tidak cukup untuk membalikkan lingkungan mikro tumor yang "imun dingin" menjadi lingkungan mikro tumor "panas yang imun". Penelitian kami sebelumnya pada model lingkungan mikro tumor "imun dingin" B16 dan BRafCA PtenloxP Tyr: model tikus rekayasa genetika CreERT2 (31) menunjukkan bahwa penghambatan lisosom sistemik menghasilkan efek pada makrofag terkait tumor dan sel penekan turunan sel myeloid yang cukup untuk meningkatkan kemanjuran imunoterapi. Mungkin imunogenisitas intrinsik sel juga berperan dalam tumor dingin imun yang menjadi lebih responsif terhadap ICD setelah penghambatan lisosom. Efek penghambatan lisosom yang mirip dengan vaksin yang diamati di lingkungan laboratorium terkontrol mungkin atau mungkin tidak diterapkan secara klinis, tetapi ini bisa menjelaskan mengapa beberapa pasien yang diobati dengan dabrafenib, trametinib, dan HCQ pada melanoma mutan BRAF yang sebelumnya diobati memiliki efek yang begitu dalam dan tahan lama. menanggapi rejimen ini (32). Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk memahami bagaimana penghambatan PPT1 menghasilkan ROS lisosom dan peroksidasi lipid. Regulasi V-ATPase dan pengasaman lisosom yang bergantung pada PPT bukanlah penjelasan yang cukup karena bafilomycin menghambat pengasaman lisosom tetapi tidak menghasilkan LMP (data tidak ditampilkan). Implikasi dari temuan ini menunjukkan bahwa inhibitor lisosom yang meningkatkan imunogenisitas intrinsik sel tumor dapat dikombinasikan secara rasional dengan terapi yang meningkatkan aktivasi sel T, atau infiltrasi ke dalam lingkungan mikro tumor, yang berpotensi menghasilkan efek sinergis.

Gambar 5. N-asetil sistein mencegah kematian sel yang disebabkan oleh DC661-. (A)

Metode

Budaya sel. Manusia A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), lini sel A549 (CRM-CCL-185), dan mouse B16F10 (CRL-6475) dibeli dari ATCC. Jalur Human A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793, dan mouse YUMM1.7 (WT, Gsdme EV, dan Gsdme KO1 dan KO2) diperoleh sendiri. Sel tikus MC38 dan CT26 disediakan oleh Andy Minn, University of Pennsylvania. Sel sumsum tulang primer FL5.12 dan IL-3–dependent Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) diperoleh dari Kathryn E. Wellen, University of Pennsylvania. Garis sel Panc-1 manusia (CRL-1469, ATCC) disediakan oleh Ben Z. Stanger, University of Pennsylvania. Garis sel tikus YUMMER 1.7 diperoleh dari Xiaowei (George) Xu, Universitas Pennsylvania. Semua lini sel diuji untuk Mycoplasma dua kali setahun oleh fasilitas Inti Universitas Pennsylvania dan diautentikasi menggunakan sidik jari berulang tandem pendek oleh inti Wistar Institute Genomics. Garis sel A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12, dan Bax/ Bak DKO dikultur dalam RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); Garis sel A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10, dan MC38 dikultur dalam DMEM (Invitrogen, 11995); dan sel YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV, dan Gsdme KO1 dan KO2) (15) dikultur dalam DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Media kultur dilengkapi dengan 10% serum janin sapi (12306C, MilliporeSigma) dan 1× larutan antimikotik antibiotik (Gibco, 15140-122). Garis sel FL5.12 dan Bax/Bak DKO dipertahankan dalam media RPMI lengkap yang dilengkapi dengan 50 μM -mercaptoetanol (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, MilliporeSigma), dan 0,35 ng/mL dan 3,5 ng /mL IL-3, masing-masing. Garis sel YUMMER1.7 dan YUMM1.7 (WT, Gsdme EV, dan Gsdme KO) dipertahankan dalam media lengkap yang dilengkapi dengan 1× MEM NEAA (Gibco, 11140-050). Sel WM35 dan WM793 dikultur dalam media MCDB 153 (MilliporeSigma, M7403), mengandung 10% FBS dalam media 1× Leibovitz L-15 (Corning, 10-045-CV), 7,5% b/v natrium bikarbonat ( Corning, 25-035-CI), 1× larutan antimikotik antibiotik (Gibco, 15140-122), dan 5 ug/mL insulin (MilliporeSigma, I0516). Sel ditanam pada suhu 37 derajat dengan adanya 5% CO2. Bahan kimia dan reagen. Bahan kimia yang dibeli termasuk HCQ Sulfate (Spectrum Chemicals, 747-36-4) dan DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) digunakan untuk mewarnai sel untuk kalsium sesuai instruksi pabrik. Daftar antibodi dan inhibitor disediakan pada Tabel Tambahan 1 dan Tabel Tambahan 2.

Gambar 6. NAC membalikkan LLP dengan cara yang bergantung pada MFSD12-. (A–C)

Ekstraksi dan pencernaan protein untuk kromatografi cair – analisis spektrometri massa tandem untuk proteomik. {{0}}.7 × 106 sel melanoma A375P dikultur dalam cawan kultur berukuran 60 mm. Sel diperlakukan dengan DMSO (kontrol), DC661 (3 μM), HCQ (10 μM), atau HCQ (3{{70}} μM) selama 24 jam sekitar 5{{ 112}}% pertemuan. Pelet sel beku dilisiskan dengan 50 mM Tris pH 7,4, 1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,15 mM PMSF, 1 ug/mL pepstatin, dan 1 ug/mL leupeptin. Lisat yang telah diklarifikasi (masing-masing 1{185}} ug) dielektroforesis 0,5 cm ke dalam gel bis-tris diikuti dengan fiksasi dan pewarnaan dengan koloid Coomassie. Setiap jalur gel 0,5 cm dipotong, dihilangkan warnanya, direduksi dengan tris (2-karboksietil) fosfin, dialkilasi dengan iodoacetamide, dan dicerna dengan trypsin seperti dijelaskan sebelumnya (36). Intisari (1 ug) dianalisis dengan kromatografi cair-spektrometri massa tandem (LC-MS/MS) pada spektrometer massa Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) sejalan dengan nanoAQUITY UPLC (Waters). Pemisahan analitik dilakukan pada kolom Peptida BEH C18 1,7 μm × 250 mm (Waters, 186003546) menggunakan gradien 245-menit dengan asam format 0,1% dalam air (fase gerak A) dan asetonitril (fase gerak B) sebagai berikut : 5%–30% B selama 225 menit, 30%–80% B selama 5 menit, 15-menit ditahan pada 80% B, dan kembali ke kondisi awal. Spektrum MS lengkap diperoleh pada resolusi 70,{49}}, dengan rentang pemindaian 400–2,000 m/z, target kontrol penguatan otomatis sebesar 3 × 106 ion, dan waktu injeksi maksimum 50 milidetik. Spektrum MS2 yang bergantung pada data diperoleh untuk 20 ion paling melimpah teratas pada resolusi 17.500, dengan lebar isolasi 1,5 m/z, target kontrol penguatan otomatis 5 × 104 ion, dan waktu injeksi maksimum 50 milidetik. Pencocokan peptida diatur ke pilihan, dan ion-ion yang tidak ditugaskan dan bermuatan tunggal ditolak (37). Data MS mentah dianalisis menggunakan MaxQuant 1.6.5.0 (https://maxquant.net/perseus/) dengan database sekuens manusia Uniprot (diakses pada 10 Oktober 2019) dan database kontaminan umum, termasuk trypsin, keratin, protein sapi, dan mikoplasma (38). Spesifisitas peptida triptik dengan maksimal 2 pembelahan yang terlewat, modifikasi tetap pada sistein (karbamidometilasi), dan oksidasi metionin variabel atau asetilasi terminal-N digunakan dalam pencarian (39). Batasan FDR 1% digunakan untuk peptida dan protein. Pencocokan antar proses diaktifkan; protein dikuantifikasi menggunakan kuantisasi bebas label (40). Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Protein harus diidentifikasi oleh setidaknya 3 peptida unik dan memiliki 3 nilai valid (kuantisasi bukan nol) dalam kelompok sampel, dan kontaminan serta protein balik disaring dari kumpulan data. Nilai yang hilang diperhitungkan dari distribusi normal. Perbandingan berpasangan antar kondisi dilakukan pada tingkat protein menggunakan uji-t Student berekor 2-dengan FDR berbasis permutasi dengan pengacakan s0=0.1 dan 250. Perubahan signifikan didefinisikan sebagai FDR kurang dari 5% dan perubahan lipatan absolut lebih besar dari 1,5 atau 2,0, sebagaimana ditentukan. Lyso-IP. Sel A375P terinfeksi lentivirus pLJC5-Tmem192-3xHA dan diseleksi menggunakan 1 mg/mL puromisin (MilliporeSigma, P4512). Sekitar 3 × 106 sel A375P yang diberi tag HA diperlakukan dengan 10 mM NAC atau kontrol kendaraan air selama 24 jam dalam kondisi kultur yang telah dijelaskan sebelumnya. Setelah perlakuan, sel-sel dicuci dalam PBS, dipanen dalam 0,5 mL KPBS dingin, dan dihomogenisasi secara perlahan menggunakan 20 pukulan dalam homogenizer Dounce 2 mL. Sekitar 2,5% homogenat dicadangkan untuk analisis lisat sel utuh, dan sisanya disentrifugasi pada suhu 3,{120}}g selama 2 menit pada suhu 4 derajat untuk menghilangkan sisa-sisa membran sel. Supernatan homogenat kemudian dipindahkan ke tabung 1,5 mL bersih dan diinkubasi dengan 50 μL manik-manik anti-HA (Pierce, 88836) atau manik-manik anti-DDK/Bendera (OriGene, TA150042) selama 15 menit pada suhu 4 derajat. Sampel kemudian diendapkan dengan menempatkan tabung pada DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) dan diayun perlahan selama 2 menit pada suhu kamar. Supernatan dicadangkan untuk analisis fraksi tak terikat. IP dicuci sebanyak 3 kali dengan KPBS yang mengandung 8 mM CaCl2. Lyso-IP diekstraksi dalam 80% MeOH untuk analisis metabolomik. Ekstraksi dan analisis lipid menggunakan LC-MS/MS untuk lipidome global. Sel Melanoma A375P diunggulkan dalam cawan 60 mm dengan ukuran 0,7 × 106 sel per cawan. Ketika sel berada pada pertemuan sekitar 50%, mereka diobati dengan DMSO (kontrol), DC661 (3 μM), atau HCQ (30 μM) selama 24 jam. Sel dicuci 2 kali dengan HBSS, dimasukkan ke dalam metanol dingin, dan dipindahkan ke tabung kaca untuk ekstraksi lipid dengan kloroform/metanol/0,88% NaCl (2:1:1) yang mengandung standar lipid internal EquiSPLASH (Avanti Polar Lipid). Sampel divorteks dan kemudian disonikasi dalam penangas air selama 5 menit di atas es. Setelah sentrifugasi pada 500g selama 15 menit pada suhu 40 derajat, fase bawah dipindahkan ke tabung gelas lain. Fase atas diekstraksi kembali menggunakan fase bawah sintetik. Setelah sonikasi dan sentrifugasi, fase bawah digabungkan dengan pengumpulan fase bawah pertama. Sampel dikeringkan dengan nitrogen, diresuspensi dalam 10% kloroform/90% metanol, dan dipindahkan ke botol kaca LTQ. Sampel lipid dianalisis pada spektrometer massa Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X dan sistem UHPLC Vanquish Horizon. Pemisahan analitik menggunakan kolom Accucore C30 (2,1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) dengan 50:50 asetonitril/air dan 88:10:2 isopropanol/asetonitril/air, masing-masing mengandung 5 mM amonium format dan 0,1% asam format. Data LC-MS/MS diperoleh secara terpisah dalam polaritas positif dan negatif dengan parameter instrumen berikut: pemindaian MS1 ​​120, resolusi; MS2 yang bergantung pada data pada 20 ion paling melimpah pada resolusi 15,000; lebar isolasi 0,4 m/z; dan energi tumbukan ternormalisasi bertahap sebesar 20:30:40 (43).

Gambar 7. N-asetil sistein mencegah ekspresi permukaan calreticulin yang diinduksi DC661-. (IKLAN)

Lipid diidentifikasi dan diukur menggunakan LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). Spesies lipid yang teridentifikasi disaring berdasarkan hasil tambahan yang diharapkan dan tingkat identifikasi berdasarkan kelas. Area puncak dinormalisasi ke standar EquiSPLASH untuk kelas yang didukung dan selanjutnya dinormalisasi berdasarkan total area untuk setiap sampel untuk mengoreksi variasi jumlah sel. Analisis statistik dilakukan pada data transformasi log menggunakan Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Ekstraksi dan analisis metabolit menggunakan LC-MS/MS untuk metabalon. Metabolit polar diekstraksi dari seluruh sel, fraksi tidak terikat Lyso-IP, dan sampel terikat Lyso-IP menggunakan metanol 80% dan disimpan pada suhu –8{{30}} sebelum kromatografi cair –analisis spektrometri massa (LC-MS). Ekstrak dianalisis dengan LC-MS menggunakan spektrometer massa Thermo Scientific Q-Exactive HF-X dengan probe HESI II sejalan dengan sistem UHPLC Thermo Vanquish Horizon. Pemisahan LC dilakukan menggunakan kolom ZIC-HILIC (2,1 mm × 150 mm, ukuran partikel 5 μm, EMD Millipore) dengan kolom pelindung ZIC-HILIC (2,1 mm × 20 mm, EMD Millipore) pada suhu 45 derajat dengan laju aliran sebesar 0,2 ml/menit. Kromatografi dilakukan dalam kondisi asam untuk mengurangi reaktivitas gugus tiol. Fase gerak A adalah air dan B adalah asetonitril, keduanya mengandung asam format 0,1%. Gradien LC adalah 85% B selama 2 menit, 85% B hingga 20% B selama 15 menit, 20% B hingga 85% B selama 0,1 menit, dan 85% B selama 8,9 menit. Autosampler diadakan pada suhu 4 derajat, dan 4 μL setiap sampel disuntikkan per analisis. Parameter MS berikut digunakan: laju aliran gas selubung, 40 AU; laju aliran gas tambahan, 10 AU; laju aliran gas sapu, 2 AU; suhu pemanas gas tambahan, 350 derajat; tegangan semprot, 3,75 kV untuk mode positif dan 3,5 kV untuk mode negatif; suhu kapiler, 375 derajat; dan tingkat RF corong, 40%. Semua sampel dianalisis dengan MS penuh dengan peralihan polaritas. Pemindaian MS penuh diperoleh dari 65 hingga 975 m/z pada resolusi 120,{59}} dengan target kontrol penguatan otomatis sebesar 1 × 106 ion dan waktu injeksi maksimum 100 milidetik. Data mentah dianalisis menggunakan TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Metabolit yang ditargetkan diidentifikasi berdasarkan massa yang akurat dan waktu retensi dalam polaritas pilihannya berdasarkan standar analitik. Deteksi puncak menggunakan algoritma ICIS dengan pemulusan 1. Kuantifikasi relatif dilakukan menggunakan area puncak terintegrasi, dan nilai-nilai ini dikoreksi ke jumlah total per sampel (didefinisikan sebagai total area puncak). PPT1-Pengeditan CRISPR/Cas9. Sel A375P PPT1-non-target dan KO disiapkan seperti dijelaskan sebelumnya (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) adalah hadiah dari Feng Zhang (Addgene plasmid, 48139). Guide RNA oligos (IDT) dianil, difosforilasi, dan kemudian diikat ke dalam plasmid pX459 yang dicerna dan difosforilasi BbsI mengikuti protokol laboratorium Zhang, tersedia melalui Addgene. Plasmid yang diikat diubah menjadi sel Stbl3 (Invitrogen). Urutan persiapan plasmid mengkonfirmasi keberadaan urutan RNA panduan yang diinginkan. Sel A375P ditransfeksi menggunakan Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015), diikuti dengan seleksi puromisin. Uji surveyor mengkonfirmasi pengeditan gen PPT1 oleh CRISPR/Cas9, dan knockdown PPT1 dikonfirmasi oleh Western blotting dengan antibodi PPT1 (Origene). Urutan untuk oligo RNA pemandu adalah sebagai berikut: RNA pemandu nontarget maju (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), pemandu RNA terbalik nontarget (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), pemandu PPT1 manusia RNA 1 maju (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), pemandu PPT1 manusia RNA 1 mundur (AAACGGGCATCGAGGGAGTCCAAA), pemandu PPT1 manusia RNA 3 maju (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC), dan panduan PPT1 manusia RNA 3 mundur (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Klon yang ditumbuhkan dari sel tunggal yang digunakan dalam makalah ini meliputi: klon C8 adalah human guide 1 dan klon B5 adalah human guide 3. Immunoblotting. Satu juta sel dimasukkan ke dalam cawan berukuran 10 cm, dan perawatan diberikan pada hari berikutnya; sel dikumpulkan dengan cara dikikis. Lisat sel utuh dibuat menggunakan buffer lisis SDS. Konsentrasi protein diukur menggunakan Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, 23225). Protein 30–50 ug digunakan untuk SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF (Bio-Rad, 1620177). Membran diblokir menggunakan 5% BSA atau susu skim 5%, sesuai kondisi yang dioptimalkan, dan diinkubasi dengan antibodi primer semalaman pada suhu 4 derajat. Membran PVDF dicuci dengan 1× TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu kamar dengan antibodi sekunder terkonjugasi HRP spesifik spesies. Membran kemudian dicuci dan dikembangkan menggunakan substrat Pierce ECL Western Blotting (Thermo Fisher Scientific, 32106) dan film autoradiografi (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Untuk studi piroptosis, protein lisat dipisahkan oleh SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF. Setelah diblokir dalam BSA 5%, membran PVDF diinkubasi dengan antibodi primer yang ditunjukkan semalaman pada suhu 4 derajat, dicuci dalam PBS/Tween, dan diinkubasi dengan antibodi sekunder berpasangan peroksidase. Imunoreaktivitas terdeteksi menggunakan antibodi sekunder terkonjugasi HRP (CalBioTech), substrat chemiluminescence (Thermo Fisher Scientific), dan sistem pencitraan ChemicDoc MP (Bio-Rad). Untuk percobaan yang melibatkan supernatan, sel dikultur dalam media bebas FBS untuk menghindari distorsi SDS-PAGE. Supernatan sel dipanen dan disentrifugasi selama 10 menit pada 500g pada suhu 4 derajat untuk menghilangkan sisa-sisa sel. Supernatan yang dihasilkan dipekatkan 10× menggunakan Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) dengan cara sentrifugasi selama 30 menit pada 4.500g pada suhu 4 derajat. Konsentrat dicampur dengan buffer sampel dan dianalisis melalui Western blotting seperti dijelaskan di atas. Pewarnaan gel protein dilakukan dengan menggunakan pewarnaan Ponceau merah. Uji aktivitas LMP dan cathepsin L. Plasmid pEGFP-hGal3 manusia adalah hadiah dari Tamotsu Yoshimori (Addgene plasmid, 73080) dan digunakan untuk membuat lini A375P-Galectin-3. Tulang punggung vektor plasmid kontrol pEGFP-C1 telah dibeli (novo prolabs, V012024). Plasmid ditransfusikan (1 ug/mL) ke dalam sel A375P menggunakan Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) sesuai protokol pabrikan; sel yang ditransfusikan dipilih secara stabil menggunakan G418 (Gibco, 10131035). Untuk LMP, total 25 sel A375P-galectin-3 puncta-positif di beberapa bidang gambar dihitung. Persentase sel puncta-positif dihitung di setiap bidang secara terpisah, dan persentase rata-rata dihitung untuk setiap kelompok. Kit uji Magic Red Cathepsin L (Abcam, ab270774) digunakan sesuai protokol pabrikan. Sel dicitrakan di bawah mikroskop terbalik Zeiss Axio Observer 7. Intensitas terintegrasi mentah Magic Red dihitung menggunakan perangkat lunak Fiji - ImageJ (NIH). Uji viabilitas sel MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5 diphenyl tetrazolium bromide). 2.000 sel disepuh dalam rangkap tiga di setiap sumur pada pelat sumur 96-hari, dan pengujian MTT 3-hari dilakukan menggunakan Kit viabilitas sel (Roche, 11465007001) sesuai protokol pabrikan. Pretreatment inhibitor diberikan selama 1 jam, diikuti dengan cotreatment sel dengan inhibitor dengan atau tanpa DC661. Metode regresi nonlinier (curve fit) digunakan untuk menghitung IC50.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Meningkatkan Imunitas

【Minta lebih lanjut】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikasi WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Uji pembentukan koloni. 2,000 sel per sumur diunggulkan ke dalam 6-piringan sumur dan dirawat pada hari berikutnya; sel disimpan dalam pengobatan selama total 8 hari. Koloni yang terbentuk di setiap sumur dicuci dengan PBS, difiksasi dengan metanol dingin pada suhu –20 derajat selama 20 menit, dan diwarnai dengan larutan berair Crystal violet 0,5% (V5265; MilliporeSigma).

Uji pengecualian pewarna biru Trypan. Campuran reaksi untuk uji kadar Trypan blue dibuat dengan mencampurkan 1 bagian 0.4% Trypan blue (25- 900-CI, Corning) dan 1 bagian sampel sel yang diencerkan. Campuran diinkubasi selama 1 menit, dan sel dihitung pada Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).

Gambar 8. Ekspresi permukaan calreticulin yang diinduksi DC661- membuat sel T menjadi primadona melawan sel tumor. (A)

Gambar 9. Inokulasi sel yang diberi DC661-menghasilkan penolakan tumor dalam konteks tertentu. (A)

BUSA-LPO. LLP dipelajari menggunakan probe fluoresen, FOOMLPO. FOAM-LPO disintesis seperti dijelaskan sebelumnya (26). Sel dikultur pada 8 Well μSlide (ibid, 80807) dan diobati dengan inhibitor dan dengan atau tanpa DC661. Sel diinkubasi dengan media yang mengandung FOAM-LPO (1 M) dalam atmosfer 5% CO2 dan 95% udara selama 5 menit pada suhu 37 derajat. Sel-sel dicuci dua kali dengan media, dan kemudian sel-sel diamati di bawah mikroskop (mikroskop terbalik Zeiss Axio Observer 7) untuk mendeteksi pergeseran fluoresensi dari 586 ke 512 nm sebagai respons terhadap LLP. qRT-PCR dan primer. Sel A375P (3 × 105) dikultur dalam piringan 60 mm dan diobati dengan DMSO atau DC661 (3 μM) selama 24 jam. Total RNA diisolasi dengan kit isolasi RNA (QIAGEN, 74134) sesuai dengan protokol pabrikan. cDNA disintesis menggunakan kit iScript Reverse Transcriptase dengan 500 ng RNA murni sesuai protokol pabrikan (Thermo Scientific, K1642). Reaksi qPCR diatur menggunakan SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) yang mengandung 1 μL cDNA. Semua pengukuran dilakukan dalam rangkap tiga, dan BACTIN digunakan sebagai standar internal untuk perhitungan ΔCT. Analisis ekspresi gen dilakukan dengan menggunakan primer berikut: PTGS2/COX-2 forward (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 reverse (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS forward (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS reverse (GACCAGTGATGTCAACAGGAGC), CHAC1 forward (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 mundur (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), maju BACTIN (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT), dan mundur BACTIN (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).

transfeksi siRNA. Studi knockdown genetik untuk ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1, dan MFSD12 manusia dilakukan dalam garis sel A375P. Studi penghambatan genetik untuk tikus Ppt1 dan Calreticulin dilakukan dalam sel MC38. SiRNA nontarget (sc{{10}}), ULK1 manusia (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), mouse Ppt1/Cln1 (sc-142398) dan Calreticulin /Calregulin (sc-29895) siRNA dibeli dari Santa Cruz Biotechnology. SiRNA ini terdiri dari kumpulan 3–5 siRNA spesifik target. Aliran sitometri. Induksi ferroptosis diukur menggunakan C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). Sel A375P diunggulkan dalam 6-well plate dan diberi DMSO, ferrostatin{{40}} (10 μM), lip roxstatin-1 (2 μM), elastin (5 μM ), DC661 (3 μM), atau kombinasi selama 24 jam. Sel dipanen dengan cara disentrifugasi pada 300g selama 5 menit. Sel diresuspensi dalam 500 μL 1X HBSS (Corning, 21-023-CV) yang mengandung 1 μM C11-BODIPY dan diinkubasi pada suhu 37 derajat selama 15 menit. Sel dipelet dan diresuspensi dalam 500 μL 1X HBSS, dan intensitas fluoresensi diukur pada sitometer BD LSRII menggunakan 530/30 Blue (Fasilitas Inti Aliran Universitas Pennsylvania). Kuantitas ekspresi permukaan sel calreticulin untuk kematian sel imunogenik dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya (45) dengan flow cytometry. Sel B16F10 atau MC38 dikultur dan diobati dengan NAC (10 mM) atau DC661 (3 μM) selama 24 jam. Sel MC38 diobati dengan siPpt1 atau siNT selama 48 jam dengan ada atau tidaknya 10 mM NAC selama 24 jam. Sel diwarnai dengan antibodi CALR (Cell Signaling Technology, 12238), antibodi kedua anti-kelinci Alexa Fluor 647 kambing (Invitrogen), dan propidium iodide (PI) (Biolegend, 421301). Sampel yang diwarnai diperoleh pada flow cytometer BD LSRII menggunakan 710/50 Blue dan 670/30 Red untuk menangkap fluoresensi PI dan CALR, masing-masing (fasilitas University of Pennsylvania Flow Core), dan analisis dibatasi pada sel CALR-positif dan PI-negatif. untuk menghindari kejadian positif palsu. Priming sel T dan persentase sitotoksisitas. Sel tumor B16 atau MC38 (5 × 104) dikultur dan diobati dengan NAC (10 mM) atau DC661 (1 μM atau 3 μM), masing-masing selama 24 jam. Untuk penghambatan genetik Calr, sel MC38 diobati dengan Calr siRNA atau nontarget siRNA (siNT) selama 48 jam, diikuti dengan pengobatan dengan DMSO atau 3 μM DC661 selama 24 jam. Splenosit kemudian dikultur dengan DC661 dengan atau tanpa sel B16 atau MC38 dengan adanya IL-2 (5 IU/mL) dan dikultur bersama selama 72 jam. Priming dikonfirmasi oleh IFN-ELISA (Biolegend, 430815) dari supernatan. Splenosit prima kemudian dikultur bersama dengan sel B16 atau MC38 yang baru dikultur dengan rasio target-ke-efektor (B16 atau MC38 terhadap splenosit) masing-masing 1:20 dan 1:50 untuk sel B16 dan MC38. Pelepasan LDH terkait kematian sel B16 atau MC38 dan kemudian persentase sitotoksisitas diukur sesuai dengan protokol pabrikan (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Tes vaksinasi antitumor dan studi kemoterapi dengan model kanker yang sudah ada. Tikus WT C57BL/6 betina berumur enam hingga delapan minggu, tikus NOD/SCID, dan BALB/c diperoleh dari The Jackson Laboratory. Untuk percobaan vaksinasi antitumor, sel WT B16F10, MC38, dan CT26 diobati dengan DC661 (3 μM) selama 36 jam dalam labu 175 cm2. Kemudian, supernatan dan sel-sel yang terlepas dikumpulkan dalam tabung elang 50 mL. Sel-sel disentrifugasi dan dicuci dengan PBS dingin. Untuk vaksinasi, 150 μL suspensi seluler disuntikkan sc di sisi kiri tikus C57BL/6 yang imunokompeten, tikus NOD/SCID yang imunodefisiensi (sel 1,8 × 104 B16F10, 1,5 × 106 sel MC38 per tikus), atau tikus BALB/c syngeneic (3,0 × 106 sel CT26 per mouse). Sel-sel beku-cair yang diresuspensi dalam PBS disuntikkan sebagai kontrol negatif. Satu minggu kemudian, sel kanker hidup dari jenis yang sama (sel 3 × 104 B16F10, 2 × 10 sel MC38, atau 5 × 10 sel CT26 per tikus) dengan volume Matrigel yang sama (Corning, 354248) disuntikkan di sisi kanan. tikus yang divaksinasi. Tumor diukur menggunakan kaliper elektronik, dan volume dihitung sebagai L × W2 × 0,5. Pertumbuhan tumor dipantau secara rutin pada hari-hari berikutnya, dan tidak adanya tumor dianggap sebagai indikasi vaksinasi antitumor yang efisien. Studi vaksinasi DC661-MC38 diulangi pada tikus NOD/SCID. Statistik. Signifikansi statistik ditentukan dengan menggunakan uji t berekor 2-tidak berpasangan milik Student ketika membandingkan 2 kelompok. 1-Uji ANOVA cara digunakan ketika lebih dari 2 kelompok dibandingkan. Hipotesis nol ditolak secara signifikan jika nilai P kurang dari 0,05. Data ditampilkan sebagai mean ± SEM. Persetujuan studi. Semua percobaan hewan dilakukan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional dari University of Pennsylvania.

Tanaman cistanche ramuan Cina-Antitumor

Referensi

1. Zeh HJ, dkk. Sebuah studi pra operasi fase II secara acak tentang penghambatan autophagy dengan hidroksiklorokuin dosis tinggi dan gemcitabine/Nab-paclitaxel pada pasien kanker pankreas. Klinik Kanker Res. 2020;26(13):3126–3134.

2. Rebecca VW, dkk. PPT1 mendorong pertumbuhan tumor dan merupakan target molekuler turunan klorokuin pada kanker. Penemuan Kanker. 2019;9(2):220–229.

3. Brun S, dkk. GNS561, inhibitor autophagy baru yang aktif melawan sel induk kanker pada karsinoma hepatoseluler dan metastasis hati dari kanker kolorektal. J Kanker. 2021;12(18):5432–5438.

4. Brun S, dkk. GNS561, penghambat PPT1 tahap klinis, efisien melawan karsinoma hepatoseluler melalui modulasi fungsi lisosom. Autofagi. 2022;18(3):678–694.

5. Oberle C, dkk. Permeabilisasi membran lisosom dan pelepasan cathepsin adalah peristiwa amplifikasi apoptosis pada fibroblas dan monosit yang bergantung pada Bax/ Bak. Kematian Sel Berbeda. 2010;17(7):1167–1178.

6. Boya P, Kroemer G. Permeabilisasi membran lisosom pada kematian sel. Onkogen. 2008;27(50):6434–6451.

7. Rebecca VW, dkk. Pendekatan terpadu untuk menargetkan peran sinyal pertumbuhan dan degradasi lisosom. Penemuan Kanker. 2017;7(11):1266–1283.

8. Tang R, dkk. Ferroptosis, nekroptosis, dan piroptosis dalam kekebalan antikanker. J Hematol Onkol. 2020;13(1):110.

9. Yamamoto K, dkk. Autophagy mendorong penghindaran kekebalan tubuh terhadap kanker pankreas dengan menurunkan MHCI. Alam. 2020;581(7806):100–105.

10. Deng J, dkk. Penghambatan ULK1 mengatasi gangguan presentasi antigen dan mengembalikan kekebalan antitumor pada kanker paru mutan LKB1. Kanker Nat. 2021;2(5):503–514.

11. Lazarou M, dkk. Ubiquitin kinase PINK1 merekrut reseptor autophagy untuk menginduksi mitofag. Alam. 2015;524(7565):309–314.

12. Choi YB, dkk. TAX1BP1 menahan apoptosis yang diinduksi virus dengan memfasilitasi degradasi MAVS adaptor mitokondria yang dimediasi rasa gatal. Biol Sel Mol. 2017;37(1):e00422-16.

13. Rikka S, dkk. Bnip3 merusak bioenergi mitokondria dan merangsang pergantian mitokondria. Kematian Sel Berbeda. 2011;18(4):721–731.

14. Leu JI, dkk. Dasar mekanistik untuk gangguan ferroptosis dalam sel yang mengekspresikan varian p53 S47 yang berpusat di Afrika. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.

15. Erkes DA, dkk. Inhibitor BRAF dan MEK mutan mengatur lingkungan mikro imun tumor melalui piroptosis. Penemuan Kanker. 2020;10(2):254–269.

16. Serrano-Puebla A, Boya P. Permeabilisasi membran lisosom dalam kematian sel: bukti baru dan implikasinya terhadap kesehatan dan penyakit. Ann NY Acad Sci. 2016;1371(1):30–44.

17. Thirusangu P, dkk. Autophagy yang diinduksi quinacrine pada kanker ovarium memicu permeabilisasi membran lisosom/mitokondria yang dimediasi cathepsin-L dan kematian sel. Kanker (Basel). 2021;13(9):2004.

18. Michallet MC, dkk. Apoptosis yang bergantung pada cathepsin yang dipicu oleh aktivasi limfosit T yang supraoptimal: kemungkinan mekanisme toleransi dosis tinggi. J Imunol. 2004;172(9):5405–5414.

19. Mondal A, dkk. Defisiensi Ppt1-mengganggu regulasi homeostasis Ca++ lisosom yang berkontribusi terhadap patogenesis pada model tikus penyakit CLN1. J Mewarisi Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM, dkk. Fosfolipase dan spesies oksigen reaktif menghasilkan biomarker lipid pada manusia dan hewan yang sehat dan sakit – fokus pada lisofosfatidilkolin. Fisiol Depan. 2021;12:732319.

21. Fu R, dkk. Kemanjuran N-asetilsistein dalam penekanan fenotipik model tikus penyakit Niemann-Pick, tipe C1. Hum Mol Genet. 2013;22(17):3508–3523.

22. Boz Z, dkk. N-asetilsistein mencegah stres oksidatif yang diinduksi olanzapine di neuron hipotalamus mHypoA-59. Rep Sains 2020;10(1):19185.

23. Khare S, dkk. ASS1 dan ASL menekan pertumbuhan karsinoma sel ginjal sel bening melalui perubahan metabolisme nitrogen. Metab Kanker. 2021;9(1):40.

24. Gęgotek A, dkk. Perbandingan efek perlindungan asam askorbat pada interaksi sistem redoks dan endocannabinoid fibroblas kulit manusia yang dikultur secara in vitro yang terpapar radiasi UV dan hidrogen peroksida. Lengkungan Dermatol Res. 2017;309(4):285–303.

25. De Raedt T, dkk. Memanfaatkan kerentanan sel kanker untuk mengembangkan terapi kombinasi untuk tumor yang disebabkan oleh ras. Sel Kanker. 2011;20(3):400–413.

26. Zhang X, dkk. Memantau peroksidasi lipid dalam sel busa dengan probe yang dapat ditargetkan lisosom dan rasiometrik. Kimia Anal. 2015;87(16):8292–8300.

27. Wei CY, dkk. Analisis berbasis bioinformatika mengungkapkan peningkatan MFSD12 sebagai pendorong utama proliferasi sel dan target terapi potensial pada melanoma. Onkogen. 2019;38(11):1876–1891.

28. Aldini G, dkk. N-Acetylcysteine ​​​​sebagai antioksidan dan zat pemecah disulfida: alasannya. Radikal Bebas Res. 2018;52(7):751–762. 29. Abu-Remaileh M, dkk. Metabolomik lisosom mengungkapkan regulasi penghabisan asam amino yang bergantung pada V-ATPase dan mTOR dari lisosom. Sains. 2017;358(6364):807–813.

30. Zhou J, dkk. Kematian sel imunogenik dalam terapi kanker: Penginduksi yang ada dan yang baru muncul. J Sel Mol Med. 2019;23(8):4854–4865. 31. Sharma G, dkk. Penghambatan PPT1 meningkatkan aktivitas antitumor antibodi anti-PD-1 pada melanoma. Wawasan IHSG. 2020;5(17):e133225.

32. Mehnert JM, dkk. BAMM (penghambatan autophagy BRAF dan MEK pada melanoma): uji coba fase I/II dabrafenib, trametinib, dan hydroxychloroquine pada melanoma mutan BRAFV600-lanjut. Klinik Kanker Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Loi M, dkk. Protein makroautofag mengontrol kadar MHC kelas I pada sel dendritik dan membentuk respons sel T anti-virus CD8(+). Perwakilan Sel 2016;15(5):1076–1087.

34. Jouandin P, dkk. Mobilisasi sistein lisosom membentuk respons TORC1 dan pertumbuhan jaringan terhadap puasa. Sains. 2022;375(6582):eabc4203.

35. Schwalfenberg GK. N-acetylcysteine: tinjauan kegunaan klinis (obat lama dengan trik baru). J Nutrisi Metab. 2021;2021:9949453.

36. Bir LA, dkk. Penemuan sistematis biomarker serum kehamilan ektopik menggunakan profil protein 3-D ditambah dengan kuantisasi bebas label. J Proteom Res. 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR, dkk. Efek utama pada proteom karsinoma sel bening ovarium yang bermutasi ARID1A adalah penurunan regulasi jalur mevalonat pada tingkat pasca transkripsional. Proteomik Sel Mol. 2016;15(11):3348–3360.

38. Cox J, Mann M. MaxQuant memungkinkan tingkat identifikasi peptida yang tinggi, akurasi massa rentang ppb individual, dan kuantifikasi protein seluruh proteom. Nat Bioteknologi. 2008;26(12):1367–1372.

39. Cox J, dkk. Andromeda: mesin pencari peptida yang terintegrasi ke dalam lingkungan MaxQuant. J Proteom Res. 2011;10(4):1794–1805.

40. Cox J, dkk. Kuantifikasi bebas label lebar proteom yang akurat dengan normalisasi tertunda dan ekstraksi rasio peptida maksimal, disebut MaxLFQ. Proteomik Sel Mol. 2014;13(9):2513–2526.

41. Tyanova S, dkk. Platform komputasi Perseus untuk analisis komprehensif data (prote)omics. Metode Nat. 2016;13(9):731–740.

42. Tyanova S, Cox J. Perseus: platform bioinformatika untuk analisis integratif data proteomik dalam penelitian kanker. Metode Mol Biol. 2018;1711:133–148.

43. Alicea GM, dkk. Perubahan metabolisme lipid fibroblas yang menua menyebabkan resistensi sel melanoma yang bergantung pada usia terhadap terapi yang ditargetkan melalui transporter asam lemak FATP2. Penemuan Kanker. 2020;10(9):1282–1295.

44. Ran FA, dkk. Rekayasa genom menggunakan sistem CRISPR-Cas9. Protokol Nat. 2013;8(11):2281–2308.

45. Liu P, dkk. Kuantitas paparan calreticulin terkait dengan kematian sel imunogenik. Metode Enzimol. 2020;632:1–13.