BCAT2 Membentuk Lingkungan Mikro Tumor Tanpa Peradangan Dan Menginduksi Resistensi Terhadap Imunoterapi Anti-PD-1/PD-L1 Dengan Mengatur Secara Negatif Kemokin Proinflamasi Dan Imunitas Antikanker
Oct 25, 2023
Untuk meningkatkan tingkat respons monoterapi blokade pos pemeriksaan imun (ICB), perlu ditemukan target baru dalam terapi kombinasi. Melalui analisis indikator terkait lingkungan mikro tumor (TME), divalidasi bahwa BCAT2 membentuk TME yang tidak meradang pada kanker kandung kemih. Hasil dari multiomik menunjukkan bahwa BCAT2 memiliki efek penghambatan pada perekrutan limfosit sitotoksik dengan menahan aktivitas jalur terkait sitokin/kemokin proinflamasi dan jalur kemotaksis sel T. Immunoassay mengungkapkan bahwa sekresi kemokin terkait sel CD8+T memiliki korelasi negatif yang kuat dengan BCAT2, menghasilkan kecenderungan penurunan sel CD8+T di sekitar sel tumor BCAT2+ dari jauh ke di dekat. Pengobatan bersama terhadap defisiensi BCAT2 dan antibodi anti-PD-1 memiliki efek sinergis in vivo, yang menyiratkan potensi BCAT2 dalam terapi kombinasi. Selain itu, nilai BCAT2 dalam memprediksi kemanjuran imunoterapi divalidasi dalam beberapa kohort imunoterapi. Bersama-sama, sebagai molekul kunci dalam TME, BCAT2 adalah target baru yang dikombinasikan dengan ICB dan biomarker yang memandu terapi presisi.
Manfaat cistanche tubulosa-Antitumor
1. Perkenalan
Kanker kandung kemih (BLCA) adalah salah satu keganasan paling umum pada sistem saluran kemih.[1] Diperkirakan lebih dari 430,000 pasien didiagnosis di seluruh dunia setiap tahunnya.[2] Meskipun pengobatan bedah radikal telah dilakukan, hampir separuh pasien kanker kandung kemih invasif otot mengalami metastasis.[3] Oleh karena itu, terapi sistemik memainkan peran penting pada kanker kandung kemih stadium lanjut. Dengan berkembangnya imunoterapi, khususnya blokade pos pemeriksaan imun (ICB), bukti yang terkumpul menunjukkan bahwa ICB memiliki kinerja yang sangat baik dalam menghilangkan beban tumor.[4] Namun, masih banyak pasien yang gagal memberikan respons terhadap monoterapi ICB karena resistensi primer atau resistensi didapat.[5] Untuk mengatasi kebutuhan klinis yang belum terpenuhi, kombinasi terapi rasional lainnya dengan ICB memberikan wawasan baru mengenai resistensi monoterapi. Lingkungan mikro tumor (TME) adalah sistem yang rumit dan memiliki dampak besar terhadap kemanjuran imunoterapi.[6] Dengan tingkat infiltrasi limfosit T sitotoksik (CTL) yang tidak mencukupi, TME yang tidak meradang dianggap sebagai faktor penting dalam kegagalan menghasilkan respons imun antitumor yang kuat selama imunoterapi.[7] Oleh karena itu, sangat penting untuk menemukan molekul kunci yang dapat mengubah TME non-inflamasi menjadi TME yang meradang dan berpotensi menjadi target terapi kombinasi. Branched-chain aminotransferase 2 (BCAT2) adalah enzim inti dalam proses metabolisme asam amino sulfur.[8] Li dkk. menemukan bahwa BCAT2 sangat penting untuk perkembangan kanker pankreas dengan memediasi katabolisme asam amino rantai cabang (BCAA). Lee dkk. menunjukkan bahwa defisiensi BCAT2 menghambat pertumbuhan tumor adenokarsinoma duktal pankreas (PDAC) dengan mengatur metabolisme lipid.[10] Meskipun ada beberapa penelitian yang mendokumentasikan bahwa BCAT2 secara langsung mempengaruhi proses biologis tumor dengan mengatur jalur terkait metabolisme, perannya dalam mengatur status kekebalan TME belum pernah dieksplorasi. Dalam penelitian kami, melalui analisis komprehensif terhadap indikator terkait TME dalam kelompok BLCA Xiangya dan beberapa kelompok BLCA publik, kami menyaring bahwa BCAT2 mungkin membentuk TME imunosupresif pada BLCA. Untuk mengeksplorasi mekanisme molekuler, kami selanjutnya melakukan sequencing RNA sel tunggal (siRNA seq) dan bulk-RNA seq, mengungkapkan bahwa BCAT2 memainkan peran represif dalam perekrutan CTL ke dalam TME, dengan menghambat aktivitas jalur sinyal terkait sitokin/kemokin dan Jalur sinyal kemotaksis sel T. Secara in vitro, multi-immunoassay menunjukkan bahwa sekresi kemokin terkait CTL memiliki korelasi negatif yang stabil dengan ekspresi BCAT2. Menurut analisis panorama jaringan mikroarray (TMA), kami menemukan hubungan yang saling eksklusif antara CTL dan sel tumor BCAT2+ dalam distribusi spasial. In vivo, efek kooperatif terungkap dalam terapi kombinasi kehilangan BCAT2 dan ICB. Lebih penting lagi, perannya dalam memperkirakan efek kuratif imunoterapi telah divalidasi dalam kohort imunoterapi Xiangya BLCA.
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh
2. Hasil
2.1. BCAT2 Berkorelasi Negatif dengan Imunitas Antikanker TME di BLCA
Pada sebagian besar jenis kanker, ekspresi BCAT2 lebih tinggi pada jaringan kanker dibandingkan pada jaringan normal (Gambar S1A, Informasi Pendukung) dan pola ekspresinya dalam BLCA divalidasi dalam Kelompok BLCA Xiangya (Gambar S1B, Informasi Pendukung). Selain itu, BCAT2 diekspresikan secara luas di berbagai lini sel kanker (Gambar S1C, Informasi Pendukung). Lebih lanjut, hasil analisis pan-kanker komprehensif pada sistem kemokin, MHC, imunostimulator dan TIIC menunjukkan bahwa BCAT2 memiliki efek imunosupresif yang signifikan pada beberapa jenis kanker, termasuk kanker kandung kemih (BLCA), kanker payudara (BRCA), sel papiler ginjal ginjal. karsinoma (KIRP), adenokarsinoma pankreas (PAAD), sarkoma (SARC) dan karsinoma tiroid (THCA) (Gambar S2A, B, Informasi Pendukung). Selain itu, korelasi negatif antara BCAT2 dan pos pemeriksaan imun penghambatan umum (PD- 1, PD-L1, CTLA-4, dan LAG-3) juga ditemukan (Gambar S2C–F, Informasi Pendukung ). Melalui analisis pan-kanker yang komprehensif, kami menemukan bahwa BCAT2 memiliki efek imunosupresif paling besar dibandingkan BLCA. Oleh karena itu, kami mengeksplorasi lebih jauh peran imunologisnya dalam BLCA. Berdasarkan nilai median ekspresi BCAT2, kami membagi individu menjadi kelompok BCAT2 tinggi dan kelompok BCAT2 rendah dalam kohort TCGA-BLCA. Jelasnya, serangkaian kemokin, reseptor kemokin, molekul terkait MHC, dan imunostimulator diekspresikan secara rendah pada kelompok BCAT2 tinggi dan diekspresikan secara berlebihan pada kelompok BCAT2 rendah (Gambar 1A). Hasil serupa ditemukan dalam siklus kekebalan kanker, yang mencakup beberapa langkah penting dalam merekrut dan menyusup ke sel kekebalan (Gambar 1B). Selain itu, kami menunjukkan hubungan negatif yang kuat antara tingkat infiltrasi sel imun (sel CD8+T, sel CD4+T, sel pembunuh alam (NK), dan sel dendritik (DC)) dan BCAT2 di tempat yang berbeda. algoritma (Gambar 1C). Demikian pula, ekspresi gen efektor sel imun yang lebih rendah (sel CD8+T, sel NK, Makrofag, sel T helper 1 (Th1), dan sel DC) ditemukan pada kelompok BCAT2 tinggi dibandingkan dengan kelompok BCAT2 rendah. kelompok (Gambar 1D). Lebih penting lagi, ketika BCAT2 dikorelasikan dengan skor TIS (Gambar S3, Informasi Pendukung) dan pos pemeriksaan kekebalan penghambatan (Gambar 1E), hubungan negatif yang jelas terlihat di antara keduanya. Oleh karena itu, kami berspekulasi bahwa BCAT2 dapat mengatur respon imun TME secara negatif dan sangat mempengaruhi kemanjuran imunoterapi. Selain itu, hasil di atas divalidasi dengan baik di sembilan kohort BLCA independen (GSE31684, GSE32894, GSE48075, GSE48276, GSE69795, GSE83586, GSE86411, GSE87304, dan GSE128702) (Gambar S4– S12, Informasi Pendukung). Akhirnya, kami memverifikasi kembali hubungan antara BCAT2 dan TME di Kelompok BLCA Xiangya. Secara konsisten, ekspresi BCAT2 memiliki hubungan negatif dengan aktivitas siklus kekebalan kanker, tingkat infiltrasi TIICs, skor TIS, dan tingkat ekspresi pos pemeriksaan kekebalan (Gambar 2A – C). Secara kolektif, kami mengungkapkan bahwa ekspresi BCAT2 yang tinggi membentuk TME yang tidak meradang di BLCA dan ekspresi BCAT2 yang rendah membentuk TME yang meradang di BLCA.
2.2. Menjelajahi Mekanisme BCAT2 dalam Membentuk TME dengan Bulk RNA-seq dan siRNA-seq
Dalam kohort TCGA-BLCA, DEG antara kelompok BCAT2 tinggi/rendah, kelompok skor imun tinggi/rendah, dan kelompok skor stroma tinggi/rendah diidentifikasi dan mengambil titik temu (Gambar S13A, Informasi Pendukung). Menariknya, DEG terkait positif BCAT2 tidak bersinggungan dengan DEG terkait positif skor imun dan stroma (Gambar 2D). Sementara itu, fenomena yang sama terjadi pada EG terkait negatif (Gambar S13B, Informasi Pendukung). Temuan ini menunjukkan bahwa BCAT2 mungkin secara negatif mengatur jalur terkait kekebalan tubuh. Secara kebetulan, hasil analisis GO dan KEGG mengungkapkan bahwa DEG terkait BCAT2-diperkaya paling signifikan dalam jalur migrasi leukosit, aktivasi sel T, dan interaksi sitokin-–sitokin reseptor (Gambar 2E, F). Oleh karena itu, kami berspekulasi bahwa BCAT2 membentuk TME yang tidak meradang di BLCA dengan menghambat aktivitas jalur terkait sitokin/kemokin. Namun, karakteristik pengurutan NA massal menentukan batasannya, yang tingkat ekspresi gennya dihitung berdasarkan nilai rata-rata seluruh sel dalam jaringan. Untuk mengatasi keterbatasan tersebut, siRNA dilakukan pada tiga sampel BLCA. Lebih dari 19 000 sel dianalisis dan diklasifikasikan ke dalam enam kategori: sel epitel, sel fibroblas, sel T/NK, sel endotel, sel B, dan sel myeloid (Gambar 3A), mengacu pada biomarker yang dikenal (EPCAM, LYZ, CD3D, COL1A1, CD79A, CD19, PECAM1, dan VWF). Yang mengejutkan, BCAT2 terutama diekspresikan dalam sel epitel (EPCAM+), dibandingkan sel endotel dan sel imun. Berdasarkan akumulasi CNV, sel epitel EPCAM+ dianggap sebagai sel urothelial ganas. Untuk memvalidasi pola ekspresi BCAT2, dua kohort siRNA eksternal dilibatkan dalam penelitian ini. Dalam kohort scRNA GSE135337, lebih dari 36,000 sel diproses dan dibagi menjadi lima kelompok, Subtipe sel BCAT2 yang terutama diekspresikan masih merupakan sel urothelial kandung kemih yang ganas (Gambar 3B). Pola ekspresi serupa muncul kembali pada kelompok siRNA GSE145137 (Gambar 3C). Oleh karena itu, pola ekspresi mayoritas pada sel ganas menyimpulkan bahwa BCAT2 bertindak sebagai bagian imunoregulator di TME terutama melalui berbagai karakteristik sel kanker. Berdasarkan tingkat ekspresi BCAT2, sel urothelial ganas dibagi menjadi kelompok BCAT2 tinggi dan kelompok BCAT2 rendah. Analisis GSEA terhadap istilah GO dalam kohort siRNA GSE135337 dan GSE145137 mengungkapkan bahwa sekelompok jalur terkait sitokin/kemokin secara signifikan diturunkan regulasinya pada kelompok BCAT2 tinggi, termasuk produksi kemokin, sekresi kemokin, regulasi jalur pensinyalan yang dimediasi kemokin, respons terhadap kemokin, pengikatan reseptor kemokin, aktivitas sitokin, pengikatan sitokin dan pengikatan reseptor sitokin (Gambar 3D – G; Gambar S14B, Informasi Pendukung). Sementara itu, kemotaksis leukosit, kemotaksis limfosit, kemotaksis sel T, dan jalur regulasinya memiliki korelasi negatif yang signifikan terhadap BCAT2 (Gambar 3E–I; Gambar S14A, Informasi Pendukung). Analisis GSEA terhadap istilah KEGG menunjukkan bahwa jalur interaksi reseptor sitokin-sitokin serta pemrosesan dan presentasi antigen jelas mengalami penurunan regulasi pada kelompok BCAT2 tinggi (Gambar 3F). Bersama-sama, ekspresi BCAT2 yang tinggi menekan aktivitas sitokin proinflamasi dan jalur terkait kemokin, yang menyebabkan penurunan tingkat infiltrasi TIIC, yang pada akhirnya membentuk TME non-inflamasi.
Gambar 1. BCAT2 berkorelasi negatif dengan kekebalan antikanker pada TME BLCA. A) Pola ekspresi kemokin, reseptor kemokin, molekul MHC, dan imunostimulator pada kelompok BCAT2 tinggi dan rendah. B) Aktivitas siklus imunitas kanker pada kelompok BCAT2 tinggi dan rendah. Tujuh warna mewakili tujuh langkah dalam siklus. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0,001. C) Korelasi antara BCAT2 dan beberapa jenis sel imun (sel CD8+T, sel CD4+T, sel DC, dan sel NK) dalam enam algoritma independen. D) Pola ekspresi beberapa subtipe sel imun (sel CD8+T, sel NK, Makrofag, sel Th1, dan sel DC) terkait gen efektor pada kelompok BCAT2 tinggi dan rendah. E) Korelasi antara gen efektor terkait BCAT2 dan ICB. Angka dalam lingkaran berarti koefisien korelasi.
Gambar 2. Validasi fungsi BCAT2 oleh kelompok Xiangya BLCA. A) Korelasi antara siklus imunitas BCAT2/kanker (kiri) dan BCAT2/TIICs (kanan). Garis padat dan putus-putus berarti hubungan positif dan negatif, ketebalan garis berarti koefisien korelasi, garis dengan warna berbeda mewakili nilai p korelasi. B) Korelasi antara gen efektor terkait BCAT2 dan ICB. C) Korelasi antara gen efektor terkait skor BCAT2 dan TIS. Angka dalam lingkaran melambangkan koefisien korelasi. D) Persimpangan BCAT2, skor imun dan skor stroma gen terkait positif. E,F) 20 jalur sinyal pengayaan teratas dari analisis GO dan KEGG pada gen terkait BCAT.
Gambar 3. Menjelajahi mekanisme BCAT2 dalam membentuk TME dengan bulk RNA-seq dan scRNA-seq. A, B) tSNE memplot pola ekspresi sel tunggal BCAT2 pada kohort Xiangya siRNA dan kohort GSE135337. C) Plot biola dari pola ekspresi sel tunggal BCAT2 dalam kelompok GSE145137. D, E) Analisis GSEA istilah GO menunjukkan aktivitas jalur terkait sitokin/kemokin dan jalur terkait kemotaksis sel imun antara kelompok BCAT2 yang berbeda dalam kohort GSE135337. F) Analisis GSEA istilah KEGG menunjukkan aktivitas presentasi antigen dan interaksi jalur reseptor sitokin dan sitokin antara kelompok BCAT2 yang berbeda dalam kohort GSE145137. G–I) Analisis GSEA istilah GO menunjukkan aktivitas jalur terkait sitokin/kemokin, jalur terkait kemotaksis sel imun, dan jalur terkait migrasi sel imun antara kelompok BCAT2 berbeda dalam kohort GSE145137. Analisis J, K) GO dan KEGG DEG antara garis sel BCAT2 OE dan BCAT2 KD.
2.3. BCAT2 Memvariasikan Pola Ekspresi Kemokin Terkait Sel T CD8+dan Menghambat Kapasitas Sitotoksik CTL
Untuk memvalidasi jalur pengayaan yang disebutkan di atas, ekspresi berlebih BCAT2 (BCAT2 OE) dan knockdown BCAT2 (BCAT2 KD) garis sel kanker kandung kemih manusia (T24)/murine (MB49) berhasil dibuat (Gambar S15A–D, Informasi Pendukung) dan diuji dengan sekuensing RNA throughput tinggi. Diharapkan, analisis GO terhadap garis sel T24 mengungkapkan bahwa DEG diperkaya secara signifikan dalam jalur pensinyalan yang dimediasi kemokin, respons terhadap kemokin, migrasi leukosit, dan migrasi leukosit (Gambar 3J). Analisis jalur KEGG dari garis sel T24 menunjukkan bahwa jalur pensinyalan kemokin, jalur interaksi sitokin-–sitokin reseptor, dan jalur kanker kandung kemih diperkaya secara signifikan (Gambar 3K). Demikian pula, beberapa jalur penting terkait sitokin/kemokin ditemukan dalam analisis GO dan KEGG dari garis sel MB49 (Gambar S16A, B, Informasi Pendukung). Tentu saja, berbagai sitokin dan kemokin memainkan peran penting dalam mengatur TME. Oleh karena itu, perlu dilakukan skrining terhadap sitokin/kemokin yang diatur secara khusus oleh BCAT2. Oleh karena itu, beberapa immunoassay ProcartaPlex diterapkan untuk mengidentifikasi variasi sekresi sitokin/kemokin dalam garis sel kanker kandung kemih manusia dan tikus. Yang mengejutkan, tingkat sekresi CCL3, CCL4, CCL5, dan CXCL10 diregulasi dalam garis sel BCAT2-KD manusia dan murine dan diturunkan regulasinya dalam garis sel BCAT2-OE manusia dan murine (Gambar 4A, B; Gambar S16C ,D, Informasi Pendukung). Dalam penelitian sebelumnya, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, dan CXCL10 dianggap sebagai kemokin penting untuk merekrut sel T CD8+ke dalam TME.[12] Oleh karena itu, untuk analisis yang lebih komprehensif terhadap kemokin terkait sel T CD8+, semuanya dimasukkan untuk validasi lebih lanjut. Yang mengejutkan, tingkat ekspresi RNA CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, dan CXCL10 secara signifikan diturunkan regulasinya dalam sel BCAT2 OE dan secara signifikan diregulasi dalam sel BCAT2 KD (Gambar 4C). Demikian pula, hasil ELISA menunjukkan bahwa kadar protein yang disekresi juga memiliki korelasi negatif dengan ekspresi BCAT2 (Gambar 4D). Temuan ini menunjukkan bahwa ekspresi berlebih BCAT2 menghambat tingkat transkriptom dan protein kemokin terkait sel T CD8+, termasuk CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, dan CXCL10. Lebih penting lagi, uji kemotaksis mengungkapkan bahwa garis sel BCAT2 OE secara signifikan menghambat kemampuan kemotaksis sel T CD8+ (Gambar 4E, kiri). Sebaliknya, supernatan sel dari garis sel BCAT2 KD mampu menarik lebih banyak sel CD8+T dibandingkan kontrol negatifnya (Gambar 4E, kanan). Temuan ini menunjukkan bahwa BCAT2 dapat memengaruhi kapasitas kemotaksis sel T CD8+dengan mengatur tingkat mRNA dan protein dari kemokin terkait. Selain itu, uji pembunuh sel kanker yang dimediasi sel T digunakan untuk mengeksplorasi variasi sitotoksisitas sel T setelah kontak langsung dengan sel tumor yang mengekspresikan tingkat BCAT2 yang berbeda. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4F dan Gambar S17A, B (Informasi Pendukung), ekspresi berlebih BCAT2 pada sel tumor secara langsung menekan fungsi sitotoksik sel T dan penghancuran BCAT2 pada sel tumor secara signifikan membalikkan kecenderungan tersebut. Analisis aliran sitometri sel T yang dikumpulkan menemukan bahwa proporsi sel T CD8+TNF-𝛼+ dan sel T CD8+IFN-𝛾+ memiliki perbedaan yang signifikan dalam sistem budidaya yang berbeda, yang berarti terjadi perubahan besar dalam sistem budidaya. aktivitas sel T CD8+ (Gambar 4G; Gambar S17C, D, Informasi Pendukung). Secara kolektif, BCAT2 mampu menghambat kemampuan rekrutmen sel T CD8+dengan mengatur tingkat kemokin terkait serta menekan aktivitas CTL melalui kontak langsung. Selain itu, hasil uji pembunuhan sel kanker yang dimediasi sel T (tanpa kelompok sel T) dapat menyimpulkan bahwa BCAT2 memainkan peran onkogenik dalam kanker kandung kemih. Oleh karena itu, uji koloni lempeng dan uji migrasi/invasi transwell digunakan untuk memvalidasi hipotesis ini. Seperti yang diantisipasi, ekspresi BCAT2 yang berlebihan secara signifikan meningkatkan kemampuan proliferasi, migrasi, dan invasi sel tumor, dan knockdown BCAT2 secara nyata menekan perilaku ini (Gambar S18A–F, Informasi Pendukung).
2.4. Validasi Hubungan Spasial Eksklusif antara Sel Tumor BCAT2+ dan Sel CD8+T oleh TMA dari Xiangya BLCA Cohort
Berdasarkan hasil percobaan RNA-seq, scRNA-seq, dan vitro massal, kami menunjukkan bahwa BCAT2 memainkan peran imunosupresif dalam BLCA dengan menekan rekrutmen dan sitotoksisitas sel T CD8+. Namun, interaksi sel tumor BCAT2+ dan sel T CD8+masih belum diketahui pada tingkat jaringan manusia. Dalam kelompok BLCA Xiangya, gambar yang mewakili dan skor keseluruhan IHC menunjukkan korelasi negatif antara BCAT2 dan CD8 (R=−0.38, p=0.0 038) (Gambar 5A,B). Pewarnaan IF multiwarna sel tumor BCAT2+ (BCAT2+CK19+) dan sel T BCAT2+CD8+ dilakukan dalam TMA dan dianalisis secara semi-otomatis menggunakan Platform kuantifikasi panorama TissueFAXS. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5C, cakupan ekspresi BCAT2 dan CK19 sebagian besar tumpang tindih. Sebaliknya, cakupan ekspresi BCAT2 dan CD8 berbeda dan terpisah. Proporsi koekspresi rinci sel BCAT2+CK19+ dan sel T BCAT2+CD8+ adalah 87,29% dan 5,09% (Gambar 5D, E), yang konsisten dengan pola ekspresi BCAT2 di scRNA-seq. Secara keseluruhan TMA, masih terdapat perbedaan signifikan dalam proporsi ekspresi bersama di antara keduanya (Gambar S19A, Informasi Pendukung). Lebih penting lagi, dalam analisis gradien jarak multidimensi (0–25, 25–50, 50–100, dan 100–150 μm) di sekitar sel tumor BCAT2+, jumlah sel T CD8+secara bertahap meningkat dari dekat ke jauh (Gambar 5F; Gambar S19B, Informasi Pendukung). Bersama-sama, kami menunjukkan bahwa pada tingkat jaringan manusia, BCAT2 juga sebagian besar diekspresikan dalam sel tumor, dan sel tumor BCAT2+ memiliki hubungan spasial eksklusif dengan sel CD8+T.
Manfaat cistanche tubulosa-Antitumor
2.5. Hilangnya BCAT2 Meningkatkan Kemanjuran Terapi Anti-PD-1
Dengan dampak yang sangat merugikan pada TME dan korelasi negatif yang erat dengan blokade pos pemeriksaan penghambatan, hal ini membangkitkan minat besar untuk mengeksplorasi efek sinergis dari hilangnya BCAT2 dan pengobatan anti-PD- 1. Menjelang imunoterapi, model kanker kandung kemih subkutan dibangun oleh BCAT2 KD dan mengontrol garis sel murine. Kemudian, terapi anti-PD-1 dan terapi kontrol diterapkan pada tikus yang mengandung tumor (Gambar 6A). Konsisten dengan peran onkogenik dan mekanisme regulasi pada kemokin in vitro, defisiensi BCAT2 menghambat pertumbuhan tumor dan memperpanjang waktu kelangsungan hidup in vivo, dengan meningkatkan regulasi kemokin terkait CD8+T (Gambar 6B–E; Gambar S20A, Informasi Pendukung). Dalam aspek kemanjuran imunoterapi, meskipun monoterapi anti-PD-1 dapat mengurangi sebagian beban tumor, pengobatan bersama dengan BCAT2 KD dan antibodi monoklonal anti-PD-1 (mab) menunjukkan efek penekanan tumor yang lebih baik dan memberikan hasil yang lebih baik. manfaat kelangsungan hidup. Pada hari yang dijadwalkan, tumor diambil dan dipersiapkan untuk analisis lebih lanjut. Sebagian darinya dicerna menjadi suspensi sel tunggal dan dilakukan analisis aliran sitometri. Dengan populasi leukosit dan sel T yang serupa (Gambar S20B–E, Informasi Pendukung) pada tumor, proporsi sel T CD8+yang lebih tinggi ditunjukkan pada kelompok defisiensi BCAT2 dibandingkan pada kelompok kontrol negatif. Demikian pula, kelompok terapi kombinasi memiliki infiltrasi CTL yang lebih masif dibandingkan kelompok monoterapi (Gambar 6F–H). Lebih penting lagi, indikator sitotoksisitas (GZMB, IFN-𝛾, TNF-𝛼, dan Perforin) dari CTL juga diperkuat pada tumor murine dengan kehilangan BCAT2 dan pengobatan kombinasi dibandingkan dengan kontrol yang sesuai (Gambar 6G, I – L). Bagian lain dari tumor dibuat menjadi bagian beku dan dilakukan pewarnaan IF. Seperti yang diharapkan, kepadatan sel T CD8+di wilayah yang diminati (ROI) menunjukkan kecenderungan yang sama dengan analisis aliran sitometri (Gambar 6M, N). Temuan ini menunjukkan bahwa defisiensi BCAT2 pada sel tumor dapat membentuk TME yang meradang dan memiliki kemanjuran yang besar dalam pengobatan imunoterapi. Untuk mengetahui peran sel T CD8+dalam efek sinergis dari pengobatan bersama, CD8𝛼 mab diaplikasikan untuk memusuhi sel tersebut pada tikus yang memiliki kompetensi imun (Gambar S21A, Informasi Pendukung) dan memvalidasi efek penipisannya dengan flow cytometry dan IF (Gambar S21B, C, Informasi Pendukung). Jelasnya, setelah penipisan, beban tumor dan waktu kelangsungan hidup terbalik secara signifikan (Gambar S21D – G, Informasi Pendukung). Temuan ini menunjukkan bahwa sel T CD8+memainkan peran yang sangat diperlukan dalam efek sinergis terapi kombinasi.
Gambar 4. BCAT2 memvariasikan pola ekspresi kemokin terkait sel T CD8+dan menghambat kapasitas sitotoksik CTL. A,B) Peta panas dari beberapa immunoassay ProcartaPlex menampilkan variasi sekresi sitokin dan kemokin umum pada BCAT2 OE, BCAT2 KD dan kelompok kontrol negatif (n=3 per kelompok). C,D) Histogram menunjukkan tingkat ekspresi mRNA yang dinormalisasi dan konsentrasi sekresi protein CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, dan CXCL10 pada BCAT2 OE (kiri), BCAT2 KD (kanan) dan kelompok kontrol negatif (n {{ 15}} per grup). *p < 0.{{20}}5; **p < 0.01; ***p < 0,001. E) Uji kemotaksis menunjukkan perbedaan kemampuan kemotaksis CTL pada kelompok BCAT2 OE, BCAT2 KD, dan kontrol negatif (n=3 per kelompok). *p <0,05; **p <0,01. F) Uji pembunuhan sel kanker yang dimediasi sel T menunjukkan perbedaan kemampuan membunuh sel T yang dikolaborasikan dengan BCAT2 OE, BCAT2 KD, dan garis sel kontrol negatif (n=3 per kelompok). G) Analisis aliran sitometri menunjukkan aktivitas sel T CD8+yang berbeda dalam kelompok kultur yang berbeda (n=3 per kelompok).
Gambar 5. Validasi hubungan spasial eksklusif sel tumor BCAT2+ dan sel T CD8+oleh TMA kohort Xiangya BLCA. A) Citra IHC BCAT2 dan CD8 pada TME tipe inflamasi dan non inflamasi. Bilah skala: 50 μm. B) Korelasi antara BCAT2 dan CD8 berdasarkan skor IHC pada TMA secara keseluruhan. C) Gambar IF multiwarna BCAT2, CK19, CD8, dan indeks kombinasi pada TME tipe inflamasi dan noninflamasi. Sel BCAT2+ (merah muda), sel CK19+ (cyan), sel CD8+T (oranye), dan inti sel (biru). Bilah skala: 50 μm. D,E) Tingkat koekspresi terperinci sel BCAT2+CK19+ dan BCAT2+CD8+ dalam sampel tipikal. F) Analisis gradien jarak (0–25, 25–50, 50–100, dan 100–150 μm) sel CD8+T di sekitar sel BCAT2+CK19+ pada umumnya Sampel.
Gambar 6. Hilangnya BCAT2 meningkatkan kemanjuran terapi anti-PD-1. A) Diagram alir rencana perawatan. B) Tumor yang diambil dari rejimen terapi yang berbeda (n=5 per kelompok). C – E) Kuantifikasi volume tumor, berat badan, dan waktu kelangsungan hidup dalam rejimen terapi yang berbeda (n=5 per kelompok). ns: tidak penting; *P< 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. F) Contour plots indicate the proportion of CD8+T cells; G) proportions of GZMB+CD8+T cells, IFN-𝛾+CD8+T cells, TNF- 𝛼+CD8+T cells, and Perforin+CD8+T cells in different therapy regimens. H) Quantified scatter plots exhibit proportion of CD8+T cells; I–L) proportions of GZMB+ CD8+T cells, IFN-𝛾+ CD8+T cells, TNF-𝛼+ CD8+T cells, and Perforin+ CD8+T cells in different therapy regimens (n = 5 per group). ns: no significance; *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. M, N) IF image and quantified histogram show densities of CD8+T cells in different therapy regimens (n = 3 per group). Scale bar: 20 μm. CD8+T cell (green) and cell nucleus (blue). ns: no significance, *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.
Selain itu, selain sel tumor, sebagian kecil BCAT2 juga diekspresikan dalam sel T CD{1}}. Oleh karena itu, kami mengeksplorasi lebih jauh apakah perbedaan tingkat ekspresi BCAT2 pada sel T CD8+dapat memengaruhi aktivitasnya. Setelah pewarnaan suspensi sel tunggal limpa murine dengan antibodi fluoresen terkait sel BCAT2 dan T, kami membandingkan proporsi sel CD8+ TNF-𝛼+T dan CD8+ IFN-𝛾+T antara BCAT Grup 2+CD8+ dan BCAT2−CD8+. Menariknya, kami menemukan bahwa proporsinya serupa antara kedua kelompok, mengungkapkan bahwa aktivitas sel T CD8+tidak bergantung pada tingkat ekspresi BCAT2 (Gambar S22A–C, Informasi Pendukung).
2.6. BCAT2 Memprediksi Respon terhadap Imunoterapi di Beberapa Kelompok Imunoterapi Dunia Nyata
Temuan di atas telah menunjukkan peran imunosupresif BCAT2 pada TME dan efek sinergis dari kombinasi hilangnya BCAT2 dengan terapi anti-PD-1. Namun, potensi prediksi kemanjuran imunoterapi masih belum jelas. Oleh karena itu, dalam kelompok TCGA-BLCA, skor pengayaan jalur terkait imunoterapi dibandingkan antara kelompok BCAT2 tinggi dan rendah. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar S23A (Informasi Pendukung), kelompok BCAT2 rendah memiliki gen yang lebih aktif dalam jalur terkait imunoterapi, yang dapat menyimpulkan bahwa ekspresi BCAT2 yang rendah menunjukkan keadaan yang lebih sensitif terhadap imunoterapi. Untuk validasi lebih lanjut, 58 pasien kanker kandung kemih invasif otot (MIBC) yang menerima terapi anti-PD neoadjuvan di rumah sakit kami diikutsertakan dalam kelompok imunoterapi Xiangya BLCA. Gambar IHC, IF, dan CT yang representatif dari responden dan nonresponder menyiratkan bahwa tingkat ekspresi BCAT2 memiliki hubungan erat dengan kemanjuran imunoterapi—individu dengan tingkat ekspresi BCAT2 rendah lebih mungkin merespons imunoterapi dibandingkan individu dengan tingkat ekspresi BCAT2 yang rendah. tingkat ekspresi BCAT2 yang tinggi (Gambar 7A – C). Selain itu, skor IHC dari kelompok imunoterapi Xiangya BLCA dan matriks ekspresi mRNA dari kelompok IMvigor210 menunjukkan korelasi negatif yang kuat antara BCAT2 dan PD-L1 (R=−{{3{{32} }}}.4, p=0.002; R=−0.41, p < 0.001) (Gambar S23B, C, Informasi Pendukung). Oleh karena itu, kami secara langsung membandingkan kemanjuran imunoterapi antara kelompok BCAT2 tinggi dan rendah dalam kohort imunoterapi BLCA Xiangya dan menemukan bahwa kelompok BCAT2 rendah memiliki proporsi responden yang jauh lebih tinggi dibandingkan kelompok BCAT2 tinggi (p=0.001) (Gambar 7D). Selain itu, kami menilai nilai prediksi BCAT2, PD-L1, dan indeks kombinasi (BCAT2+PD-L1) pada respons patologis terhadap imunoterapi dan menemukan kinerja yang luar biasa dari indeks kombinasi (BCAT2+PD-L1) L1) pada akurasi prediksi (Gambar 7E). Menariknya, dalam aspek hasil kelangsungan hidup, kelompok BCAT2 yang rendah memiliki kelangsungan hidup bebas penyakit (DFS) yang lebih lama dibandingkan kelompok BCAT2 yang tinggi (p=0.032) (Gambar 7F), yang menunjukkan nilai prognosis BCAT2 di imunoterapi BLCA. Secara klinis, individu dengan TME gurun lebih cenderung memiliki kemanjuran imunoterapi yang terbatas dibandingkan individu dengan TME yang meradang, yang lebih lanjut menyoroti pentingnya indikator perkiraan. Akibatnya, kami memilih semua individu dengan TME gurun dalam kelompok IMvigor210 dan melakukan penilaian komprehensif. Dalam perbandingan langsung tingkat ekspresi BCAT2 di antara kelompok respons yang berbeda, kelompok CR (responden) memiliki tingkat ekspresi BCAT2 yang jauh lebih rendah dibandingkan kelompok SD dan PD (nonresponder) (Gambar 7G). Yang lebih penting lagi, indeks kombinasi (BCAT2+PD-L1) juga memiliki performa luar biasa dalam akurasi prediksi (Gambar 7H). Meskipun tidak ada perbedaan yang signifikan dalam kelangsungan hidup keseluruhan (OS) antara kelompok BCAT2 tinggi dan rendah pada kohort IMvigor210 tipe gurun, kecenderungan prognosis masih serupa dengan hasil kohort imunoterapi Xiangya BLCA (Gambar 7I). Selain PD-L1, ketidakstabilan mikrosatelit (MSI) adalah prediktor penting lainnya mengenai kemanjuran imunoterapi. Status perbaikan ketidakcocokan (MMR)— MMR mahir (pMMR) dan MMR defisiensi (dMMR) tetap sesuai dengan MSI frekuensi rendah (MSI-L) dan MSI frekuensi tinggi (MSI-H).[13] Oleh karena itu, kami melakukan evaluasi komprehensif terhadap semua individu dalam kelompok imunoterapi Xiangya BLCA berdasarkan hasil pewarnaan empat gen penanda MMR (MLH1, MSH2, MSH6, dan PMS2). Hasilnya menunjukkan proporsi dMMR (MSI-H) yang jauh lebih tinggi pada kelompok BCAT2 rendah dibandingkan dengan kelompok BCAT2 tinggi (p=0.02) (Gambar S23D, E, Informasi Pendukung). Selain itu, kami mengevaluasi nilai prediksi MMR, BCAT2, dan indeks kombinasi (MMR+BCAT2) pada kemanjuran imunoterapi dan menemukan bahwa indeks kombinasi (MMR+BCAT2) memiliki kinerja yang memenuhi syarat dalam akurasi prediksi (Gambar S23F, Informasi Pendukung). Bersama-sama, temuan ini menunjukkan bahwa BCAT2 memenuhi syarat untuk bertindak sebagai prediktor pelengkap kemanjuran imunoterapi BLCA. Terakhir, nilai prediktif BCAT2 dalam respons terhadap imunoterapi dieksplorasi pada berbagai jenis kanker. Kami menemukan bahwa individu dengan ekspresi BCAT2 yang tinggi menunjukkan tingkat respons yang jauh lebih buruk (p=0.04) pada kelompok GSE35640 (melanoma) (Gambar 7J). Meskipun tidak ada perbedaan yang signifikan dalam tingkat respons antara kelompok BCAT2 tinggi dan rendah pada GSE173839 (kanker payudara), GSE135222 (NSCLC), dan kohort Gide 2019 (melanoma), pasien dengan ekspresi BCAT2 rendah masih lebih cenderung mendapatkan respons positif. untuk imunoterapi (Gambar 7K – M).
cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh
Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Meningkatkan Imunitas
【Minta lebih lanjut】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikasi WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2.7. Nilai BCAT2 dalam Peramalan Subtipe Molekuler dan Panduan Terapi Presisi
Dengan heterogenitas besar yang ada dalam klasifikasi histologi tradisional, semakin banyak bukti menunjukkan bahwa subtipe molekuler mampu memberikan klasifikasi yang lebih akurat berdasarkan profil transkriptome di BLCA.[14] Selain itu, dengan karakteristik imunologi serupa pada subtipe yang sama, klasifikasi molekuler memiliki potensi besar untuk memprediksi TME dan memandu terapi presisi secara klinis.[15] Melalui analisis komprehensif sistem subtipe molekuler yang berbeda dalam kohort TCGA-BLCA, kami menemukan bahwa individu dengan ekspresi BCAT2 yang rendah lebih cenderung diklasifikasikan ke dalam subtipe basal, disertai dengan jalur aktif diferensiasi basal, diferensiasi EMT, diferensiasi imun, respon interferon, dan seterusnya. Individu dengan ekspresi BCAT2 yang tinggi terutama diklasifikasikan ke dalam subtipe luminal, disertai dengan jalur aktif diferensiasi luminal, diferensiasi urothelial, dan Ta (Gambar S24A, Informasi Pendukung). Menurut konsensus subtipe molekuler, subtipe basal memiliki tingkat infiltrasi limfosit efektor yang lebih banyak dan jalur pensinyalan IFN-𝛾 yang lebih aktif dibandingkan subtipe luminal,[16] yang menyiratkan kemanjuran imunoterapi yang lebih baik. Kemudian, AUC digunakan untuk mengevaluasi keakuratan prediksi. Hebatnya, kecuali sistem subtipe Baylor (AUC=0.76), sebagian besar AUC berada di luar 0.90 di sistem lain (Gambar S24B, Informasi Pendukung), yang berarti akurasi prediksi BCAT2 yang kuat di subtipe molekuler. Untuk mengeksplorasi lebih jauh perannya dalam memprediksi kemanjuran terapi lain, kami membandingkan aktivitas terapi target reseptor faktor pertumbuhan epidermal (EGFR) dan jalur terkait radioterapi antara kelompok BCAT2 tinggi dan rendah. Dengan peningkatan aktivitas yang jelas, pasien dalam kelompok BCAT2 rendah lebih cenderung memiliki respons positif terhadap terapi target EGFR dan radioterapi (Gambar S24C, Informasi Pendukung). Untuk meningkatkan keandalan prediksi pada subtipe molekuler dan sensitivitas pengobatan, delapan kohort BLCA (kohort Xiangya BLCA, GSE31684, GSE69795, GSE48075, GSE128702, GSE83586, GSE52329, dan E-MTAB-1803) dan satu kohort imunoterapi BLCA (IMvigor210) digunakan diterapkan untuk validasi eksternal. Selain akurasi prediksi yang sangat baik, temuan serupa juga ditemukan pada kelompok ini (Gambar S25–S27, Informasi Pendukung). Penyakit hiperprogresif (HPD) adalah keadaan yang sangat tidak sensitif terhadap imunoterapi. Untuk mengeksplorasi pengaruh BCAT2 pada HPD, biomarker terkait HPD dikumpulkan dari penelitian sebelumnya dan CNV biomarker dibandingkan antara kelompok BCAT2 rendah dan tinggi. Kecuali untuk EGFR, tingkat amplifikasi CNV dari biomarker terkait HPD-positif lainnya (simbol merah) lebih tinggi pada kelompok BCAT2 tinggi, terutama MDM2 (p=0.0116). Tingkat penghapusan CNV dari biomarker terkait HPD-negatif (simbol hijau) lebih rendah pada kelompok BCAT2 tinggi (Gambar S24D, Informasi Pendukung). Hasilnya menunjukkan bahwa pasien dengan ekspresi BCAT2 yang tinggi mempunyai potensi risiko HPD selama imunoterapi. Kemoterapi neoadjuvan (NAC) adalah terapi penting dalam BLCA. Penanda yang memperkirakan respons terhadap NAC di BLCA dikumpulkan dari tinjauan Buttigliero dkk.[18] dan tingkat mutasinya dibandingkan antara kedua kelompok. Berdasarkan tingkat mutasi biomarker keseluruhan yang lebih tinggi dan mutasi RB1 yang lebih sering pada kelompok BCAT2 rendah, kami berspekulasi bahwa individu dengan ekspresi BCAT2 rendah memiliki kemanjuran NAC yang lebih baik secara klinis (Gambar S24E, Informasi Pendukung). Oleh karena itu, database Drugbank digunakan untuk membandingkan kemanjuran beberapa rejimen kemoterapi yang umum antara dua kelompok dan menemukan bahwa individu dengan ekspresi BCAT2 yang rendah lebih mungkin merespons kemoterapi. Selain itu, kelompok BCAT2 rendah juga menunjukkan kemanjuran yang lebih baik dalam rejimen umum imunoterapi dan terapi ERBB. Tanpa diduga, pasien dengan ekspresi BCAT2 yang tinggi mungkin memperoleh efek kuratif yang lebih baik dalam terapi antiangiogenik (Gambar S24F, Informasi Pendukung). Secara kolektif, individu dengan ekspresi BCAT2 yang rendah termasuk dalam subtipe molekuler yang meradang, subtipe basal, yang berarti respons yang lebih positif terhadap imunoterapi, kemoterapi, radioterapi, terapi target EGFR, dan terapi ERBB. Sayangnya, pasien dengan ekspresi BCAT2 yang tinggi mempunyai respon yang buruk terhadap pengobatan ini. Namun, terapi antiangiogenik mungkin bisa menjadi petunjuk bagi mereka.
Gambar 7. BCAT2 memprediksi respons terhadap imunoterapi di beberapa kelompok imunoterapi di dunia nyata. A) Gambar IHC BCAT2 dan PD-L1 antara responden dan nonresponden dalam kelompok imunoterapi Xiangya BLCA. Bilah skala: 50 μm. B) Gambar IF multiwarna BCAT2 dan PD-L1 antara responden dan nonresponden pada kohort imunoterapi Xiangya BLCA. Bilah skala: 50 μm. Sel BCAT2+(hijau), sel PD-L1+(kuning), dan inti sel (biru). C) Gambar CT perbedaan efikasi imunoterapi antara individu dengan tingkat ekspresi BCAT2 tinggi dan rendah. Panah merah menunjuk ke area tumor. D) Perbedaan keseluruhan tingkat respons antara kelompok BCAT2 tinggi dan rendah pada kelompok imunoterapi Xiangya BLCA. E) Akurasi prediksi BCAT2, PD-L1, dan indeks kombinasi (BCAT2+PD-L1) terhadap respon imunoterapi pada kohort imunoterapi Xiangya BLCA. F) Perbedaan kelangsungan hidup bebas penyakit (DFS) antara kelompok BCAT2 tinggi dan rendah pada kohort imunoterapi Xiangya BLCA. G) Perbedaan tingkat ekspresi BCAT2 pada kelompok CR, PR, SD, dan PD pada kelompok IMvigor210 tipe gurun. *p <0,05; ns: tidak penting. H) Keakuratan prediksi BCAT2, PD-L1, dan indeks kombinasi (BCAT2+PD-L1) terhadap respons terhadap imunoterapi pada kohort IMvigor210 tipe gurun. I) Perbedaan kelangsungan hidup keseluruhan (OS) antara kelompok BCAT2 tinggi dan rendah dalam kohort IMvigor210 tipe gurun. J–M) Perbedaan respon imunoterapi antara kelompok BCAT2 tinggi dan rendah pada kohort GSE35640, GSE173839, GSE135222, dan Gide2019.
3. Diskusi
Sebagai enzim kunci dalam proses katabolisme BCAA, penelitian sebelumnya terutama berfokus pada peran BCAT2 yang berhubungan dengan metabolisme dalam penyakit, seperti obesitas, diabetes, dan aritmia. Ma dkk. menunjukkan bahwa menghilangkan BCAT2 di jaringan adiposa dapat mempercepat pencoklatan adiposa dan termogenesis, yang menyebabkan penurunan tingkat obesitas pada tikus.[19] Melalui pendeteksian sampel darah lebih dari 2000 orang, Gerszten et al. menggambarkan profil metabolit terkait diabetes dan menemukan bahwa BCAT2-mengubah BCAA memainkan peran penting dalam perkembangan penyakit.[20] Portero dkk. mengungkapkan bahwa mutasi BCAT2p.Q300*/p.Q300* yang tidak masuk akal mengakibatkan peningkatan kadar BCAA dan menyebabkan aritmia pada tikus.[21] Baru-baru ini, beberapa penelitian menemukan bahwa BCAT2 memiliki hubungan erat dengan kanker. Lei dkk. mengungkapkan bahwa degradasi BCAT2 yang dimediasi asetilasi dapat menghambat perkembangan adenokarsinoma duktal pankreas (PDAC) dengan menurunkan regulasi tingkat metabolisme BCAA. Wang dkk. menganggap bahwa tingkat transkripsi BCAT2 yang terkendali menyebabkan penurunan tingkat glutamat intraseluler, yang merangsang ferroptosis sel hepatoma.[23] Namun, semua penelitian yang ada menekankan pengaruh katabolisme BCAA yang dimediasi BCAT pada proses biologis kanker daripada mengeksplorasi mekanisme baru. Dalam penelitian ini, kami mengungkapkan peran imunosupresif BCAT2 pada TME untuk pertama kalinya. Penerapan imunoterapi mengubah pengobatan kanker, dengan kualitas hidup yang luar biasa dan masa kelangsungan hidup yang lebih lama. Meskipun demikian, karena heterogenitas sistem kekebalan tumor, hanya sebagian orang yang memperoleh kemanjuran yang memuaskan. TME adalah sistem yang rumit, terdiri dari sel tumor, sel imun, sel stroma, dan kapiler.[24] Menurut tingkat infiltrasi CTL, TME dapat diklasifikasikan menjadi tipe inflamasi dan non inflamasi secara umum.[25] Semakin banyak bukti menunjukkan bahwa TME yang meradang memainkan peran positif dalam memunculkan respons imun antitumor yang efektif selama terapi.[26] Oleh karena itu, kami menganalisis secara komprehensif beberapa indikator terkait TME dan menemukan bahwa ekspresi BCAT2 yang tinggi membentuk TME yang tidak meradang, dengan siklus kekebalan kanker yang terhambat, pola ekspresi profil kemokin yang represif, molekul MHC, dan tingkat infiltrasi TIIC yang tidak mencukupi. Selain itu, BCAT2 berhubungan negatif dengan TIS dan gen efektor ICB, yang berarti bahwa individu dengan ekspresi BCAT2 yang tinggi cenderung tidak memberikan respons terhadap imunoterapi. Untuk memvalidasi hipotesis kami, kami membandingkan tingkat respons antara kelompok BCAT2 tinggi dan rendah dalam kelompok imunoterapi Xiangya BLCA dan kelompok imunoterapi lainnya. Yang mengejutkan, terdapat perbedaan yang signifikan pada beberapa kelompok, yang menunjukkan bahwa BCAT2 juga mampu berperan sebagai prediktor kemanjuran imunoterapi, terutama pada BLCA. Lebih lanjut, scRNA-seq digunakan untuk mengeksplorasi mekanisme pengaturan BCAT2 di TME dan menunjukkan bahwa aktivitas jalur pensinyalan terkait sitokin/kemokin, jalur pensinyalan kemotaksis sel T, dan jalur pensinyalan migrasi sel T memiliki korelasi negatif yang signifikan dengan BCAT2. Sebagai jaringan regulasi yang penting, sitokin dan kemokin sangat diperlukan untuk memperdagangkan berbagai sel kekebalan ke TME. Sistem kemokin memiliki empat superfamili: C, CC, CXC, dan CX3C, dengan redundansi yang cukup besar pada pasangan ligan dan reseptor.[27] Sitokin dapat dibagi menjadi subfamili Th1, Th2, dan Th17 berdasarkan fungsi biologisnya.[28] Melalui sekresi berbagai tingkat sel tersebut, pergulatan antara sel tumor dan sel kekebalan sudah cukup untuk memprogram ulang karakteristik TME.[29] Meskipun demikian, di antara sejumlah besar sitokin dan kemokin, penting untuk menyaring kelompok yang paling berharga. Dengan menggunakan panel immunoassay sitokin dan kemokin, kami mengungkapkan bahwa kemokin termasuk CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9, dan CXCL10, berkorelasi negatif kuat dengan ekspresi BCAT2 dalam sel kanker kandung kemih manusia dan murine. Diketahui bahwa CXCL9 dan CXCL10 bertanggung jawab merekrut sel T CD8+ke dalam TME.[30] Untuk memastikan fungsi CCL3, CCL4, dan CCL5, kami melihat penelitian sebelumnya. Harlin dkk. memanfaatkan susunan protein dan qPCR untuk mengungkap bahwa peningkatan regulasi CCL3, CCL4, dan CCL5 mampu mendorong migrasi sel T CD8+ke dalam melanoma.[31] Noman dkk. menemukan bahwa peningkatan populasi sekresi CCL5 membantu pembentukan TME proinflamasi dengan memperdagangkan CTL ke jaringan kanker kolorektal.[32] Melalui IHC dan RNA-seq profil kemokin dalam berbagai kelompok, Romero et al. menunjukkan bahwa CCL4 dan CCL5 memiliki hubungan yang kuat dengan tingkat infiltrasi sel T CD8+pada kanker pankreas.[33] Oleh karena itu, kami menganggap bahwa kemokin terkait sel T CD8+adalah kemokin utama yang diatur oleh BCAT2 pada kanker kandung kemih. Meskipun kami menunjukkan korelasi negatif yang kuat antara kemokin terkait sel BCAT2 dan CD8+T, mekanisme pengaturan yang mendasari keduanya masih perlu dieksplorasi lebih lanjut. Studi Peterson dkk. menunjukkan bahwa aktivasi jalur pensinyalan MAP kinase (MAPK) dapat menginduksi produksi CX3CL1.[34] Xu dkk. mengungkapkan bahwa jalur pensinyalan JAK-STAT mengatur sekresi kemokin terkait Th, menyebabkan penurunan tingkat infiltrasi TIL.[35] Baru-baru ini, Peng dkk. menemukan bahwa demetilase JMJD3 dapat menghambat ekspresi kemokin terkait CD4+T dan mengurangi tingkat infiltrasi sel T sitotoksisitas di TME, yang mewakili peran penting modifikasi epigenetik dalam mengatur ekspresi kemokin.[36] Mayo dkk. juga mengungkapkan bahwa penghambat epigenetik, histone deacetylase 1, memiliki kapasitas besar untuk menekan ekspresi CXCL8 melalui aktivasi jalur pensinyalan faktor nuklir-𝜅B (NF-𝜅B). Selain itu, sebagai simbol metabolisme sel tumor, glikolisis aerobik, dan spesies oksigen reaktif (ROS), menunjukkan kinerja luar biasa dalam menginduksi ekspresi CXCL8 dan CXCL14 dengan meningkatkan aktivitas jalur pensinyalan NF-𝜅B dan protein penggerak faktor transkripsi 1 (AP{{93 }}).[38] Menariknya, dalam penelitian kami, jalur pensinyalan NF-𝜅B, STAT, dan MAPK diperkaya secara signifikan antara garis sel BCAT2 tinggi dan rendah (Gambar 3K; Gambar S16A, B, Informasi Pendukung). Oleh karena itu, dengan menggabungkan penelitian di atas, kami akan mengeksplorasi lebih jauh molekul kunci dalam mekanisme regulasi kemokin terkait BCAT2 dan CD{100}}T. Tingkat respons objektif yang terbatas terhadap monoterapi dengan ICB mendorong munculnya strategi terapi kombinasi. Untuk mengubah TME nonimunologis menjadi TME imunologis, Wolchok dkk. menerapkan pengobatan bersama nivolumab (terapi anti-PD{103}}) dan ipilimumab (terapi anti-CTLA{105}}) pada pasien dengan melanoma dan menemukan efek kuratif yang menggembirakan, yang dianggap berasal dari peningkatan priming, aktivasi, dan penghentian CTL yang sinkron .[39] Lebih dari sekadar menggabungkan dengan ICB jenis lain, kemoterapi plus imunoterapi adalah pilihan terapi alternatif. Sebagai rejimen pengobatan lini pertama untuk karsinoma urothelial stadium lanjut, beberapa penelitian menemukan bahwa kemoterapi berbasis cisplatin mampu membentuk TME proinflamasi dengan meningkatkan tingkat ekspresi kelas MHC I pada sel dendritik dan merusak MDSC dan Treg.[40] Secara kebetulan, Homma dkk. mengungkapkan bahwa obat kemoterapi lain yang umum untuk kanker kandung kemih— gemcitabine—dapat meningkatkan kuantitas infiltrasi sel T CD8+dan merusak sel kekebalan imunosupresif di TME.[41] Dalam percobaan hewan praklinis kami, pengobatan terhadap hilangnya BCAT2 dan anti-PD-1 mab menunjukkan kemanjuran antitumor yang lebih berbeda dibandingkan dengan monoterapi anti-PD-1 mab pada tikus yang memiliki kompetensi imun, yang memberikan pengobatan inovatif strategi untuk pasien resistensi ICB. Sementara itu, melalui analisis aliran sitometri dan IF, kami menunjukkan bahwa penghancuran BCAT2 tidak hanya merekrut lebih banyak populasi CTL ke dalam TME tetapi juga meningkatkan aktivitas pembunuhan CTL. Demikian pula, Peng dkk. menemukan bahwa ekspresi berlebih dari LGALS2 menurunkan jumlah CTL yang menginfiltrasi serta biomarker sitotoksik pada tikus yang mengandung kanker payudara.[42] Yang dkk. mengilustrasikan bahwa CXCL13 mampu meningkatkan respons terhadap imunoterapi pada model tikus kanker ovarium dengan meningkatkan tingkat infiltrasi sel T CD8+dan tingkat sekresi GZMB, IFN-𝛾, dan IL-2.[43] Seiring dengan respons antikanker yang lebih kuat, terapi kombinasi semakin mengganggu sistem umpan balik imun yang ada, yang mungkin menyebabkan efek samping yang parah. Berdasarkan pola ekspresi BCAT2 pada tingkat siRNA, yang secara spesifik diekspresikan pada sel tumor dibandingkan pada sel imun dan sel endotel, kita dapat menyimpulkan bahwa hilangnya BCAT2 atau penghambatan BCAT2 cenderung tidak menimbulkan efek samping yang parah. Namun, dosis optimal dan interval waktu inhibitor BCAT2 dan anti-PD-1 mab dalam terapi kombinasi masih perlu dieksplorasi.
Untuk memandu terapi presisi pada individu, kami menghubungkan BCAT2 dengan subtipe molekuler BLCA dan biomarker penting dari berbagai terapi. Berdasarkan prediksi yang kredibel dalam berbagai kohort, kami menemukan bahwa imunoterapi, kemoterapi, radioterapi, dan terapi target EFGR cocok untuk pasien dengan ekspresi BCAT2 yang rendah. Terapi antiangiogenik direkomendasikan untuk pasien dengan ekspresi BCAT2 yang tinggi. Berbeda dari proses deteksi subtipe molekuler yang rumit, BCAT2 adalah prediktor portabel untuk terapi presisi. Tidak dapat dipungkiri, ada beberapa keterbatasan dalam penelitian kami. Pertama, ukuran sampel dan waktu tindak lanjut kohort Xiangya BLCA dan kohort imunoterapi Xiangya BLCA terbatas. Kita perlu memperbesar ukuran sampel dan melanjutkan tindak lanjut yang terstandarisasi. Kedua, sebagai kohort dunia nyata, kohort imunoterapi Xiangya BLCA berisi pilihan operasi berbeda yang mungkin menyebabkan potensi bias. Kami akan memperluas kelompok kami lebih lanjut dan melakukan analisis subkelompok berdasarkan pilihan operasi yang sama. Ketiga, efek kooperatif dari terapi kombinasi in vivo perlu divalidasi lebih lanjut dengan menggunakan penerapan sistem inhibitor BCAT2. Singkatnya, sebagai peran imunosupresif dalam TME BLCA, BCAT2 adalah target baru dalam terapi kombinasi ICB dan biomarker akurat untuk terapi presisi.
Manfaat cistanche tubulosa-memperkuat sistem kekebalan tubuh
4. Bagian Eksperimen
cohort: As illustrated in a previous study,[44] 56 eligible BLCA patients accepted surgical treatment (TURBT (transurethral resection of bladder tumor) or radical cystectomy) in Xiangya Hospital. All the samples were conducted through high throughput RNA sequencing (RNA-seq) to acquire transcriptome information. Then, data on RNA-seq, clinicopathologic features, and follow-up information of these patients were utilized to construct the Xiangya BLCA cohort (Table S1, Supporting Information). Xiangya BLCA immunotherapy cohort: 58 MIBC patients were included in the Xiangya BLCA immunotherapy cohort. All the samples were obtained by diagnostic TURBT before the implementation of neoadjuvant anti-PD-1 therapy. After at least two cycles standard neoadjuvant immunotherapy (NAI), TURBT, or radical cystectomy (RC) were conducted based on treatment response and patients' willingness. 17 individuals with complete response (CR) and 16 individuals with partial response (PR) were classified into responders, 17 individuals with stable disease (SD), and 8 individuals with progressive disease (PD) were classified into nonresponders. The detailed clinicopathological characteristics are listed in Table S2 (Supporting Information). Xiangya scRNA cohort: Three samples of muscle-invasive bladder cancer were implemented scRNA-seq, constituting the Xiangya scRNA cohort. Detailed preparation of single-cell suspension, data transformation, and cell quality control have been elaborated in previous articles.[45] In simple terms, three tumor samples were loaded on a Chromium Single Cell Controller instrument (10×Genomics, USA) to produce single-cell gel beads in suspension. Seurat R package was applied to transform the count matrix into Seurat format. Four standards were set up for excluding low-quality cells in the matrix: unique molecular identifier (UMI) amount < 1000, gene quantity < 200, log10GenesPerUMI < 0.70, and mitochondrial-originated UMI counts > 20%. After integrating the samples based on the top 3000 variable traits, principal component analysis (PCA) and the Findclusters algorithm were employed to identify main cell clusters. Based on the level of copy number variation (CNV) in epithelial cells, malignant bladder carcinoma cells were selected from clusters. The study plan was approved by the ethics committee of Xiangya Hospital, Central South University (Item number: 2021101175). All the specific men were collected complying with informed consent rights. The Cancer Genome Atlas (TCGA) Database: RNA expression matrix, survival outcome, and CNV of 33 types of carcinomas were acquired from the UCSC Xena database. Log2 transformation was employed to normalize RNA-seq data and the GISTIC algorithm was applied to process CNV data. Gene Expression Omnibus (GEO) Database: Transcriptome data of 1740 samples from nine BLCA cohorts: GSE31684 (93 samples), GSE48075 (142 samples), GSE69795(61 samples), GSE32894 (308 samples), GSE48276 (116 samples), GSE83586 (307 samples), GSE86411 (132 samples), GSE52329 (20 samples), GSE87304 (305 samples), and GSE128702 (256 samples) were obtained from GEO database. RNA-seq data of three immunotherapy cohorts: GSE35640 (14 samples, melanoma, and MAGE-A3 therapy), GSE173839 (105 samples, breast cancer, and anti-PD-L1 therapy), and GSE135222 (27 samples, nonsmall cell lung carcinoma (NSCLC), and anti-PD-1/PD-L1 therapy) were downloaded from GEO database. Single-cell transcriptomic characterization of two BLCA scRNA cohorts: GSE135337 (8 samples) and GSE145137 (3 samples) was obtained from the GEO database. Data processing was similar to the Xiangya siRNA cohort. Other Databases: RNA expression matrix and clinicopathologic characteristics of immunotherapy cohorts: IMvigor210 (348 samples, bladder cancer, and anti-PD-1 therapy) and Gide2019 (58 samples, melanoma, anti-PD-1, or anti-CTLA-4 therapy) were collected from http://researchpub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies and TIDE database (http://tide. dfci.harvard.edu/). Data of RNA-seq and clinical characteristics of a BLCA cohort—E-MTAB-1803 (85 samples)—was downloaded from ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/). BCAT2 expression levels in various types of cancer cell lines were downloaded from the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) database. Specific clinicopathologic and follow-up information from public databases were listed in our previous studies.[44,46] Assessment of Immunological Identity of TME in BLCA: As depicted in our previous study,[44] a comprehensive evaluation of the immunological trait of TME in BLCA was summarized. The tracking tumor immunophenotype (TIP) website (http://biocc.hrbmu.edu.cn/TIP/) was used to assess the activities of cancer immunity cycles, which reflected the effectiveness of antitumor immunity. It is separated into seven concrete steps: release and presentation of tumor antigen (steps 1 and 2), startup and activation of effector T cells (step 3), trafficking and assisting diverse immune cells into TME (steps 4 and 5), recognition and killing cancer cells (steps 6 and 7).[47] Six independent algorithms (TIMER, CIBERSORT, CIBERSORT-ABS, MCP-COUNTER, TISIDB, and XCELL) were employed to calculate the infiltration levels of tumor-infiltrating immune cells (TIICs).[48] Furthermore, effector genes of immune cells, ligands and receptors of chemokines, major histocompatibility complex (MHC) molecules, and immunostimulators were collected for evaluating immunological characteristics of TME multi-dimensionally. T cell-inflamed score (TIS) and markers of ICB were utilized to assess the host sensitivity state to immunotherapy.[49] Enrichment Pathways Analysis: Limma R package with empirical Bayesian function was employed to screen differentially expressed genes (DEGs) between high and low expression of BCAT2 in the RNA expression matrix.[50] Screening thresholds were |log (fold change) (log FC) |>1,5 dan nilai p yang disesuaikan < 0.05. Analisis Gene Ontology (GO) dan Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) dilakukan pada DEG yang teridentifikasi dengan paket ClusterProfiler R.[51] Paket Seurat R dengan algoritma Findmarker diterapkan untuk menghitung tingkat ekspresi BCAT2 pada sel epitel di scRNA-seq. Berdasarkan peringkat ekspresi gen yang bervariasi berdasarkan nilai perubahan lipatan (FC), analisis pengayaan set gen (GSEA) diterapkan untuk menilai korelasi positif dan negatif. Identifikasi DEG Terkait Imun: Paket ESTIMATE R digunakan untuk menghitung skor imun dan stroma dalam kohort TCGA-BLCA. Menurut nilai median dari dua skor dan tingkat ekspresi BCAT2, paket Limma R diterapkan untuk mengidentifikasi DEG terkait imun positif/negatif dan DEG terkait stroma. Paket diagram Venn R digunakan untuk mengambil perpotongan berbagai kelompok dan memastikan DEG yang sama. Klasifikasi Individu Menggunakan Subtipe Molekuler BLCA: Tujuh subtipe molekuler BLCA (UNC, Baylor, TCGA, MDA, Lund, CIT, dan Konsensus) diterapkan secara luas dalam klinis untuk menilai karakteristik TME dan kemanjuran berbagai terapi.[52] Dengan mempertimbangkan interaksi kompleks berbagai subtipe, kami secara kolektif membaginya menjadi dua kategori utama—subtipe basal dan luminal.[16] Paket R dari subtipe Konsensus MIBC dan BLCA digunakan untuk mengklasifikasikan individu ke dalam subtipe tertentu. Setelah normalisasi, area di bawah kurva ROC (AUC) digunakan untuk menilai keandalan BCAT2 dalam memprediksi klasifikasi. Penilaian Terapi Presisi terhadap Pasien: Seperti yang diilustrasikan dalam penelitian kami sebelumnya,[53] serangkaian tanda gen penting, yang dapat memprediksi kemanjuran kemoterapi, radioterapi, terapi bertarget, dan imunoterapi, dikumpulkan dari berbagai penelitian dan database.[16, 54] Algoritme ssGSEA digunakan untuk memperhitungkan skor pengayaan tanda tangan gen.[55] Garis Sel: Sel kanker kandung kemih manusia (T24) dan sel kanker kandung kemih murine (MB49) masing-masing dibeli dari Procell Life Science & Technology (Wuhan, Cina) dan Meisen CTCC (Jinhua, Cina). Mereka dipelihara dalam media DMEM (BasalMedia, China) dengan 10% serum janin sapi (FBS) (BI, Israel), 1% penisilin dan streptomisin (NCM Biotech, China), dan dikultur dalam inkubator pada suhu 37 suhu derajat mengandung 5% CO2. Konstruksi dan urutan RNA Sel Transfeksi Stabil: Vektor lentiviral plenti-BCAT2-flag-puromycin (GV341) dirancang dan dibuat oleh GeneChem (Shanghai, Tiongkok) untuk ekspresi berlebih BCAT2-yang stabil (BCAT2 OE) garis sel dan kontrol negatifnya (oe-vektor). Selain itu, RNA jepit rambut pendek BCAT2- (shRNA) diklon ke vektor lentiviral GV112-oleh GeneChem (Shanghai, Cina) untuk lini sel BCAT2-knock down (BCAT2 KD) yang stabil . Urutan target shRNA tercantum pada Tabel S3 (Informasi Pendukung). Kemudian, lentivirus BCAT2 rekombinan ditransfusikan ke dalam sel objektif sesuai dengan instruksi pabrik. 2 ug mL−1 puromisin (Amersco, USA) digunakan untuk menyaring sel transfeksi yang stabil selama tiga hari. Western blot dan PCR transkripsi balik kuantitatif (qRT-PCR) diterapkan untuk memvalidasi kemanjuran transfeksi. Akhirnya, sel transfeksi stabil dengan kemanjuran terbaik dipilih untuk RNA-seq dan percobaan lebih lanjut. Tiga sampel duplikat dari setiap baris sel dikirim ke platform BGI RNA-seq (Shenzhen, Cina). Kriteria untuk memilih DEG dan analisis jalur pengayaan sama seperti yang digambarkan pada 2.3 (analisis jalur pengayaan). ProcartaPlex Multiple Immunoassays untuk Mendeteksi Tingkat Sekresi Kemokin dan Sitokin Garis Sel Kanker: Panel immunoassay ProcartaPlex pada manusia (Kucing: EPX340-12167-901) dan panel immunoassay ProcartaPlex pada tikus (Kucing: EPX{{50}}) dibeli dari ThermoFisher Scientific (Massachusetts, USA) untuk mendeteksi tingkat ekspresi protein lebih dari 30 kemokin dan sitokin penting dalam sel kanker transfeksi yang stabil. Singkatnya, supernatan kultur sel dikumpulkan dari 24-well plate dan sentrifugasi untuk menghilangkan sel dan sisa sel. Kemudian, supernatan yang diklarifikasi diinkubasi dengan manik-manik di panel mengikuti instruksi pabrik. Platform deteksi Luminex (ThermoFisher Scientific, USA) digunakan untuk melakukan analisis kuantitatif pada setiap sampel. Indikator yang tidak terdeteksi dikeluarkan dari analisis. qRT-PCR: Total RNA diisolasi dari sel dengan Kit Isolasi RNA Total Sel dan Kit Isolasi RNA Total Hewan (Foregene, Cina) sesuai dengan protokol pabrikan. cDNA disintesis menggunakan Sistem RTPCR UeIris II untuk Sintesis cDNA First-Strand (US Everbright, Cina). qRTPCR dilakukan menggunakan SYBR Green qPCR Master Mix (US Everbright, China) pada CFX Connect System (Bio-Rad, USA). GAPDH digunakan sebagai pengendalian standar internal. Primer dirancang dan disintesis oleh Sangon Biotech (Shanghai, Cina) dan urutan primer terperinci tercantum pada Tabel S4 (Informasi Pendukung). ELISA: Konsentrasi CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 (MIG), dan CXCL10 (IP10) dalam supernatan kultur sel kanker kandung kemih manusia ditentukan oleh kit ELISA manusia mengikuti protokol pabrikan (Proteintech, USA). Pembaca lempeng mikro bioteknologi (ThermoFisher Scientific, USA) digunakan untuk mengukur nilai kepadatan optik (OD). Mengingat keragaman tingkat sekresi antara sitokin dan kemokin yang berbeda, kami melakukan standardisasi data (transformasi log 2) sebelum analisis. Western Blot: Buffer RIPA (NCM biotech, China) ditambah dengan 1% Protease Inhibitor Cocktail (NCM biotech, China) digunakan untuk melisiskan sel. BCA Protein Assay Kit (NCM biotech, China) digunakan untuk menentukan konsentrasi protein. Setelah dipindahkan ke membran PVDF, protein sel diinkubasi dengan antibodi primer dan antibodi sekunder terkonjugasi HRP spesifik secara berturut-turut. Sinyal ditangkap oleh sistem pencitraan XRS (Bio-Rad, USA). Antibodi primer meliputi antibodi anti-BCAT2 (Kucing: ab95976, Abcam, USA) dan antibodi anti-GAPDH (Kucing: ab8245, Abcam, USA). Antibodi sekunder meliputi IgG anti-kelinci HRP kambing (Cat: 7074, Cell Signaling Technology, USA) dan IgG anti-tikus HRP kambing (Cat: 7076, Cell Signaling Technology, USA). Uji Pembunuhan Sel Kanker yang Dimediasi Limfosit T dan Uji Kokultur: Sampel darah dikumpulkan dari 10 donor sehat di rumah sakit kami. Menurut instruksi pabrik, sentrifugasi gradien digunakan untuk mengekstraksi sel mononuklear darah perifer (PBMC) dengan Lymphoprep (Kat: 07851, StemCell Technologies, USA). Selain itu, Buffer Lisis Sel Darah Merah (Solarbio, China) digunakan untuk menghilangkan sel darah merah yang dicampur dengan PBMC. Untuk mengaktifkan sel T, PBMC dikultur dalam medium DMEM (Gibco, USA), melengkapi IL Manusia Rekombinan- 2 (10 ng mL−1, Kucing: 202-1L-050, R&D , USA), dan aktivator sel T ImmunoCult Human CD3/CD28/CD2 (25 μL mL−1, Cat: 10970; STEMCELL Technologies, USA) selama 1 minggu. Dengan perbandingan 1:5, sel kanker kandung kemih manusia (BCAT2-OE, BCAT2-KD, dan kontrol negatifnya) dikultur bersama dengan sel T teraktivasi dalam media DMEM dengan antibodi anti-CD3 (100 ng mL−1, Thermo Scientific, USA) dan IL-2 (10 ng mL−1) dari satu donator di 12- well plate selama 72 jam. Kemudian, sel T dikumpulkan untuk analisis aliran sitometri. Strategi gerbang terperinci dari analisis aliran ditunjukkan pada Gambar S28 (Informasi Pendukung). Sel-sel kanker yang tersisa diwarnai dengan kristal violet dan diukur nilai OD pada 570 nm oleh microplate reader. Antibodi untuk analisis flow cytometry meliputi Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Kat: 423101, Biolegend, AS), CD45 anti-manusia APC/ Cy7 (Kat: 368516, Biolegend, AS), Antibodi CD3 anti-manusia Pacific Blue (Kat: 300329, Biolegend, AS), Antibodi CD4 anti-manusia PerCP/Cy5.5 (Kat: 317427, Biolegend, AS), Antibodi CD8a anti-manusia FITC (Kat: 301006, Biolegend, AS), PE/Dazzle 594 anti-manusia TNF- 𝛼 Antibodi (Kat: 502946, Biolegend, AS), dan Antibodi IFN- 𝛾 anti-manusia Brilliant Violet 711 (Kat: 502540, Biolegend, AS). Uji Kemotaksis: Uji kemotaksis diimplementasikan dalam pelat transwell sumur 24-dengan diameter inti 3 μm (Corning, AS). Kit Isolasi Sel CD8+T manusia (Kat: 480012, Biolegend, USA) digunakan untuk mengekstrak sel CD8+T dari PBMC. 1 × 105 sel terisolasi dalam volume 200 μL ditambahkan ke ruang atas dan 600 μL supernatan dari garis sel transfeksi stabil yang berbeda ditambahkan ke ruang bawah. Setelah inkubasi selama 6 jam pada suhu 37 derajat, sel-sel bermigrasi ke ruang bawah dan dipanen serta dihitung dengan flow cytometry. Uji Proliferasi, Migrasi, dan Invasi Sel: Uji pembentukan koloni lempeng digunakan untuk menilai kemampuan proliferasi sel. BCAT2-OE, BCAT2-KD, dan sel kanker kandung kemih manusia kontrol negatif dikultur ke dalam 6-well plate per sumur. Setelah diinkubasi dalam atmosfer lembab 37 derajat selama 2 minggu, koloni difiksasi dan diwarnai masing-masing dengan paraformaldehyde dan kristal violet. Ruang Transwell dengan sisipan membran polikarbonat pori 8,0 μm (Corning, USA) digunakan untuk mengevaluasi kapasitas migrasi dan invasi sel secara in vitro. 1 × 105 sel stabil yang ditransfusikan disuspensikan dalam media bebas serum dan diunggulkan ke dalam ruang atas dengan atau tanpa Matrigel (Corning, USA), untuk uji invasi dan migrasi secara terpisah. Setelah diinkubasi selama 24 jam (uji migrasi) dan 48 jam (uji invasi), sel-sel yang menempel pada permukaan bawah membran difiksasi dan diwarnai. Sel-sel yang tersisa di ruang atas dihilangkan dengan penyeka. Lima bidang acak dipilih di bawah mikroskop untuk menghitung jumlah sel. Imunofluoresensi (IF) dan Imunohistokimia (IHC): IF multiwarna pada TMA dari Kelompok Xiangya BLCA dan Kelompok imunoterapi Xiangya BLCA diimplementasikan dengan beberapa kit pewarnaan imunohistokimia fluoresen (Absin, Cina). Singkatnya, setelah dewaxing, rehidrasi, dan renovasi antigen, TMA diinkubasi dengan antibodi primer dan antibodi sekunder yang mendorong pengikatan luciferin yang berbeda melalui amplifikasi sinyal tyramide (TSA). Setelah menghapus antibodi yang tidak terikat dengan buffer sitrat, proses inkubasi diulangi dua kali. DAPI digunakan untuk melawan inti sel dan gambar dipindai oleh platform Pannoramic MIDI (3DHISTECH, Hongaria). Antibodi primer pada TMA kohort Xiangya BLCA meliputi anti-BCAT2 (Kucing: ab95976, Abcam, USA), anti-Cytokeratin 19 (CK19) (Kucing: ab52625, Abcam, USA), anti-CD8 (Kucing: ab237709, Abcam, USA ) dan DAPI (Invitrogen, AS). Antibodi sekunder dan fluorokrom pada TMA kohort Xiangya BLCA termasuk HRP Goat Anti-Rabbit/Mouse IgG, Absin 520 TSA Plus, Absin 570 TSA Plus, Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). Antibodi primer pada TMA kohort imunoterapi Xiangya BLCA meliputi anti-BCAT2 (Kucing: ab95976, Abcam, USA), anti-PD-L1 (Kucing: ab213524, Abcam, USA), dan DAPI (Invitrogen, USA). Antibodi sekunder dan fluorokrom pada TMA kohort imunoterapi Xiangya BLCA meliputi HRP Goat Anti-Rabbit/Mouse IgG, Absin 520 TSA Plus, dan Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). IF pada jaringan tumor murine diinkubasi dengan antibodi primer—anti-CD8 (Cat: 372902, BioLegend, USA)—dan antibodi sekunder—konjugat pewarna Alexa Fluor 488 anti-tikus (Invitrogen, USA) secara berurutan. DAPI diterapkan pada inti sel yang divisualisasikan. Lima bidang acak dipilih di bawah mikroskop untuk menghitung jumlah sel pewarnaan positif. IHC pada TMA dari Kelompok BLCA Xiangya dan Kelompok imunoterapi BLCA Xiangya dilakukan oleh SP-9000 Kit (ZSGB-BIO, China). Setelah pengambilan dan pemblokiran antigen, antibodi primer, dan antibodi sekunder diinkubasi dengan jaringan tumor secara bergantian. Kemudian, diaminobenzidine (DAB) diaplikasikan untuk mewarnai antigen target. Sinyal coklat dianggap sebagai pewarnaan positif. Skor intensitas pewarnaan (tidak ada=0, lemah=1, sedang=2, dan kuat=3) mengalikan skor persentase positif (tidak ada pewarnaan=0, pewarnaan sel kurang dari 25%=1, 25%–50% sel pewarnaan=2, 50%–75% sel pewarnaan=3, dan sel pewarnaan lebih dari 75%=4) adalah skor akhir IHC sampel. Skor BCAT2/CD8/PD-L1 kurang dari enam poin tergolong ekspresi rendah, skor lebih besar atau sama dengan enam poin tergolong ekspresi tinggi. Untuk menilai status MMR seseorang, semua sampel dari kelompok imunoterapi Xiangya BLCA dinilai berdasarkan hasil pewarnaan empat gen penanda MMR (MLH1, MSH2, MSH6, dan PMS2). Seperti yang digambarkan dalam penelitian sebelumnya, [56] ketika keempat gen penanda memiliki pewarnaan positif, individu tersebut ditandai sebagai MMR. Ketika salah satu dari empat gen penanda memiliki pewarnaan negatif, individu tersebut ditandai sebagai dMMR. Dua ahli patologi independen diundang untuk melakukan penilaian. Antibodi meliputi: anti-BCAT2 (Kucing: ab95976, Abcam, USA), anti-CD8 (Kucing: ab4055, Abcam, USA), anti-PD-L1 (Kucing: ab213524, Abcam, USA), anti-MLH1 (Kucing: A4858, Abcolonal, China), anti-MSH2 (Cat: A22177, Abcolonal, China), anti-MSH6 (Cat: A16381, Abcolonal, China), anti-PMS2 (Cat: A4577, Abcolonal, China), dan HRP Goat Anti -IgG Kelinci/Tikus (ZSGB-BIO, Cina). Analisis Panoramik TissueFAXS terhadap Interaksi Spasial di TME: Untuk mengevaluasi interaksi spasial sel ganas BCAT2+ dan sel T efektor, platform panorama TissueFAXS (Tissue Gnostics, Austria) digunakan untuk memindai dan menganalisis secara semi-otomatis sel objektif yang diwarnai dengan IF multiwarna pada TMA Kelompok Xiangya BLCA. TMA terdiri dari biopsi inti 1,5 mm dari spesimen jaringan tumor yang tertanam parafin. Secara rinci, sel BCAT2+, sel ganas, dan sel T8+CD diwarnai oleh antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder. DAPI (Invitrogen, USA) digunakan untuk menodai inti sel. Langkah-langkah rinci telah dijelaskan dalam penelitian Makarevic dkk.[57] Singkatnya, berdasarkan intensitas fluoresensi berbagai indikator dan sifat fisik sel, sel positif ditandai dan diukur. Lebih penting lagi, distribusi spasial sel CD8+T di sekitar sel BCAT2+CK19+ digambarkan dengan plot sebar berdasarkan jarak ruang (0–25, 25–50, 50– 100, dan 100–150 μm). Dua ahli patologi berpengalaman diundang untuk memeriksa hasil keputusan platform panorama TissueFAXS. Eksperimen Hewan: Tikus C57BL / 6 betina (6-7 minggu) diperoleh dari Departemen Laboratorium Hewan, Central South University. Semua operasi pada tikus diperiksa dan disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Rumah Sakit Xiangya, Universitas Central South (Nomor item: 2021101175). Yang terpenting, untuk menyelidiki peran BCAT2 pada pertumbuhan tumor in vivo, sel BCAT2 KD MB49 (5 × 105) dan sel kontrolnya dalam volume sedang 100 μL disuntikkan secara subkutan ke sisi kanan tikus. Selain itu, setelah berhasil membuat model tumor subkutan (volume tumor hingga 100 mm3), 100 ug InVivomAb anti-mouse PD-1 (Kucing: BE0146, Bioxcell, USA) dan kontrol isotipe IgG2a (Kucing: BE0089, Bioxcell, USA) disuntikkan secara intraperitoneal ke setiap tikus, untuk menilai efek sinergis dari hilangnya BCAT2 dan terapi anti-PD-1. Terapi anti-PD-1 diterapkan pada tikus setiap 3 hari dan berlangsung hingga lima kali kursus. Lebih lanjut, untuk menilai apakah efek kooperatif dari pengobatan bersama bergantung pada sel T CD{279}}. Terapi kombinasi yang menyertainya, 100 ug CD8𝛼 anti-tikus InVivoPlus (Kucing: BP0117, Bioxcell, AS) dan kontrol isotipe IgG2b (Kucing: BP0090, Bioxcell, AS) digunakan untuk menghabiskan sel T CD8+pada tikus. Berat badan mencit dicatat setiap tiga hari sekali. Pada tanggal yang dijadwalkan, tumor diambil, diukur, dan disiapkan untuk analisis aliran sitometri, pewarnaan IF, dan qRT-PCR. Untuk mengeksplorasi interaksi antara tingkat ekspresi BCAT2 pada sel T CD8+dan aktivitas sel T CD8+, limpa tikus betina C57BL/6 (6– 7 minggu) tanpa pembawa tumor digunakan dipisahkan dan disiapkan untuk suspensi sel tunggal untuk analisis lebih lanjut. Analisis Aliran Sitometri: Tumor murine digiling dan dicerna menjadi suspensi sel tunggal oleh Collagenase IV (Kucing: C5138, Sigma, USA), hyaluronidase (Kucing: H3506, Sigma, USA), dan DNase I (Kucing: DN25, Sigma, USA) ). Saringan sel 70 μm (BIOFIL, Cina) digunakan untuk menyaring kotoran dan penghitung sel (Countstar, Cina) digunakan untuk mendapatkan (3–5) × 106 sel di setiap sampel. Setelah mengidentifikasi sel hidup menggunakan Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Kat: 423101, Biolegend, USA) dan memblokir reseptor Fc dengan antibodi anti-tikus CD16/32 (Cat: 156603, Biolegend, USA), antigen membran sel diwarnai oleh APC-Cy7 anti-mouse CD45 (Cat: 103116, Biolegend, USA), BV421 anti-mouse CD3 (Cat: 100341, Biolegend, USA), BV605 anti-mouse CD8a (Cat: 100744, Biolegend, USA) dan PerCPCy5.5 anti-mouse CD4 (Kucing: 100540, Biolegend, AS). Kemudian, Bioscience Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set (Kat: 2400632, Invitrogen, USA) digunakan untuk memperbaiki dan permeabilisasi sel dan membran nukleus. Antigen yang berhubungan dengan efek sitotoksik diwarnai dengan PE anti-manusia/tikus Granzyme B (Kat: 372208, Biolegend, USA), PE-Cy7 anti-tikus TNF-𝛼 (Kat: 506324, Biolegend, USA), PE-Dazzle 594 anti- mouse IFN-𝛾 (Kucing: 505846, Biolegend, AS), Perforin anti-tikus APC (Kucing: 154304, Biolegend, AS). Strategi gating analisis aliran sitometri ditunjukkan pada Gambar S29 (Informasi Pendukung). BCAT2 anti-manusia/tikus (Kucing: A7426, Abclonal, China) diinkubasi dengan kit pelabelan antibodi Fleksibel 488 (Kucing: KFA001, Proteintech, AS) untuk mensintesis antibodi fluoresen BCAT2 yang dipersonalisasi untuk analisis aliran sitometri. Kemudian, antibodi BCAT2 dan antibodi terkait sel T dicampur dan ditambahkan ke dalam suspensi sel tunggal limpa murine untuk mengeksplorasi interaksi antara tingkat ekspresi BCAT2 pada sel T CD8+dan aktivitas CD{{357} }sel T. Strategi gating analisis aliran sitometri ditunjukkan pada Gambar S30 (Informasi Pendukung). Sampel bernoda terdeteksi pada sitometri Cytek DxpAthena Flow (Cytek Biosciences, USA) dan data dianalisis dengan perangkat lunak versi Flowjo (BD Biosciences, USA). Analisis Statistik: Data disajikan sebagai mean ± SD. Uji-t dengan atau tanpa koreksi Welch digunakan untuk membandingkan variabel kontinu antara dua kelompok. Analisis ANOVA satu arah dengan atau tanpa uji Brown-Forsythe dan Welch digunakan untuk membandingkan variabel kontinu antara beberapa kelompok. Uji chi-kuadrat atau uji eksak Fisher diterapkan untuk membandingkan variabel dikotomi. Uji koefisien korelasi Pearson atau Spearman digunakan untuk memperkirakan intensitas korelasi antar variabel yang berbeda. Kurva kelangsungan hidup Kaplan-Meier digunakan untuk menunjukkan analisis prognostik variabel dikotomis, dan uji log-rank digunakan untuk menilai perbedaan statistik. P dua sisi <0,05 didefinisikan sebagai ambang batas signifikansi. Perangkat lunak R (versi 4.0) dan GraphPad Prism8 diterapkan untuk mengolah data dalam penelitian.
Referensi
[1] RL Siegel, KD Miller, HE Fuchs, A. Jemal, CA: Kanker J. Clin. 2021, 71, 7.
[2] VG Patel, WK Oh, MD Galsky, Ca-Kanker J. Clin. 2020, 70, 404.
[3] R. Nadal, J. Bellmunt, Pengobatan Kanker. Pdt. 2019, 76, 10.
[4] a) MD Galsky, A. Arija JÁ, A. Bamias, ID Davis, M. De Santis, E. Kikuchi, X. Garcia-Del-Muro, U. De Giorgi, M. Mencinger, K. Izumi, S. Panni, M. Gumus, M. Özgüro˘glu, AR Kalebasty, SH Park, B. Alekseev, FA Schutz, JR Li, D. Ye, NJ Vogelzang, S. Bernhard, D. Tayama, S. Mariathasan, A .Mecke, A. Thåström, E. Grande, Lancet 2020, 395, 1547; b) MD Galsky, A. Mortazavi, MI Milowsky, S. George, S. Gupta, MT Fleming, LH Dang, DM Geynisman, R. Walling, RS Alter, M. Kassar, J. Wang, S. Gupta, N. Davis, J. Picus, G. Philips, DI Quinn, GK Haines 3rd, NM Hahn, Q. Zhao, M. Yu, SK Pal, J. Clin. Onkol. 2020, 38, 1797; c) T. Powles, SH Park, E. Voog, C. Caserta, BP Valderrama, H. Gurney, H. Kalofonos, S. Radulovi´c, W. Demey, A. Ullén, Y. Loriot, SS Sridhar, N Tsuchiya, E. Kopyltsov, CN Sternberg, J. Bellmunt, JB Aragon-Ching, DP Petrylak, R. Laliberte, J. Wang, B. Huang, C. Davis, C. Fowst, N. Costa, JA Blake-Haskins , A. di Pietro, P. Grivas, N. Engl. J.Med. 2020, 383, 1218.
[5] a) RW Jenkins, DA Barbie, KT Flaherty, Sdr. J.Kanker 2018, 118, 9; b) AJ Schoenfeld, MD Hellmann, Sel Kanker 2020, 37, 443.
[6] a) DS Chen, I. Mellman, Alam 2017, 541, 321; b) TF Gajewski, L. Corrales, J. Williams, B. Horton, A. Sivan, S. Spranger, Adv. Contoh. medis. biologi. 2017, 1036, 19; c) DC Hinshaw, LA Shevde, Kanker Res. 2019, 79, 4557.
[7] a) SM Vareki, J. Imunother. Kanker 2018, 6, 157; b) B.Zhang, Q.Wu, B.Li, D.Wang, L.Wang, YL Zhou, Mol. Kanker 2020, 19, 53.
[8] JR Mayers, ME Torrence, LV Danai, T. Papagiannakopoulos, SM Davidson, MR Bauer, AN Lau, BW Ji, PD Dixit, AM Hosios, A. Muir, CR Chin, E. Freinkman, T. Jacks, BM Wolpin, D. Vitkup, MG Vander Heiden, Sains 2016, 353, 1161.
[9] JT Li, M. Yin, D. Wang, J. Wang, MZ Lei, Y. Zhang, Y. Liu, L. Zhang, SW Zou, LP Hu, ZG Zhang, YP Wang, WY Wen, HJ Lu , ZJ Chen, D.Su, QY Lei, Nat. Biol Sel. 2020, 22, 167.
[10] JH Lee, YR Cho, JH Kim, J. Kim, HY Nam, SW Kim, J. Son, Exp. mol. medis. 2019, 51, 146.
[11] a) H. Lai, X. Cheng, Q. Liu, W. Luo, M. Liu, M. Zhang, J. Miao, Z. Ji, GN Lin, W. Song, L. Zhang, J. Bo, G.Yang, J.Wang, WQ Gao, Int. J.Kanker 2021, 149, 2099; b) D. Lambrechts, E. Wauters, B. Boeckx, S. Aibar, D. Nittner, O. Burton, A. Bassez, H. Decaluwé, A. Pircher, K. Van den Eynde, B. Weynand, E. Verbeken, P. De Leyn, A. Liston, J. Vansteenkiste, P. Carmeliet, S. Aerts, B. Thienpont, Nat. medis. 2018, 24, 1277.
[12] N. Nagarsheth, MS Wicha, W. Zou, Nat. Pendeta Imunol. 2017, 17, 559.
[13] a) E. Stelloo, AML Jansen, EM Osse, RA Nout, CL Creutzberg, D. Ruano, DN Church, H. Morreau, V. Smit, T. van Wezel, T. Bosse, Ann. Onkol. 2017, 28, 96; b) AS Tjalsma, A. Wagner, WNM Din jens, PC Ewing-Graham, LSM Alcalá, MER de Groot, KE Hamoen, AC van Hof, W. Hofhuis, LN Hofman, KJ Hoogduin, J. Kaijser, ACF Makkus, SJJ Mol, GM Plaisier, K. Schelfhout, HPM Smedts, RA Smit, PJ Timmers, P. Vencken, B. Visschers, AAM van der Wurff, HC van Doorn, Gynecol. Onkol. 2021, 160, 771.
