Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides Menginduksi Apoptosis pada Sel Karsinoma Hepatoseluler H22 Melalui Jalur Sinyal Ekstrinsik Dan Intrinsik

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

Pengfei Yuan, Jinyu Li, Adila Aipire, Yi Yang, Lijie Xia, Xinhui Wang, Yijie Li dan Jinyao Li

Abstrak

Latar belakang:Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight adalah obat tradisional Cina yang parasit akar tanaman Tamarix dan telah digunakan untuk mengobati impotensi pria, kemandulan, kelemahan tubuh, dan sebagai tonik. Namun, efek antitumornya pada karsinoma hepatoseluler masih sulit dipahami. Di sini, kami menyelidiki efek antitumor dariC. tubulosa fenilethanoid glikosida(CTPG) pada sel karsinoma hepatoseluler H22 baik in vitro maupun in vivo dan mekanismenya. Metode: Morfologi, viabilitas, apoptosis, siklus sel, dan potensial membran mitokondria (Δψm) sel H22 dianalisis dengan mikroskop terbalik, uji MTT, dan flow cytometry. Ekspresi dan aktivasi protein pada jalur apoptosis dideteksi oleh Western blot. Efek antitumor in vivo dievaluasi dalam model tikus tumor yang dibuat menggunakan tikus Kunming jantan. Hasil: Pengobatan CTPG secara signifikan menekan pertumbuhan sel H22 dengan cara yang bergantung pada dosis dan waktu, yang berkorelasi dengan peningkatan apoptosis dan penghentian siklus sel pada fase G0/G1 dan G2/M. Selain itu, kondensasi kromosom diamati pada sel H22 yang diobati dengan CTPG. Pengobatan CTPG secara signifikan meningkatkan rasio Bax/Bcl-2, mengurangi m, dan meningkatkan pelepasan sitokrom c. Tingkat caspase yang dibelah-8 dan caspase-9 di jalur pensinyalan ekstrinsik dan intrinsik meningkat secara signifikan sehingga caspase yang diaktifkan secara berurutan-7 dan -3 untuk membelah PARP. Akhirnya, CTPG (Bentengtubulosaglikosida feniletanoid) menghambat pertumbuhan sel H22 pada tikus dan meningkatkan tingkat kelangsungan hidup tikus tumor. Kesimpulan: Hasil ini menunjukkan bahwa CTPG menekan pertumbuhan sel H22 melalui jalur apoptosis ekstrinsik dan intrinsik.

Latar belakang

Kanker hati menempati peringkat keenam untuk kejadian kanker dan keempat untuk kematian akibat kanker di seluruh dunia. Selain itu, peringkat keempat untuk kejadian kanker dan pertama untuk kematian akibat kanker di negara-negara dengan indeks sosiodemografi rendah [1]. Di Cina, kanker hati adalah penyebab utama ketiga kematian terkait kanker pada tahun 2015 [2]. Lebih dari 90 persen kanker hati primer adalah karsinoma hepatoseluler (HCC) di dunia [3]. Saat ini, reseksi hati merupakan pilihan utama untuk terapi HCC. Namun, kurang dari 30 persen pasien dengan HCC yang memenuhi kriteria reseksi hati kuratif, dan tingkat kelangsungan hidup 5-tahun secara keseluruhan masih serendah 35-50 persen karena tingkat kekambuhan yang tinggi [4, 5 ]. Ketersediaan pilihan pengobatan untuk pasien dengan HCC menengah hingga lanjut sangat terbatas. Sorafenib, obat yang ditargetkan secara molekuler, telah disetujui oleh FDA sebagai pengobatan lini pertama untuk HCC tingkat lanjut. Namun, sorafenib hanya memperpanjang sekitar 3 bulan kelangsungan hidup dan tingkat respon kurang dari 4 persen [6, 7]. Sangat mendesak untuk mengembangkan obat atau strategi baru melawan HCC. Pengobatan Tradisional Cina (TCM) sendiri atau dikombinasikan dengan strategi lain telah digunakan untuk mengobati HCC dan menunjukkan manfaat klinis termasuk waktu kelangsungan hidup yang lebih lama, peningkatan kualitas hidup, pengurangan efek samping, dan sebagainya [8, 9].Benteng, semacam TCM, memiliki berbagai fungsi biologis, sepertianti-oksidasi, anti-inflamasi, anti-penuaan,dan pelindung saraf [10, 11]. Glikosida feniletanoid telah dianggap sebagai komponen aktif utama dariBenteng, yang memiliki beragam aktivitas termasuk anti-oksidasi, anti-inflamasi, hepatoproteksi, dan pelindung saraf [12-15]. Grup kami telah melaporkan bahwaGlikosida fenilethanoid Cistanche tubulosa(CTPG) dapat menginduksi apoptosis pada sel melanoma B16-F10 dan menghambat pertumbuhan tumor pada tikus [16]. Dalam penelitian ini, kami mengukur efek antitumor CTPG pada sel HCC H22 baik secara in vitro maupun in vivo dan menyelidiki mekanismenya. Kami menemukan bahwa CTPG menginduksi apoptosis dalam sel H22 melalui jalur pensinyalan ekstrinsik dan intrinsik dan menekan pertumbuhan tumor H22 pada tikus.

Metode

Saluran seluler

Sel karsinoma hepatoseluler H22 tikus diperoleh dari Laboratorium Kunci Xinjiang Sumber Daya Biologi dan Rekayasa Genetika, Universitas Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Cina) dan dikultur dalam media RPMI 1640 (Gibco) yang dilengkapi dengan penisilin 100 U/ml dan 100 ug/ml streptomisin, dan 10 persen serum janin sapi yang tidak diaktifkan panas (Gibco) pada suhu 37 derajat dalam atmosfer yang dilembabkan dari 5 persen CO2.

uji MTT

CTPG dibeli dari Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. (Hetian, Xinjiang, China) dan senyawa utama CTPG memenuhi syarat dan diukur dengan kromatografi cair kinerja tinggi [16]. Viabilitas sel dievaluasi dengan 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) (Sigma, St. Louis, MO , AS) pengujian. Sel H22 diinokulasi ke dalam 96-pelat sumur dengan kepadatan 2 × 104 sel dalam 100 ul media per sumur dan dikultur pada suhu 37 derajat . Setelah 24 jam, sel diperlakukan dengan konsentrasi CTPG yang berbeda (0, 100, 200, 300 dan 400 ug/ml) atau 0,3 persen DMSO (sama dengan 400 ug/ml CTPG) masing-masing selama 24, 48 dan 72 jam. . Setelah sentrifugasi pada 1000 rpm selama 7 menit, supernatan dibuang dan 100 ul larutan MTT (5 mg/ml dalam PBS) ditambahkan ke masing-masing sumur. Pelat diinkubasi pada 37 derajat selama 4 jam dan 100 ul DMSO ditambahkan untuk melarutkan kristal formazan yang terbentuk. Nilai OD490 dideteksi oleh pembaca pelat mikro sumur 96- (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Viabilitas sel dihitung menurut rumus: Viabilitas sel ( persen )=(ODtreated/ODuntreated) × 100 persen .

Deteksi apoptosis

Sel H22 diperlakukan dengan konsentrasi CTPG yang berbeda (0, 100, 200, 300, dan 400 ug/ml) atau 0,3 persen DMSO selama 24 jam, dan kemudian diwarnai dengan Annexin V FITC/ Kit Deteksi Apoptosis Propidium iodide (PI) (YEASEN, China) sesuai dengan petunjuk pabriknya. Sampel dianalisis dengan flow cytometry (BD FACSCalibur, USA).

Deteksi potensial membran mitokondria

Sel H22 diperlakukan dengan konsentrasi CTPG yang berbeda (0, 200, dan 400 ug/ml) selama 24 jam, dan kemudian diwarnai dengan pewarna JC-1 yang permeabel membran (Beyotime, China) selama 20 menit pada 37 derajat. Setelah dicuci dua kali dengan buffer JC-1, sampel disuspensikan kembali dengan 300 ul buffer JC-1 dan dianalisis dengan flow cytometry (BD FACSCalibur, USA).

Analisis siklus sel

Sel H22 diinokulasi dalam cawan kultur 60 mm dan diperlakukan dengan konsentrasi CTPG yang berbeda (0, 100, 200, 300 dan 400 ug/ml) atau 0,3 persen DMSO untuk 24 jam Semua sel dikumpulkan dan dicuci dua kali dengan PBS. Sel difiksasi dalam 70 persen etanol sedingin es pada 20 derajat selama 2 jam dan dicuci dua kali dengan PBS, kemudian disuspensikan kembali dalam buffer pewarnaan Propidium iodida / RNase 300 ul (BD Biosciences). Setelah 10 menit pada suhu kamar, sampel dikumpulkan dengan flow cytometry (BD FACSCalibur, USA) dan distribusi siklus sel dianalisis dengan perangkat lunak ModFit LT 3.0.

Pewarnaan Hoechst 33.258

Perubahan morfologi inti sel H22 dianalisis dengan pewarnaan membran-permeabel DNA-binding dye Hoechst 33.258. Sel-sel H22 diunggulkan dalam pelat sumur 6-pada konsentrasi 1 × 105 sel/sumur dalam media 2 ml. Setelah pertemuan 60 persen ~ 70 persen, sel diperlakukan dengan CTPG (0, 100, 200, 300 dan 400 ug/ml) selama 24 jam. Sel-sel dikumpulkan dan difiksasi dengan 4 persen Paraformaldehida sedingin es pada 4 derajat selama 10 menit. Setelah dicuci dengan PBS, sel diwarnai dengan Hoechst 33.258 (Beyotime, Cina) pada 4 derajat selama 10 menit. Sampel diamati dengan mikroskop fluoresensi terbalik (Nikon Eclipse Ti-E, Jepang).

noda barat

Anti-caspase-3, anti-cleaved caspase-3, Anti-Bcl-2, dan anti-Bax dibeli dari Beyotime Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China). Anti-caspase-7, anti-cleaved-caspase-7, anti-caspase-8, anti-cleaved-caspase-8, anti-caspase-9, anti -cleaved-caspase-9, anti-PARP, anti-cleaved PARP, anti-mouse IgG-HRP, dan anti-kelinci IgG-HRP dibeli dari Cell Signaling Technology. Anti- -aktin dibeli dari Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Beijing, China).

Sel H22 diperlakukan dengan konsentrasi CTPG yang berbeda (0, 100, 200, 300 dan 400 ug/ml) atau 0,3 persen DMSO selama 24 jam. Sel dikumpulkan dan dilisiskan dengan Cell Lysis Solution RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) selama 30 menit di atas es. Sampel dipintal (12,000 g selama 15 menit pada 4 derajat ) untuk mengumpulkan supernatan dan konsentrasi protein diukur dengan kit BCA (Thermo Fisher Scientific, USA). Jumlah protein yang sama dalam setiap sampel diisolasi dengan 12 persen SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF (Biosharp, China). Setelah diblokir dengan buffer TBST yang mengandung 5 persen susu tanpa lemak, membran diinkubasi dengan antibodi primer yang sesuai dan antibodi sekunder yang masing-masing terkonjugasi dengan horseradish peroxidase (HRP). Setelah dicuci dengan TBST, protein target dideteksi oleh kit uji ECL (Beyotime, China).

Pernyataan tentang hewan dan etika

Tikus Kunming jantan berumur 6-8 minggu dibeli dari Pusat Laboratorium Hewan, Universitas Kedokteran Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Cina). Tikus disimpan di fasilitas hewan siklus ringan yang dikontrol suhu standar di Universitas Xinjiang. Semua penelitian pada hewan dilakukan sesuai dengan pedoman dari Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Universitas Xinjiang. Protokol tersebut telah disetujui oleh Komite Etika Eksperimen Hewan dari Laboratorium Utama Sumber Daya Biologi dan Rekayasa Genetika Xinjiang (BRGE-AE001), Universitas Xinjiang.

Studi tikus tumor

Untuk induksi model tikus tumor, tikus Kunming jantan disuntik secara subkutan dengan 1 × 106 sel H22 dalam 100 ul PBS ke sisi kanan. Setelah 3 hari, mencit dibagi secara acak menjadi 3 kelompok (7 ekor/kelompok). Kelompok Kontrol disuntik dengan 0,1 ml DMSO secara subkutan di sekitar tumor. Kelompok CTPG-200 dan CTPG- 400 disuntik secara subkutan dengan 200 atau 400 mg/kg CTPG dalam 0,1 ml DMSO di sekitar tumor. Tikus dirawat setiap 2 hari hingga 21 hari. Ukuran tumor diukur menggunakan jangka sorong hingga 25 hari dan volume tumor dihitung menurut rumus: volume tumor (mm3)=(panjang×lebar2)/2. Setelah 25 hari, kelangsungan hidup tikus tumor dipantau setiap hari sampai akhir penelitian ini.

Analisis statistik

Signifikansi statistik dihitung dengan analisis varians satu arah antara kelompok perlakuan dan kontrol. Semua data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (SD). p < 0.05="" dianggap="" signifikan="" secara="">

Hasil

CTPG mengurangi viabilitas sel H22 secara in vitro

Untuk mengeksplorasi efek antitumor CTPG pada HCC, sel H22 diperlakukan dengan konsentrasi CTPG yang berbeda (0, 100, 200, 300, dan 400 ug/ml) in vitro. Setelah 24 jam, morfologi sel H22 diamati menggunakan mikroskop terbalik. Kami menemukan bahwa morfologi sel H22 diubah secara dramatis oleh pengobatan CTPG. Dengan meningkatnya konsentrasi CTPG, sel menjadi kecil dan bulat dan jumlah sel juga sangat berkurang (Gbr. 1a). Uji MTT digunakan untuk menganalisis viabilitas sel H22 setelah pengobatan CTPG masing-masing selama 24, 48, dan 72 jam. CTPG secara signifikan mengurangi viabilitas sel H22 dengan cara yang bergantung pada dosis dan waktu (Gbr. 1b). CTPG pada 300 ug/ml tiba pada tingkat penghambatan terbaik (Gbr. 1c). Nilai IC50 CTPG untuk sel H22 adalah 236 ug/ml pada 24 jam dan 169,8 ug/ml pada 48 jam.

CTPG menginduksi apoptosis pada sel H22

Untuk menyelidiki apakah penurunan viabilitas sel H22 dimediasi oleh induksi apoptosis, sel H22 diperlakukan dengan konsentrasi CTPG yang berbeda (0, 100, 200, 300, dan 400 ug/ml) selama 24 jam dan diwarnai dengan PI dan Annexin V. Hasil flow cytometry menunjukkan bahwa CTPG secara signifikan menginduksi apoptosis sel H22 (termasuk apoptosis awal dan akhir) dengan cara yang bergantung pada dosis (Gbr. 2a). Meskipun CTPG dosis tinggi juga secara signifikan meningkatkan nekrosis sel H22, nekrosis memainkan peran kecil dalam penghambatan pertumbuhan sel H22 karena proporsinya yang lebih rendah (8,3 persen) dibandingkan dengan apoptosis (52,6 persen). Selanjutnya, protein total sel H22 diisolasi setelah pengobatan CTPG dan ekspresi limfoma sel B anti-apoptosis 2 (Bcl-2) dan protein X terkait (Bax) pro-apoptosis BCL-2-dideteksi oleh noda Barat. Data pemindaian skala abu-abu menunjukkan bahwa tingkat ekspresi Bax dan Bcl-2 masing-masing meningkat dan menurun. Rasio Bax/Bcl-2 meningkat secara signifikan (Gbr. 2b). Hasil ini menunjukkan bahwa CTPG menginduksi apoptosis pada sel H22.

CTPG menginduksi kondensasi kromosom dan penghentian siklus sel dalam sel H22

Telah dilaporkan bahwa kerusakan DNA dan penghentian siklus sel yang diinduksi oleh obat-obatan dapat menghambat pertumbuhan sel tumor dan menyebabkan apoptosis pada sel tumor [17, 18]. Untuk mendeteksi morfologi inti sel H22 setelah pengobatan CTPG selama 24 jam, sel H22 diwarnai dengan Hoechst 33.342 dan diamati menggunakan mikroskop fluoresen terbalik. Sel-sel yang diobati dengan CTPG menunjukkan peningkatan yang bergantung pada dosis dari kromatin inti yang terkondensasi cerah, sedangkan sel-sel yang tidak diobati menunjukkan inti yang diwarnai secara homogen (Gbr. 3a). Distribusi siklus sel dalam sel H22 dianalisis lebih lanjut dengan pewarnaan PI setelah pengobatan CTPG selama 24 jam. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3b, pengobatan CTPG secara signifikan meningkatkan proporsi sel fase G0/G1- dan G2/M dan secara signifikan menurunkan proporsi sel fase S, menunjukkan bahwa CTPG menginduksi G 0/G1 dan G2/M penghentian fase dalam sel H22. CTPG dosis tinggi juga secara signifikan meningkatkan proporsi sel sub G1.

CTPG menurunkan potensial membran mitokondria dan meningkatkan pelepasan sitokrom c

Jalur yang bergantung pada mitokondria memainkan peran penting dalam induksi apoptosis [19, 20]. Perubahan potensial membran mitokondria (Δψm) dapat dipantau dengan pewarnaan JC-1 karena agregat JC-1 (fluoresensi merah) dapat terurai menjadi monomer (fluoresensi hijau) dengan reduksi m [21]. Setelah pengobatan CTPG selama 24 jam, sel H22 diwarnai dengan pewarna JC - 1. Data flow cytometry menunjukkan bahwa fluoresensi merah di saluran FL-2 dan fluoresensi hijau di saluran FL-1 secara signifikan menurun dan meningkat pada pengobatan CTPG. Proporsi sel PE− FITC plus meningkat secara signifikan (Gbr. 4a), menunjukkan bahwa CTPG mengurangi m dalam sel H22. Ini konsisten dengan peningkatan rasio Bax/Bcl-2. Akibatnya, kami mengamati pelepasan sitokrom c meningkat secara signifikan pada pengobatan CTPG (Gbr. 4b). Hasil ini menunjukkan bahwa CTPG mungkin sebagian menginduksi apoptosis dalam sel H22 melalui jalur (intrinsik) yang bergantung pada mitokondria.

CTPG mengaktifkan jalur caspase dan mencegah perbaikan DNA

Selanjutnya, aktivasi caspase yang diinduksi oleh CTPG melalui jalur pensinyalan ekstrinsik dan intrinsik dianalisis. Setelah pengobatan CTPG selama 24 jam, total protein diisolasi dari sel H22 dan tingkat pro-dan cleaved-caspases dideteksi oleh Western blot. Dibandingkan dengan yang tidak diobati atau kontrol DMSO, pengobatan CTPG secara signifikan mengatur tidak hanya tingkat caspase yang dibelah-8 (jalur ekstrinsik) tetapi juga tingkat caspase yang dibelah-9 (jalur intrinsik) (Gbr. 1a). 5). Secara berurutan, caspase teraktivasi-8 dan -9 membelah pro-caspase hilir-3 dan -7 yang diamati pada Gambar 5. Caspase teraktivasi-3 membelah DNA perbaikan enzim poli (ADP-ribosa) polimerase (PARP) untuk mencegah perbaikan DNA dan akumulasi kerusakan DNA seperti yang diamati pada Gambar. 3a.

Hasil ini menunjukkan bahwa CTPG menginduksi apoptosis pada sel H22 melalui jalur pensinyalan ekstrinsik dan intrinsik.

CTPG menekan pertumbuhan H22 HCC in vivo dan meningkatkan tingkat kelangsungan hidup tikus tumor

Akhirnya, efek antitumor CTPG pada HCC dievaluasi dalam model tikus tumor, yang dibuat dengan injeksi subkutan sel H22. Setelah 3 hari injeksi sel H22, tikus tumor diobati dengan CTPG 8 kali. Berat badan tikus dan ukuran tumor dipantau pada titik waktu yang ditunjukkan. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6a, berat badan tikus di setiap kelompok tidak memiliki perbedaan yang signifikan, menunjukkan bahwa dosis CTPG yang dipilih tidak memiliki efek samping yang jelas. Menariknya, pertumbuhan tumor pada tikus yang diobati dengan CTPG 200 mg/kg dan 400 mg/kg secara signifikan dihambat (Gbr. 6b). Selain itu, dua dosis pengobatan CTPG sangat meningkatkan kelangsungan hidup tikus tumor (3/7, 3/7) dibandingkan dengan kelompok kontrol (0/7) pada akhir percobaan (Gbr. 6b). Kami juga menemukan bahwa CTPG secara signifikan meningkatkan proliferasi splenosit yang diisolasi dari tikus Kunming jantan dengan cara yang bergantung pada dosis (Gbr. 6c), menunjukkan bahwa CTPG memiliki efek imunostimulasi.

Diskusi

TCM telah digunakan untuk mengobati berbagai penyakit termasuk kanker sejak lama. Telah dilaporkan bahwa TCM dapat menginduksi apoptosis pada berbagai jenis sel tumor melalui jalur pensinyalan ekstrinsik (dimediasi reseptor kematian) dan intrinsik (bergantung pada mitokondria) untuk memberikan efek antitumor [22-25]. Kedua jalur tersebut masing-masing dapat mengaktifkan caspase-8 dan -9 [24, 26]. Di sini, kami menemukan bahwa CTPG secara signifikan menekan pertumbuhan sel H22 melalui induksi apoptosis dan penghentian siklus sel. Tingkat caspase yang dibelah -8 dan -9 secara signifikan diregulasi oleh pengobatan CTPG, menunjukkan bahwa jalur pensinyalan ekstrinsik dan intrinsik terlibat dalam induksi apoptosis. Penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa CTPG menginduksi apoptosis pada sel melanoma B16-F10 melalui jalur yang bergantung pada mitokondria yang meningkatkan tingkat caspase yang dibelah-9 tetapi tidak caspase-8 [16]. CTPG mungkin mengaktifkan jalur pensinyalan yang berbeda dalam berbagai jenis sel tumor.

Integritas membran mitokondria diatur secara ketat oleh anggota keluarga protein BCL-2 termasuk Bax dan Bcl-2 [27, 28]. Rasio Bax terhadap Bcl-2 memainkan peran penting dalam jalur apoptosis yang bergantung pada mitokondria [29]. Dalam sel H22 yang diobati dengan CTPG, rasio Bax/Bcl-2 secara signifikan diregulasi ke atas, yang mungkin menyebabkan pengurangan m dan pelepasan sitokrom c yang diamati dalam penelitian ini. Akibatnya, pro-caspase-9 dibelah dan diaktifkan. Akhirnya, inisiator caspase aktif-8 dan -9 mengaktifkan algojo caspase-3 untuk membelah PARP untuk mencegah perbaikan DNA. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa CTPG menginduksi apoptosis pada sel H22 melalui jalur pensinyalan ekstrinsik dan intrinsik.

Dalam model tikus tumor, CTPG secara signifikan menekan pertumbuhan H22 HCC dan sangat meningkatkan kelangsungan hidup tikus tumor. Menariknya, CTPG yang bergantung pada dosis mempromosikan proliferasi splenosit dari tikus Kunming, yang konsisten dengan penelitian kami sebelumnya [16].

Hasil ini menunjukkan bahwa CTPG dapat menekan pertumbuhan H22 HCC pada tikus melalui efek antitumor langsung dan peningkatan kekebalan tidak langsung.

Kesimpulan

CTPG menekan pertumbuhan sel H22 baik in vitro dan in vivo dan menginduksi apoptosis pada sel H22 melalui jalur pensinyalan ekstrinsik dan intrinsik. Data ini menunjukkan bahwa CTPG mungkin menjadi kandidat potensial untuk pengobatan HCC.