Bagian :Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosides Menginduksi Apoptosis Sel Karsinoma Hepatoseluler Oleh Jalur Tergantung Mitokondria Dan MAPK Dan Meningkatkan Efek Antitumor Melalui Kombinasi Dengan Cisplatin

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

Pengfei Yuan, Changshuang Fu, Yi Yang, Aipire Adila, Fangfang Zhou, Xianxian Wei, Weilan Zhang, Jie Lv, Yijie Li, Lijie Xia, Jinyao Li

Abstrak

Cistanche tubulosaadalah jenis obat herbal Cina dan memberikan berbagai fungsi biologis. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwaCistanche tubulosa fenilethanoid glikosida (CTPG)menunjukkan efek antitumor pada berbagai sel tumor. Namun, efek antitumor CTPG pada sel HepG2 dan BEL-7404 karsinoma hepatoseluler (HCC) masih sulit dipahami. Studi kami menunjukkan bahwa CTPG secara signifikan menghambat pertumbuhan sel HepG2 dan BEL-7404 melalui induksi penghentian siklus sel dan apoptosis, yang dikaitkan dengan aktivasi jalur MAPK yang ditandai dengan fosforilasi p38, JNK, yang diregulasi ke atas, dan ERK1/2 dan jalur yang bergantung pada mitokondria yang ditandai dengan pengurangan potensial membran mitokondria. Pelepasan sitokrom c dan pembelahan caspase-3, -7, -9, dan PARP selanjutnya ditingkatkan dengan pengobatan CTPG. Selain itu, CTPG secara signifikan menekan migrasi HepG2 dengan mengurangi kadar matriks metaloproteinase-2 dan faktor pertumbuhan endotel vaskular. Menariknya, CTPG tidak hanya meningkatkan proliferasi splenosit tetapi juga mengurangi apoptosis splenosit yang diinduksi oleh cisplatin. Dalam model tikus tumor H22, CTPG dikombinasikan dengan cisplatin lebih lanjut menghambat pertumbuhan sel H22 dan mengurangi efek samping cisplatin. Secara bersama-sama, CTPG menghambat pertumbuhan HCC melalui efek antitumor langsung dan efek peningkatan kekebalan tidak langsung dan meningkatkan kemanjuran antitumor cisplatin.

Kata kunci

Cistanche tubulosaglikosida fenilethanoid, apoptosis, jalur MAPK, jalur yang bergantung pada mitokondria, cisplatin, peningkatan kekebalan.

pengantar

Kanker hati diperkirakan menjadi kanker keenam yang paling sering didiagnosis dan penyebab utama keempat kematian akibat kanker di seluruh dunia pada tahun 2018, dengan sekitar 841 000 kasus baru dan 782.000 kematian setiap tahun di Asia Tenggara (Mongolia, Kamboja, dan Vietnam) .1 Di Cina, kanker hati adalah penyebab utama ketiga kematian terkait kanker pada tahun 2015.2 Lebih dari 90 persen kanker hati primer adalah karsinoma hepatoseluler (HCC) di seluruh dunia. Saat ini, hepatektomi, transplantasi hati, dan ablasi perkutan adalah metode utama untuk pengobatan HCC. Sayangnya, perawatan ini efektif untuk 30 persen pasien yang didiagnosis dengan kanker hati dini, sementara pasien yang didiagnosis dengan kanker hati lanjut (terhitung 40 persen) harus bergantung pada pengobatan paliatif untuk memperpanjang waktu kelangsungan hidup mereka.3,4 Sorafenib dalam kombinasi dengan hati kemoemboli arteri adalah terapi paliatif yang penting dan umum untuk sebagian besar pasien dengan HCC lanjut di kawasan Asia-Pasifik.5 Sorafenib, disetujui oleh FDA pada tahun 2006 untuk pengobatan kanker hati stadium lanjut, adalah inhibitor kinase ganda yang menghambat proliferasi sel tumor dan vaskularisasi. produksi dan mempromosikan apoptosis sel tumor. Sorafenib secara signifikan memperpanjang waktu kelangsungan hidup pasien 3 sampai 5 bulan tetapi memiliki efek samping yang serius dan terkait erat dengan terjadinya resistensi obat.6 Oleh karena itu, sangat mendesak untuk mengembangkan obat atau strategi baru untuk HCC.

Pengobatan Tradisional Cina (TCM) sendiri atau dalam kombinasi dengan strategi lain telah digunakan untuk mengobati HCC dan telah menunjukkan manfaat klinis termasuk memperpanjang waktu kelangsungan hidup, meningkatkan kualitas hidup, mengurangi efek samping, dan sebagainya.7,8Bentengadalah TCM yang mengandung fenilethanoid glikosida (PhGs), iridoid, lignin, dan polisakarida yang memiliki berbagai fungsi biologis, seperti anti-oksidasi, anti-inflamasi, anti-penuaan, peningkatan memori, dan fungsi peningkatan kekebalan.9 PhGs telah dianggap sebagai komponen aktif utama dariBenteng, dan memiliki banyak fungsi termasuk anti-oksidasi, anti-inflamasi, anti-apoptosis, hepatoprotection, dan neuroprotection.10-12 Kelompok kami telah melaporkan bahwaCistanche tubulosa fenilethanoid glikosida(CTPG) dapat menghambat pertumbuhan sel melanoma B16-F10, sel karsinoma esofagus Eca-109, dan sel HCC H22 melalui jalur pensinyalan ekstrinsik atau intrinsik secara in vitro atau in vivo; selain itu, CTPG memiliki efek imunostimulan.13-15

Dalam penelitian ini, kami menyelidiki efek antitumor dan mekanisme CTPG pada sel HepG2 dan BEL-7404 in vitro, menganalisis fungsi imunomodulator CTPG in vitro dan in vivo, dan mengevaluasi lebih lanjut efek terapeutik CTPG yang dikombinasikan dengan kemoterapi. obat cisplatin pada tikus tumor HCC H22 in vivo. Kami menemukan bahwa CTPG dapat menghambat pertumbuhan sel HepG2 dan BEL-7404 melalui apoptosis yang bergantung pada mitokondria dan jalur pensinyalan MAPK. CTPG secara signifikan menghambat migrasi sel HepG2 dengan mengurangi kadar matriks metaloproteinase-2 (MMP-2) ​​dan faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF). Selain itu, CTPG mempromosikan proliferasi dan aktivasi sel kekebalan dan meningkatkan kekebalan tikus. Yang penting, CTPG dikombinasikan dengan cisplatin lebih lanjut dapat menghambat pertumbuhan sel H22 in vivo dan mengurangi efek samping cisplatin.

Bahan dan metode

Hewan

Sekitar 6 sampai 8 minggu BALB/c jantan, tikus Kunming, dan tikus C57BL/6 betina dibeli dari Pusat Laboratorium Hewan, Universitas Kedokteran Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Cina) dan ditempatkan di fasilitas hewan Universitas Xinjiang dengan suhu kamar (RT) 25±3 derajat , dan periode terang-gelap 12/12 jam.

Garis Sel dan Kultur Sel

Sel H22 murine dibeli dari Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, China), dan sel HCC HepG2 dan BEL-7404 manusia diperoleh dari Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering , Universitas Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Cina) dan dikultur dalam medium RPMI 1640 (Gibco, USA) atau medium Eagle's (DMEM) (Gibco) yang dimodifikasi Dulbecco yang mengandung 10 persen serum janin sapi yang tidak diaktifkan panas (MRC, Cina), 1 persen L -glutamin (100mM), penisilin 100U/mL, dan streptomisin 100ug/mL pada suhu 37 derajat dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 5 persen CO2.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)

Senyawa utama CTPG (Upbio Tech Co., Ltd., Shanghai, China) dikualifikasi dan diukur dengan HPLC seperti yang dilaporkan sebelumnya.13 Kolom ZORBAX SB-C18 (250×4.6mm; 5μm) digunakan dan fase gerak terdiri dari 0,2 persen larutan asam format dan metanol dengan gradien dari 23 persen menjadi 31 persen. Sebanyak 10μL sampel disuntikkan dan dideteksi pada 330 nm. Standar echinacoside dan acteoside (Yuanye, Shanghai, China) digunakan untuk menganalisis komponen CTPG.

Analisis Viabilitas Sel

Efek antitumor CTPG pada sel HepG2 dan BEL-7404 dinilai menggunakan MTT (3-(4, 5-dimetil-2-tiazolil)-2, {{7 }}difenil-2-H-tetrazolium bromida). Sel HepG2 dan BEL-7404 disepuh ke dalam 96-pelat sumur (5 × 104 sel/sumur) dan diperlakukan dengan 0, 200, 400, dan 600 ug/mL CTPG selama 24 dan 48 jam, masing-masing, setelah 24 jam inkubasi pada 37 derajat. Sekitar 35 ug/mL cisplatin (Yuanye) digunakan sebagai kontrol positif. Kemudian 100 L MTT (0,5mg/mL, diencerkan dengan media tanpa media FBS) ditambahkan ke setiap sumur dan dikultur selama 3 jam pada 37 derajat dan 5 persen CO2. Setelah inkubasi, cawan disentrifugasi dengan kecepatan 1200 rpm selama 7 menit, media dibuang dan ditambahkan 200 ug/mL DMSO ke masing-masing sumur untuk melarutkan kristal formazan yang terbentuk. Nilai OD490 diukur dengan 96-pembaca lempeng mikro sumur (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Untuk mengevaluasi efek CTPG pada splenosit, sel diisolasi dari tikus C57BL/6 dan disepuh ke 96-piring sumur dengan kepadatan 1 × 105 sel/sumur. Splenosit diobati dengan 0, 200, 400, dan 600 ug/mL masing-masing selama 24, 48, dan 72 jam. Viabilitas sel dihitung sebagai rumus berikut: Viabilitas sel ( persen )=(ODtreated/ODuntreated) × 100 persen .

Deteksi Ki-67

Deteksi Ki{{0}} dilakukan sesuai dengan penelitian kami sebelumnya.16 Singkatnya, sel BEL-7404 diperlakukan dengan konsentrasi CTPG yang berbeda (0, 200, 400, dan 600ug/mL) atau cisplatin (35ug/mL). Setelah 24 jam, sel dipanen dan dicuci dengan PBS, kemudian difiksasi dan ditembus dengan Foxp3 Staining Buffer Set (eBioscience, USA) sesuai dengan instruksi pabrik. Pewarnaan intraseluler dilakukan menggunakan antibodi Ki-67 terkonjugasi FITC (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) selama 15 menit di RT. Sampel dianalisis dengan flow cytometry (BD FACSCalibur, CA, USA).

Analisis Apoptosis Sel dan Siklus Sel

Sel HepG2 dan BEL-7404 diunggulkan dengan kepadatan 2,5 × 105 sel/piringan dan diinkubasi pada suhu 37 derajat semalaman. Sel-sel ditripsinisasi dan dipanen dengan sentrifugasi setelah perlakuan dengan berbagai konsentrasi CTPG atau pra-perawatan dengan inhibitor caspase (Z-VAD-FMK) atau inhibitor caspase-3 (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, China) selama 2 jam sebelum pengobatan CTPG. Setelah 24 jam, apoptosis dideteksi dengan flow cytometry. Singkatnya, sel yang dikumpulkan dicuci dengan PBS dingin (Gibco) dan disuspensikan kembali dalam buffer pengikat annexin dengan 2.5μL Annexin V-FITC dan 5μL PI-PE Staining Solution (Solarbio, Beijing, China), dan kemudian sel diinkubasi di RT dalam gelap selama 15 menit. Untuk analisis distribusi siklus sel, sel dipanen setelah pengobatan CTPG dan difiksasi dalam etanol 70 persen dingin pada 4 derajat selama 30 menit. Sel diwarnai dengan PI (BD Biosciences) dalam gelap selama 30 menit. Sampel dianalisis dengan flow cytom eter (BD FACSCalibur). Tingkat ekspresi apoptosis sel dan protein terkait siklus dideteksi oleh Western blot.

Western Blot

Western blot dilakukan sesuai dengan penelitian kami sebelumnya.17 HCC diobati dengan CTPG selama 24 jam. Setelah dicuci dengan PBS dingin dua kali, semua sel yang melekat dan mengambang dikumpulkan dan dilisiskan dalam RIPA Lysis Buffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) selama 20menit di atas es. Setelah sentrifugasi pada 12000 rpm 4 derajat selama 10 menit, konsentrasi protein ditentukan menggunakan Kit Uji Asam Bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific, USA) sesuai dengan instruksi pabrik. Konsentrasi protein yang sama dipisahkan oleh 12 persen SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran PVDF. Setelah dicuci dengan buffer PBST (PBS dengan 0,05 persen Tween-20), membran diblokir dengan 5 persen susu non-lemak pada suhu 37 derajat selama 1 jam dan kemudian diinkubasi dengan antibodi primer (Cell Signaling Technology, MA, USA ) pada pengenceran yang tepat semalam pada 4 derajat . Setelah dicuci 3 kali dengan PBST, membran diinkubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi HRP (eBioscience) yang sesuai selama 2 jam pada suhu 37 derajat. Protein target dideteksi menggunakan kit uji ECL (Beyotime). Data pemindaian skala abu-abu diperoleh dengan Image J.

Analisis Potensi Membran Mitokondria (Δψm)

m ditentukan oleh pewarna JC-1 membran-permeabel (Beyotime). Secara singkat, sel HepG2 dan BEL-7404 diperlakukan dengan konsentrasi CTPG yang berbeda (0, 200, 400, dan 600ug/mL) selama 24 jam. Semua sel dikumpulkan dan dicuci dengan buffer pencuci JC-1. Sel diwarnai dengan probe fluoresen JC-1 sesuai dengan instruksi pabrik selama 20 menit di RT. Setelah dicuci dengan PBS dua kali, semua sampel dianalisis dengan flow cytometry (BD FACSCalibur).

Pewarnaan Hoechst 33342

Pewarnaan Hoechst 33342 dilakukan sesuai dengan penelitian kami sebelumnya.16 Perubahan morfologi inti diperiksa menggunakan pewarna pengikat DNA permeabel membran Hoechst 33342 (Beyotime). Secara singkat, sel-sel diinokulasi dalam pelat sumur 6-pada konsentrasi 1x105 sel/sumur dalam media 2mL. Ketika mencapai 70 persen sampai 80 persen pertemuan, sel-sel diperlakukan dengan 200, 400, dan 600ug/mL CTPG atau cisplatin selama 24 jam. Sel-sel dicuci dengan PBS dan difiksasi dengan 4 persen paraformaldehida dingin pada 4 derajat selama 10 menit. Setelah dicuci dengan PBS, sel diwarnai dengan Hoechst 33342 pada 4 derajat selama 10 menit. Sampel diamati dengan mikroskop fluoresensi terbalik (Nikon Eclipse Ti-E, Jepang).

Uji Migrasi

Migrasi sel HCC terdeteksi melalui uji penyembuhan luka. Singkatnya, sel HepG2 (2×104 /sumur) diunggulkan dalam piringan 24-sumur. Setelah mencapai pertemuan 80 persen, bagian tengah setiap sumur digores sekali dengan ujung pipet 20μL. Setelah dicuci dengan PBS, sel diperlakukan dengan cisplatin (35ug/mL) atau konsentrasi yang berbeda (0, 200, 400, dan 600ug/mL) CTPG pada 37 derajat. Setelah 24 jam, gambar masing-masing sampel diambil di bawah mikroskop (Nikon Eclipse Ti-E). Jarak rata-rata migrasi sel dianalisis dengan Image J. Persentase penyembuhan luka dihitung dengan persamaan: penyembuhan luka ( persen )=(1−area goresan pada titik waktu yang ditunjukkan/area goresan pada 0jam)×100 persen. Tingkat ekspresi protein terkait migrasi sel MMP-2 dan VEGF dideteksi oleh Western blot.

Proliferasi dan Apoptosis Splenosit

Untuk analisis proliferasi, splenosit diisolasi dari 3 tikus C57BL/6 dan diwarnai dengan CFSE (eBioscience). Sel berlabel CFSE diinokulasi ke dalam 24-pelat sumur dengan kepadatan 2 × 106 sel dalam media 1 mL per sumur dan diperlakukan dengan konsentrasi CTPG yang berbeda (200, 400, dan 600 ug/mL) atau dikombinasikan dengan 35 ug /mL cisplatin selama 72 jam. Analisis flow cytometry dilakukan setelah pewarnaan dengan CD3-APC dan CD19-PE (BD Biosciences). Untuk analisis apoptosis, splenosit diinokulasi ke dalam 24-pelat sumur dengan kepadatan 2 × 106 sel dalam media 1 mL per sumur dan diperlakukan dengan konsentrasi CTPG yang berbeda (200, 400, dan 600 ug/mL) atau dikombinasikan dengan cisplatin selama 24 jam. Analisis flow cytometry dilakukan setelah pewarnaan dengan 2.5 L Annexin V-FITC dan 5 L PI-PE Solution.

Evaluasi Keamanan dan Aktivitas Imunostimulasi CTPG Di Vivo

Untuk mengevaluasi aktivitas imunostimulator in vivo CTPG, tikus Kunming jantan 6 sampai 8 minggu secara acak dibagi menjadi 7 kelompok (5 tikus/kelompok). Injeksi subkutan (sc, 200, 400 mg/kg), injeksi intraperitoneal (ip, 200, 400 mg/kg), dan pemberian intragastrik (ig, 200, 400 mg/kg) diterapkan setiap 2 hari dengan total 7 kali , sedangkan kelompok kontrol tidak mendapat perlakuan apapun. Mencit ditimbang setiap dua hari sekali dan status mencit diamati setiap hari. Setelah perlakuan CTPG, organ mencit dipisahkan dan ditimbang. Indeks organ dihitung menurut rumus: indeks organ=berat organ (mg)/berat badan (g). Splenosit dikumpulkan, dihitung, dan diwarnai dengan anti-CD3-APC, anti-CD19-PE, anti-CD49b FITC atau anti-CD4-APC, anti-CD{{ 22}}PE, anti-CD8-FITC (BD Biosciences). Sampel dideteksi dengan flow cytometry (BD FACSCalibur).

Khasiat Antitumor CTPG Dikombinasikan dengan Cisplatin pada Tikus yang Mengandung Tumor H22

Sekitar 6 sampai 8 minggu tikus BALB/c jantan disuntik secara subkutan dengan sel H22 (1,0 × 106 per tikus dalam 100 L PBS). Ketika volume tumor mencapai sekitar 60mm3, tikus pembawa tumor secara acak dibagi menjadi 4 kelompok (6 tikus/kelompok) dan diobati dengan cisplatin (4mg/kg), CTPG (400mg/kg), cisplatin (4mg/kg) plus CTPG ( 400mg/kg), atau tanpa pengobatan (kelompok kontrol), masing-masing. Tikus tumor disuntik secara intraperitoneal dengan CTPG pada hari ke 5, 7, 9, 11, dan 13, masing-masing. Cisplatin disuntikkan secara intravena pada hari ke-7 dan ke-11. Volume tumor dan berat badan diukur setiap hari. Volume tumor dihitung sebagai berikut: Volume tumor (V)=a × b2 /2, di mana a dan b masing-masing mewakili diameter tumor terpanjang dan terpendek yang diukur dengan vernier caliper. Pada hari ke-20, organ dan tumor diisolasi dan ditimbang. Splenosit dikumpulkan, dihitung, dan diwarnai dengan anti-CD3-APC dan anti-CD19-PE atau anti-CD4-FITC dan anti-CD8-APC atau anti-CD11b-PE dan anti-Gr-1-APC atau anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC, dan anti-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Selanjutnya, frekuensi dan jumlah sel dianalisis dengan flow cytometry (BD FACSCalibur).

Analisis statistik

Semua data dinyatakan sebagai mean±standard error of mean (SEM). Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan one/two-way analysis of variance (ANOVA) menggunakan software Prism5.0. P<.05 was="" considered="" statistically="">

Hasil

CTPG Menghambat Proliferasi Sel HCC In Vitro

Komponen CTPG dikualifikasi dan dikuantifikasi dengan HPLC menggunakan standar echinacoside dan acteoside (Tambahan Gambar 1A), yang merupakan komponen utama glikosida fenilethanoid dari Cistanche. 18 Menurut waktu retensi puncak dan area puncak, CTPG mengandung 28 persen echincoside dan 9,9 persen acteoside. Selain itu, kandungan polisakarida dalam CTPG adalah 34,8 persen dengan metode asam fenol-sulfat.19 Uji MTT menunjukkan bahwa CTPG secara signifikan mengurangi viabilitas sel BEL-7404 dan HepG2 dengan cara yang bergantung pada dosis dan waktu ( Gambar 1A). Secara konsisten, proliferasi sel BEL-7404 secara signifikan dihambat oleh pengobatan CTPG, yang dianalisis dengan pewarnaan Ki-67 (Gambar 1B). Pengaruh CTPG pada proliferasi splenosit in vitro juga dianalisis dengan uji MTT. Kami mengamati bahwa CTPG meningkatkan proliferasi splenosit dengan cara yang bergantung pada dosis (Gambar 1C).

Jalur pensinyalan protein kinase yang diaktifkan mitogen (MAPK) memainkan peran penting dalam kelangsungan hidup, diferensiasi, dan resistensi obat sel kanker manusia.20 Untuk menyelidiki apakah jalur pensinyalan MAPK terlibat dalam efek penghambatan CTPG pada proliferasi sel HCC, tingkat fosforilasi berbagai protein dari jalur sinyal MAPK dianalisis dalam sel HepG2 setelah pengobatan dengan CTPG pada konsentrasi yang berbeda dan titik waktu yang berbeda. Fosforilasi JNK (P-JNK) dan p38 (P-p38) ditingkatkan tergantung dosis dengan pengobatan CTPG. Fosforilasi ERK (P-ERK) diatur ke bawah oleh pengobatan CTPG 200 dan 400ug/mL, sementara P-ERK diatur ke atas di bawah pengobatan CTPG 600ug/mL (Gambar 1D). Selain itu, kadar P-JNK, P-p38, dan P-ERK diatur ke atas dengan cara yang bergantung pada waktu (Gambar 1D). Hasil ini menunjukkan bahwa CTPG dapat menghambat proliferasi sel HCC melalui jalur pensinyalan MAPK

Penangkapan Siklus Sel HCC yang Diinduksi CTPG pada Fase S

Kami selanjutnya menganalisis apakah CTPG menghambat proliferasi sel HCC melalui induksi penghentian siklus sel. Setelah pengobatan dengan CTPG, akumulasi sel BEL-7404 pada fase S diamati dengan cara yang bergantung pada dosis. Demikian pula, CTPG juga menginduksi penghentian siklus sel HepG2 pada fase-S dan frekuensinya meningkat dari 40,66 persen pada kelompok kontrol menjadi 61,90 persen pada kelompok perlakuan CTPG 600ug/mL (Gambar 2A). Cyclins dan cyclin-dependent kinases (CDKs) memainkan peran penting dalam kontrol dan pengembangan pembelahan sel,21 di antaranya terkait dengan fase G2/M. perkembangan fase S. Tingkat ekspresi Cyclin B1, CDK1, dan CDK2 juga berkurang; protein ini dikaitkan dengan fase G2/M (Gambar 2B). Hasil ini menunjukkan bahwa CTPG menekan proliferasi sel HCC dengan menginduksi penghentian siklus sel.

Jalur Apoptosis Bergantung Mitokondria yang Diaktifkan CTPG dalam Sel HCC

Kami juga mendeteksi apakah CTPG memicu apoptosis pada sel HCC dan menemukan bahwa CTPG menginduksi apoptosis pada sel HepG2 dan BEL-7404 dengan cara yang bergantung pada dosis (Gambar 3A). Selain itu, tingkat ekspresi Bax dan Bcl-2 masing-masing meningkat dan menurun dengan pengobatan CTPG dengan cara yang bergantung pada dosis (Gambar 3B). Apoptosis sel HepG2 selanjutnya ditentukan dengan pewarnaan Hoechst 33342 setelah pengobatan dengan CTPG selama 24 jam. Morfologi inti diamati dengan mikroskop fluoresensi terbalik. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3C, sel-sel HepG2 kontrol diwarnai secara homogen sementara sel-sel HepG2 yang diobati dengan CTPG menunjukkan kondensasi dan fragmentasi kromatin dengan cara yang bergantung pada dosis, yang mirip dengan sel-sel HepG2 yang diobati dengan cisplatin. Hasil ini menunjukkan bahwa CTPG menginduksi apoptosis sel HCC.

Integritas membran luar mitokondria diatur secara ketat oleh keluarga Bcl-2 dan reduksi m mendorong pelepasan sitokrom c yang mengaktifkan kaskade kaspase untuk menginduksi apoptosis.23,24 Ketika m menurun, JC{{ 3}} polimer (fluoresensi merah) terurai menjadi monomer (fluoresensi hijau).25 Oleh karena itu, m sel HCC dideteksi dengan pewarnaan JC-1 setelah pengobatan CTPG selama 24 jam. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4A, intensitas fluoresensi hijau dari saluran FL-1 bergantung pada dosis meningkat dengan pengobatan CTPG sementara intensitas fluoresensi merah dari saluran FL-2 menurun tergantung dosis pada keduanya. BEL-7404 dan sel HepG2. Pengamatan mikroskop fluoresensi terbalik menunjukkan hasil yang serupa (Gambar 4B), menunjukkan bahwa CTPG mengurangi m sel HCC. Selanjutnya, kami mengamati bahwa kadar sitokrom c meningkat pada sel BEL-7404 dan HepG2 setelah pengobatan CTPG (Gambar 4C), yang selanjutnya mengkonfirmasi pengurangan m pada sel HCC yang diobati dengan CTPG.

Pelepasan sitokrom c dapat mengaktifkan inisiator caspase-9 untuk menginduksi apoptosis.26 Hasil uji Western blot menunjukkan bahwa tingkat cleaved caspase-3, -7, dan{{4} } meningkat sedangkan level cleaved caspase-8 tidak berubah (Gambar 5). Caspase yang diaktifkan-3 dapat membelah enzim perbaikan DNA dari poli (ADP-ribosa) polimerase (PARP) untuk mencegah perbaikan DNA dan mengakumulasi kerusakan DNA.27 Kami juga mengamati kadar PARP yang diregulasi ke atas. Peran kaskade kaskade dalam apoptosis sel HCC yang diinduksi oleh CTPG selanjutnya ditentukan dengan menggunakan penghambat kaspase (Z-VAD-FMK) dan penghambat kaspase-3 (Ac-DEVD-CHO). Z-VAD-FMK secara signifikan membalikkan apoptosis sel BEL-7404 dan HepG2 yang diinduksi oleh CTPG (Gambar Tambahan 1B). Demikian pula, Ac-DEVD-CHO juga secara signifikan membalikkan apoptosis sel HepG2 yang diinduksi oleh CTPG (Tambahan Gambar 1C). Hasilnya menunjukkan bahwa CTPG menginduksi apoptosis sel HCC melalui jalur yang bergantung pada mitokondria.

CTPG Menekan Migrasi Sel HCC In Vitro

Migrasi sel kanker dianggap sebagai salah satu proses penting dalam metastasis tumor. Untuk menentukan apakah CTPG mempengaruhi migrasi sel HCC, motilitas sel HepG2 dievaluasi dengan uji penyembuhan luka. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6A dan B, migrasi sel HepG2 secara signifikan dihambat oleh pengobatan CTPG dengan cara yang bergantung pada dosis. Keluarga MMP dan VEGF memainkan peran penting dalam migrasi sel tumor.28 Setelah pengobatan CTPG selama 24 jam, kadar MMP-2 dan VEGF menurun secara signifikan (Gambar 6C), menunjukkan bahwa CTPG mungkin menekan invasi dan metastasis dari HCC.

CTPG Meningkatkan Kekebalan Tikus

Telah dilaporkan bahwa polisakarida Cistanche deserticola memiliki fungsi imunomodulator termasuk mempromosikan proliferasi limfosit dan mengaktifkan makrofag.29 Sel T dan sel B adalah limfosit utama, yang masing-masing memediasi respon imun seluler dan humoral. CTPG mengandung 34,8 persen kandungan polisakarida. Oleh karena itu, kami memeriksa efek CTPG pada proliferasi sel T dan sel B. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2A Tambahan, CTPG secara signifikan meningkatkan proliferasi sel T dan sel B dengan cara yang bergantung pada dosis, bahkan dengan adanya cisplatin. Menariknya, CTPG secara signifikan menghambat apoptosis splenosit yang diinduksi oleh cisplatin (Gambar 2B Tambahan), menunjukkan bahwa CTPG dapat memperbaiki efek samping cisplatin pada sistem kekebalan tikus.

Lanjutkan membaca, untuk berpisah ...