Sifat anti-melanogenesis dan anti-tirosinase dari Pistacia atlantica subsp. ekstrak mutica pada sel melanoma murine B16F10

Kontak: ali.ma@wecistanche.com

Samira Eghbali-Feriz1, Akram Taleghani2, Hadi Al-Najjar3, Seyed Ahmad Emami1, Homa Rahimi4, Javad Asili1, Samira Hasanzadeh1, dan Zahra Tayarani-Najaran5,*

Abstrak:Pistacia atlantica (P. atlantica) subsp. mutica telah digunakan dalam pengobatan tradisional dan terkenal dengan khasiat obatnya. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh metanol (MeOH), n-heksana, diklorometana (CH2Cl2), n-butanol (BuOH), etil asetat (EtOAc), ekstrak air dan minyak atsiri P. atlantica subsp. mutica pada sintesis melanin dan stres oksidatif pada lini sel melanoma B16F10. Viabilitas sel B16F10 setelah pengobatan dengan peningkatan konsentrasi ekstrak tanaman yang berbeda (0.2-200 g/mL) diukur menggunakan resazurin. Komposisi minyak atsiri diidentifikasi dengan analisis gas-chromatography-mass spectrometry (GC-MS) dan efek penghambatan pada sintesis melanin, jamurtirosinaseaktivitas, tirosinase seluler, dan stres oksidatif dievaluasi dengan metode kolorimetri dan fluorometrik. Data menunjukkan ekstrak pada konsentrasi 0.2-200 g/mL, tidak menunjukkan toksisitas yang signifikan pada sel melanoma tetapi konsentrasi 200 g/mL minyak esensial memiliki efek sitotoksik. Pistacia atlantica subsp. mutica bisa menghambat jamurtirosinaseaktivitas. Juga, jumlah melanin dalam sel B16F10 menurun. Selain itu, kemampuan P. atlantica subsp. ekstrak mutica dalam mengurangi jumlah spesies oksigen reaktif dalam sel melanoma mengungkapkan luar biasaantioksidanaktivitas. Selain itu, semua konsentrasi minyak atsiri tidak berpengaruh signifikan dalam penelitian ini. Itumelanogenesispenghambatan danantioksidanefek P. atlantica subsp. mutica pada sel B16F10 dapat menunjukkan potensi aktivitas pemutihan tanaman untuk digunakan dalam produk perawatan kulit dermatologis dan untuk pencegahan penuaan kulit dalam industri kosmetik.Kata kunci:Anti-tirosinase; Melanogenesis; P. atlantika subsp. mutika.

Klik untukmanfaat cistanche untuk anti-oksidan

PENGANTAR

Melanin adalah pigmen kulit yang disintesis dalam melanosom dan ditransfer ke keratinosit melalui proses fisiologis yang disebutmelanogenesis. Melanin memainkan peran penting dalam perlindungan terhadap kerusakan UV dan menentukan warna kulit, rambut dan mata. Kelebihan produksi melanin dikaitkan dengan melanoma dan pigmentasi abnormal pada kulit (1-3). Enzim kunci dalam biosintesis melanin adalah tirosinase yang mengkatalisis dua reaksi terpisah, oksidasi 3,4-dihidroksi-fenilalanin (DOPA) menjadi dopakuinon dan hidroksilasi L-tirosin menjadi DOPA (4).Tirosinaseatau polifenol oksidase adalah enzim fungsi campuran yang mengandung tembaga yang ditemukan pada mikroorganisme, hewan, dan tumbuhan (5). Tirosinase adalah faktor yang paling mempengaruhi pencoklatan buah dan sayuran. Produksi berlebihan dan akumulasi melanin dapat menyebabkan sejumlah besar gangguan kulit termasuk melasma, bintik-bintik, melanosis matahari, dan bintik-bintik penuaan (6). Karena itu,tirosinaseinhibitor telah menarik banyak minat dalam industri makanan dan kosmetik. Dalam banyak organisme hidup, oksidasi sangat penting untuk produksi energi untuk bahan bakar proses biologis.

Namun, hidrogen peroksida (H2O2) dan spesies oksigen reaktif lainnya (ROS)- menyebabkan kematian sel dan kerusakan jaringan pada banyak fenomena fisiologis dan patologis termasuk peningkatan ROS setelah penyinaran UV selama proses melanogenesis. Juga, diketahui bahwa produksi ROS yang diinduksi UV terlibat dalam patogenesis beberapa kondisi kulit termasuk penuaan, kerutan, fotosensitifitas, dan keganasan (7). Dengan demikian, menemukan sumber alamiantioksidandengan anti-tirosinaseaktivitas membantu untuk memodifikasi kerusakan kulit yang berhubungan dengan kelebihanmelanogenesis (4).

Genus Pistacia adalah anggota famili Anacardiaceae yang terdiri dari sekitar 9 spesies dan sebagian besar tersebar di wilayah Mediterania, Eropa, dan beberapa bagian Asia (8,9). Pistacia atlantica (P. atlantica)Desf. memiliki 3 subspesies yaitu : P. atlanticasubsp. kurdica (Zohary) Rech. f., P. atlanticasubsp. mutica (Fischer & CA Meyer) Rech. f. dan P. atlantica subsp. cabulica (Saham) Rech. f. Tiga subspesies P. atlantica, P. khinjuk Stocks, dan P. vera L. yang disebutkan di atas ditanam di Iran (10). Buah dari P. atlanticasubsp. mutica yaitu Baneh berbentuk bulat sampai lonjong dengan diameter 0,5-0.7 cm. Aktivitas antioksidan dan antikanker dari lambung P. atlantica telah dikaitkan dengan kandungan total fenolik tanaman yang tinggi. P. atlantica secara tradisional telah digunakan untuk menghilangkan ketidaknyamanan dan nyeri perut bagian atas, dispepsia, dan tukak lambung (11-13). Namun, tidak ada penelitian tentang aktivitas penghambatan melanogenesis P. atlantica subsp. mutika. Jadi, dalam proyek ini, kami memilih sel melanoma B16F10 untuk mempelajari sifat antioksidan dan anti-melanogenik P. atlantica subsp. ekstrak mutika. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek penghambatan ekstrak metanol (MeOH), n-heksana, diklorometana (CH2Cl2), n-butanol (BuOH), etil asetat (EtOAc), air (H2O) dan minyak atsiri P. atlantika subsp. buah muticamelanogenesisdan untuk mengevaluasi potensiantioksidankapasitas tanaman pada sel melanoma B16F10.

BAHAN DAN METODE

Bahan kimia

Jamurtirosinasedari Agaricus bisporus, asam kojic, resazurin, L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), dichloro dihydro-fluorescein diacetate (DCFH-DA), asam egtazic (EGTA), dimethyl sulfoxide (DMSO ), phenylmethylsulfonyl fluoride, glycerophosphate, -mercaptoethanol, phosphate-buffered saline (PBS), sodium orthovanadate, tris-buffered saline tween 20 (TBST) yang dibeli dari Sigma (AS). Fetal bovine serum (FBS), penisilin, streptomisin, dan tripsin-EDTA diperoleh dari GibcoBRL (Grand Island, USA). Garis sel melanoma (B16F10, Cat. No C540) dibeli dari Institut Pasteur Iran (Tehran, IR Iran). Semua bahan kimia dan pelarut lainnya berasal dari Merck (Jerman).

Persiapan ekstrak

P. atlantika subsp. mutica dikumpulkan pada Mei 2014 dari Pegunungan Bardaskan, provinsi Khorasan Razavi, timur laut Iran dan diidentifikasi oleh Ny. M. Souzani. Spesimen voucher (No: 13069) disimpan di herbarium Sekolah Farmasi, Universitas Ilmu Kedokteran Mashhad, Mashhad, IR Iran. Buah mentah P. atlantica subsp. mutica (200 g) digiling dengan blender (Toos chekan Co, IR Iran) dan kemudian diresapi dengan MeOH pada suhu kamar selama 24 jam sesuai dengan protokol yang dilaporkan sebelumnya (14). Setelah ekstraksi, pelarut diuapkan menggunakan rotary evaporator dan kemudian dikeringkan dengan cara dibekukan. Ekstrak metanol (94 g) selanjutnya difraksinasi dengan partisi pelarut-pelarut untuk menghasilkan lima fraksi yang berbeda yaitu MeOH, n-heksana, CH2Cl2, BuOH, EtOAc, dan H2O.

Isolasi minyak esensial

Buah mentah P. atlantica subsp.mutica (150 g) menjadi sasaran hidrodistilasi menggunakan peralatan tipe Clevenger selama 3 jam. Minyak tidak berwarna diperoleh dengan rendemen 0,8 persen (v/b). Minyak atsiri yang diperoleh dikeringkan di atas natrium sulfat anhidrat dan disimpan pada suhu 4 derajat dalam gelap sampai pengujian lebih lanjut.

Kromatografi gas dan kromatografi gas-spektrometri massa

Analisis kromatografi gas (GC) dilakukan dengan menggunakan Varian CP{{0}} yang dilengkapi dengan detektor FID, dihubungkan dengan kolom silika leburan (CP-Sil 8CB, 50 m × 0,25 mm, ketebalan film 0,12 m) di bawah kondisi berikut: suhu oven 50-250 derajat dengan laju 3 derajat / menit; suhu injektor 260 derajat, rasio split 1:5, dengan gas pembawa, laju alir N2 2 mL/menit; Detektor suhu 280 derajat.

Analisis massa-kromatografi gas (GC-MS) dilakukan dengan menggunakan peralatan Agilent 5975 yang dilengkapi dengan kolom HP-5 MS (30 m × 0.25 mm id, {{ 14}}.Ketebalan film 25 m) dihubungkan dengan detektor massa empat kali lipat dan komputer yang dilengkapi dengan perpustakaan Wiley 7n.L. Suhu oven 50-250 derajat dengan laju 3 derajat / menit, suhu injektor 250 derajat , volume injeksi: 0,1 L, injeksi split dengan rasio split 1:50, dengan laju aliran gas pembawa (helium) 1 mL/ min, sumber ion: 70 eV, arus ionisasi: 150 A, dan rentang pemindaian: 35-465. Identifikasi komponen minyak atsiri berdasarkan kromatografi gas retensi yang diperoleh dengan mengacu pada seri n-alkana (C6-C20) pada kolom HP-5MS, perbandingan spektrum massa dan pola fragmentasi dilaporkan dalam literatur, dan pencocokan komputer dengan perpustakaan Wiley 7n.L (15). Kuantifikasi jumlah relatif dari masing-masing komponen buah mentah dilakukan menurut metode persentase area tanpa pertimbangan faktor kalibrasi.

Budaya sel

Garis sel melanoma, B16F10, dipertahankan pada 37 derajat dalam atmosfer yang dilembabkan (90 persen) yang mengandung 5 persen CO2. Sel dikultur dalam RPMI-1640 (Bioidea, Iran) dengan 10 persen (v/v) FBS, 100 IU/mL penisilin, dan 100 g/mL streptomisin. Larutan stok P. atlantica subsp. mutica disiapkan pada 50 g/mL di DMSO dan disimpan pada derajat -40. Asam kojic (2 dan 4 mM) digunakan sebagai kontrol positif di semua percobaan. Sel dikultur di 96-piring sumur dengan kepadatan 105 sel/mL. Aktivitas ekstrak dalam setiap percobaan dihitung menggunakan persamaan berikut:

persen aktivitas=Absorbansi sampel/Penyerapan kontrol * 100

Uji viabilitas sel

Resazurin adalah indikator kesehatan sel yang menggunakan daya pereduksi sel hidup dan diubah menjadi resorufin. Resazurin adalah senyawa biru, tidak beracun, tidak berfluoresensi, dan permeabel sel yang berubah menjadi warna merah dan resorufin berfluoresensi tinggi dalam sel hidup (16). Sekitar 104 sel melanoma B16F10 diunggulkan di setiap sumur pelat 96-microwell dan diperlakukan dengan berbagai konsentrasi ekstrak dan minyak esensial P. atlantica subsp. mutica (0.2-200 g/mL). Setelah inkubasi 4 jam, absorbansi resazurin dan resorufin diukur pada 570 nm dan 600 nm menggunakan pembaca microplate H4 Hybrid Multi-Mode (BioTek, Winooski, USA). Setiap percobaan dilakukan dalam rangkap tiga. Konsentrasi penghambatan setengah maksimal (IC50) dihitung menggunakan perangkat lunak GraphPad dari kurva efek konsentrasi: konsentrasi log vs respons.

Uji aktivitas tirosinase jamur

Aktivitas jamurtirosinasedalam oksidasi L-DOPA diukur secara spektrofotometri seperti yang dijelaskan sebelumnya (17), dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, 160 L 5 mM L-DOPA (dalam 100 mM buffer natrium fosfat pH 6,8) dan 20 L buffer yang sama dengan dan tanpa P. atlanticasubsp. ekstrak mutica dan minyak atsiri (10-1000 g/mL) dicampur dengan 20 L tirosinase jamur (200 unit/mL) kemudian diinkubasi pada suhu 37 derajat selama 30 menit. Absorbansi diukur pada 475 nm dengan pembaca microplate Synergy H4 Hybrid Multi-Mode (BioTek, Winooski, USA).

Penentuan kandungan melanin dalam sel melanoma

Sel melanoma, B16F10, diunggulkan dengan kepadatan 105 sel per lubang di 96-pelat kultur sumur dan diinkubasi selama 24 jam. Mereka kemudian diinkubasi dengan konsentrasi yang berbeda (0.2-200 g/mL) P. atlantica subsp. ekstrak mutica dan minyak esensial selama 24 jam. Kandungan melanin diukur seperti yang dijelaskan sebelumnya (18). Setelah perawatan, sel-sel dikumpulkan menggunakan tripsin. Mereka dicuci dengan PBS. Pelet sel dilarutkan dalam 50 L larutan natrium hidroksida (2 M) selama 60 menit pada 60 derajat. Kandungan melanin diukur dengan mengukur absorbansi pada 405 nm dengan pembaca microplate Synergy H4 Hybrid Multi-Mode (BioTek, Winooski, USA).

Uji aktivitas tirosinase seluler

Oksidasi DOPA menjadi DOPA krom dianalisis dengan spektrofotometri sebagai indikatortirosinasekegiatan (18). 106 sel melanoma B16F10 dilapisi di setiap sumur 96-piring sumur semalaman. Setelah perlakuan sel dengan konsentrasi berbeda (0.2-200 g/mL) P. atlantica subsp. ekstrak mutica dan minyak esensial selama 24 jam, Sel-sel dipisahkan menggunakan tripsin; dicuci dengan PBS, dan dilisiskan dengan 50 L buffer natrium fosfat (pH 6,8, 100 mM) yang mengandung 1 persen triton X-100 dan 0,1 mM fenilmetilsulfonil fluorida. Lisat disentrifugasi pada 10,000 rpm selama 20 menit pada 4 derajat. 100 L masing-masing lisat (masing-masing mengandung 100 mg protein) dicampur dengan 30 L 5 mM DOPA dalam 96 well plate dan diinkubasi pada suhu 37 derajat selama 2 jam, absorbansi diukur pada 475 nm dengan pembaca microplate Synergy H4 Hybrid Multi-Mode (BioTek, Winooski, AS).

Penentuan tingkat spesies oksigen reaktif seluler

Tingkat spesies oksigen reaktif diukur seperti yang dijelaskan sebelumnya dengan sedikit modifikasi (19). Sel melanoma, B16F10, (2 × 104) diunggulkan di 96-piring sumur semalaman dan kemudian diperlakukan dengan konsentrasi yang berbeda (0.2-200 g/mL) P. atlantica subsp . ekstrak mutica dan minyak esensial selama 24 jam. Kemudian sel diinkubasi dengan 50 L H2O2 (24 mM) pada suhu 37 derajat selama 30 menit. Kemudian 50 L DCFH-DA ditambahkan ke sel dan intensitas fluoresensi DCF diukur pada emisi 504 nm dan eksitasi 524 nm menggunakan pembaca pelat mikro Synergy H4 (BioTek, USA).

Analisis blotting barat

Sel melanoma, B16F10, dikultur dalam labu 75 cm3 dengan dan tanpa ekstrak metanol (0.5-100 g/mL) selama 24 jam. Sel-sel kemudian dilisiskan dalam buffer (50 mM tris-HCl, pH 7,4, 2 mM EGTA, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida, 10 mM gliserofosfat, 10 mM -merkaptoetanol, 1 mM natrium ortovanadat, 0,1 persen asam deoksikolat garam natrium). Jumlah protein yang sama (50 g) dimuat pada 12 persen elektroforesis gel natrium dodesil sulfat (SDS)-poliakrilamida dan dipindahkan ke membran polivinilidena difluorida. Membran diblokir selama 2 jam dalam 10 persen susu skim dalam buffer TBST (20 mM tris-HCl pH 7,4, 100 mM NaCl, dan 0,1 persen tween 20) pada suhu kamar. Setelah dicuci dengan buffer TBST, membran kemudian diinkubasi semalaman dengan antibodi primer 1:300 (antibodi kelinci).tirosinaseantibodi (Santa Cruz Biotechnology, CA)). Setelah dibilas 3 kali dengan buffer TBST, membran kemudian diinkubasi selama 2 jam dengan IgG anti-kelinci (1:2000) sebagai antibodi sekunder (pensinyalan sel). Pembilasan 3 kali dengan buffer TBST diulang dan pita protein dideteksi menggunakan sistem deteksi prime western blotting chemiluminescent (ECL) yang ditingkatkan (BioRaD, USA) (20). Antibodi anti- -aktin digunakan sebagai kontrol pemuatan.

Analisis statistik

Hasil relatif dari percobaan disajikan sebagai mean ± SD dari tiga pengukuran independen. Analisis varians dan perhitungan IC50 dilakukan dengan GraphPad Prism 6.0 menggunakan uji ANOVA satu arah dan reratanya dibandingkan dengan uji Dunnett. P <0,05 berarti="" perbedaan="" yang="" signifikan="" secara="" statistik="" antara="" sel="" yang="" diberi="" ekstrak="" dan="" kontrol.="" tes="" anova="" dua="" arah="" dan="" post-test="" perbandingan="" bonferroni="" digunakan="" untuk="" membandingkan="" efek="" ekstrak="" yang="" berbeda="" di="" setiap="">

HASIL

Komposisi minyak esensial

Kromatografi gas telah digunakan untuk kuantifikasi dan Gc-Mass untuk identifikasi senyawa. Hasil analisis GC dan GC-MS disajikan dalam tabel identifikasi kuantitatif dan kualitatif senyawa. Dalam kasus P. atlanticasubsp. mutica, 68 konstituen diidentifikasi dalam minyak esensial dan menyumbang 99,8 persen dari total komposisi minyak (Tabel 1). Kelompok senyawa minyak atsiri ditentukan sebagai hidrokarbon monoterpen 86.5 persen , monoterpen teroksigenasi 3,7 persen , hidrokarbon seskuiterpen 8,7 persen , seskuiterpen teroksigenasi 0.1 persen , dan lain-lain 0 0,8 persen. Komponen utama minyak atsiri adalah -E-ocimene 29,7 persen, myrcene 17,1 persen, -Z-ocimene 17,0 persen, -pinene 10,2 persen, dan E-caryophyllene 7,1 persen.

Pengaruh ekstrak pada kelangsungan hidup sel

Kelangsungan hidup sel dipantau dengan resazurin. Sel melanoma, B16F10, diunggulkan dalam piringan 96-well. Setelah 24 jam sel diperlakukan dengan konsentrasi yang berbeda (0.2-200 g/mL) P. atlantica subsp. ekstrak mutica, hasil menunjukkan bahwa ekstrak tidak memiliki efek sitotoksik yang signifikan pada sel B16F10 pada konsentrasi yang digunakan dalam penelitian ini (Gbr. 1). Doksorubisin sebagai kontrol positif secara signifikan menginduksi kematian sel (P <>

Pengaruh ekstrak pada aktivitas tirosinase jamur

Pengaruh P. atlantica pada penghambatan tirosinase jamur dalam oksidasi L-DOPA dinilai. Hasilnya menunjukkan bahwa jamurtirosinaseaktivitas dihambat oleh semua ekstrak yang berbeda, tetapi konsentrasi 1000 g/mL ekstrak n-heksana tidak berpengaruh signifikan dalam pengujian ini. Asam kojic (2 dan 4 mM) digunakan sebagai kontrol positif (P <0,05) (gbr.="">

Efek ekstrak dan minyak esensial pada sintesis melanin

Untuk mempelajari pengaruh perbedaan ekstrak dan minyak atsiri P. atlantica subsp. mutica pada sintesis melanin, kandungan melanin dari sel melanoma B16F10 yang diperlakukan dengan ekstrak dinilai. Asam kojic (2 dan 4 mM) digunakan sebagai kontrol positif.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak MeOH, CH2Cl2, dan EtOAc (0.2-200 µg/mL), n-heksana (2-200 g/mL), dan ekstrak H2O (2{{9 }} dan 200 g/mL) memiliki efek penghambatan pada sintesis melanin (P <0,05) (gbr.="" 3).="" namun,="" semua="" konsentrasi="" minyak="" atsiri="" dan="" ekstrak="" buoh="" tidak="" memiliki="" efek="" penghambatan="" yang="" signifikan="" terhadap="" sintesis="" melanin.="" hasil="" minyak="" atsiri="" tidak="" ditunjukkan="" dalam="">

Pengaruh ekstrak pada aktivitas tirosinase seluler

Untuk mengevaluasi mekanisme efek penghambatan P. atlantica subsp. ekstrak mutica aktifmelanogenesiskhususnya, kami mengevaluasi intraselulertirosinaseaktivitas dalam sel melanoma B16F10. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak MeOH, EtOAc, dan BuOH (0.2-200 g/mL), n-heksana (0.2 g/mL), dan CH2Cl2 (20 dan 200 g/mL) ekstrak P. atlantica subsp. mutica secara signifikan dapat menghambat aktivitas tirosinase seluler (P <0,05) (gbr.="" 4)="" tetapi="" ekstrak="" air="" tidak="" memiliki="" efek="" penghambatan="" pada="" aktivitas="" tirosinase="">

Pengaruh ekstrak pada tingkat spesies oksigen reaktif seluler

Tingkat ROS intraseluler sebagai indikasi dariantioksidankapasitas P. atlantica subsp.mutica diukur dalam sel yang diobati dengan 24 mM H2O2 saja atau dengan ekstrak yang berbeda dalam sel melanoma B16F10. Hasil penelitian menunjukkan bahwa semua ekstrak konsentrasi P. atlanticasubsp. mutica kecuali untuk 0.2 g/mL ekstrak CH2Cl2 dapat secara signifikan menekan stres oksidatif yang disebabkan oleh H2O2 (P <0,05) (gbr.="">

Pengaruh ekstrak pada tingkat protein tirosinase seluler

Efek intraseluler P. atlanticasubsp. mutica pada protein terkait melanogenik seperti tirosinase sebagai indikatormelanogenesisdievaluasi dengan western blot. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6,tirosinasekadar protein menurun secara signifikan oleh P. atlantica subsp. perlakuan ekstrak mutica pada konsentrasi {{0}}.5 dan 10 g/mL (P < 0,05).="" -aktin="" digunakan="" sebagai="" pengendalian="">

Efek minyak esensial pada parameter yang berbeda

Minyak atsiri pada 0.2-200 g/mL mengungkapkan tidak ada efek signifikan pada semua parameter yang disebutkan di atas, kecuali pada konsentrasi 200 g/mL, yang menunjukkan efek sitotoksik pada sel melanoma. Oleh karena itu, hasil minyak esensial tidak termasuk dalam bagian hasil karena tidak ada efek penghambatan yang diamati.

DISKUSI

Produk kosmetik berbahan dasar alami banyak diiklankan oleh agen komersial untuk keamanan dan aktivitas multifungsinya. Menemukan agen anti-melanogenik baru denganantioksidanAktivitas dari sumber alami merupakan salah satu kepentingan dalam formulasi produk yang digunakan untuk gangguan hiperpigmentasi. Dalam produk obat dan kosmetik yang digunakan sebagai agen pemutih kulit, penghambatan pembentukan melanin, pemulung radikal bebas dan penghambatantirosinaseaktivitas yang penting untuk mengobati gangguan kulit terkait (21).

Pada penelitian ini aktivitas antioksidan ekstrak P. atlantica subsp. mutica dievaluasi dan efeknya pada aktivitas tirosinase dan sintesis melanin dianalisis. Ekstrak MeOH dan EtOAc dari P. atlantika subsp. mutica menunjukkan signifikanantioksidanaktivitas pada 2, 20 g/mL dan 20, 200 g/mL yang mungkin dikaitkan dengan polifenol dan flavonoid yang banyak ditemukan di tanaman. Hasil penelitian menunjukkan semua ekstrak terutama ekstrak MeOH, EtOAc, dan H2O mampu menghambat pertumbuhan jamur secara nyata.tirosinaseaktivitas. Selain itu, ekstrak MeOH, EtOAc, dan BuOH mampu menurunkan aktivitas tirosin seluler yang sesuai dengan penurunan produksi melanin dalam sel. Dalam penelitian ini, semua konsentrasi minyak atsiri tidak memiliki efek penghambatan yang signifikan terhadap tirosin seluler, sintesis melanin, danantioksidanaktivitas. Karena lebih banyak aktivitas ekstrak MeOH dalam eksperimen yang berbeda dibandingkan dengan ekstrak lain, kami telah memilih ekstrak yang disebutkan untuk analisis western blot. Singkatnya, efek anti-melanogenic ekstrak ini dikonfirmasi di semua tes dalam sel B16F10, yang sebanding dengan asam kojic kontrol positif (Tabel 2).

Ekstrak MeOH, CH2Cl2, dan EtOAc mengalami penurunan selulertirosinaseaktivitas, kandungan melanin, dan ROS. Fraksi alam semipolar dapat mengekstrak fitokimia yang bertanggung jawab untuk aktivitas antimelanogenik seperti polifenol dan flavonoid. Fraksi n-heksana dan minyak atsiri yang kurang aktif menunjukkan bahwa fitokimia tumbuhan yang bersifat nonpolar dan volatil tidak berpengaruh nyata terhadapmelanogenesisproses (22,23).

Polifenol dan flavonoid bertindak sebagai penghambat produksi ROS dan dapat bertanggung jawab atas sifat anti-melanogenik ekstrak tumbuhan (24-27). Senyawa utama dalam ekstrak P. atlantica subsp. mutica adalah quercetin, luteolin, isoquercetin, rutin, luteolin 7-laktat, dan senyawa fenolik seperti asam p-coumaric, asam caffeic, dan asam galat yang bertanggung jawab untukantioksidankegiatan (28). Rutin telah dilaporkan menghambat aktivitas tirosinase dan merupakan agen anti-pigmen yang kuat karena adanya gugus hidroksil (29). Menariknya quercetin, luteolin, dan isoquercetin juga memiliki banyak gugus hidroksil dalam strukturnya sehingga cocok untuk interaksi dengan tirosinase yang menghasilkan aktivitas anti-tirosinase (21,30). Baru-baru ini telah ditunjukkan bahwa efek flavonoid seperti luteolin dan quercetin terutama dimediasi melalui modulasi faktor transkripsimelanogenesis-associated transcription factor (MITF) dan/atau enzim melanogenesistirosinase, DCT atau protein 1 terkait tirosinase (TYRP-1) (31). Asam P-coumaric dan asam caffeic menghambat aktivitas tirosinase jamur dan 10- dan 3-kali lipat lebih kuat daripada asam kojic (32).

Asam galat menampilkan aktivitas penghambatan tirosinase dan mengurangi dopaquinone kembali ke L-DOPA melalui siklus redoks, mirip dengan asam askorbat (33). Demikian pula, dalam penelitian ini P. atlantica subsp. mutica menurunkan kadar protein tirosinase dalam sel yang berkorelasi kuat dengan keberadaan quercetin, luteolin, isoquercetin, rutin, dan polifenol lainnya di dalam tanaman.

Ada banyak laporan tentang tanaman yang memiliki aktivitas anti-melanogenik dan antioksidan yang menurunkan stres oksidatif, yang mungkin memiliki potensi tinggi untuk pengobatan gangguan kulit. Misalnya, ekstrak yang berbeda dari bagian udara P. atlantica mengurangi stres oksidatif, yang mungkin dikaitkan dengan polifenol, flavonoid, dan antosianin yang banyak ditemukan di tanaman (34). Dalam penelitian lain, ekstrak MeOH P. vera menurunkan sekresi melanin yang dikaitkan dengan beberapaantioksidansenyawa dalam tanaman ini. Penelitian ini menunjukkan bahwa asam kojic, sebagai kontrol positif, menunjukkan nilai IC50 0,05 mg/mL dan konsentrasi P. vera yang lebih tinggi dapat digunakan sebagai agen yang efektif untuk pengobatan gangguan kulit seperti kanker melanoma (35 ). Gourin, dkk. menunjukkan bagian udara P. atlantica memiliki sifat antioksidan kuat (36). Juga, fraksi MeOH dan CH2Cl2 dari Nepeta satureioides menunjukkan efek potensial terhadap produksi melanin dalam sel melanoma B16F10 dan dapat berkontribusi pada formulasi kosmetik produk perawatan kulit (37). Turunan asam kojic memiliki aktivitas penghambatan padatirosinase. Tampaknya adanya gugus hidroksil bebas dan pengganti metil dalam senyawa ini mengkonfirmasi aktivitas penghambatan. Dalam penelitian ini asam kojic (kontrol positif) menunjukkan nilai IC50sebesar 0.28 mM (38). Glikosida fenilpropanoid dan flavonoid diisolasi dari Teucrium polium L. var. gnaphalodes menunjukkan aktivitas penghambatan antioksidan dan tirosinase. Para penulis memamerkan jaranol menunjukkan aktivitas penghambatan tirosinase tertinggi (IC50 0.041 mM) dan poliumoside adalah antioksidan terbaik di antara senyawa yang diuji. Asam kojic menunjukkan nilai IC50 0,02 mM (39).

Penurunan kadar proteintirosinaseoleh P. atlantica subsp. mutika danantioksidansifat dan pengurangan ROS telah mengkonfirmasi penggunaan agen ini sebagai agen anti-melanogenesis. Penelitian ini untuk pertama kalinya telah menentukan efek penghambatan P. atlanticasubsp. mutika aktifmelanogenesisdalam sel melanoma B16F10. Untuk mencegah akumulasi dan kelebihan produksi melanin di kulit, penghambatantirosinasememiliki peran penting. Oleh karena itu, sehubungan dengan efek anti-oksidan yang dilaporkan dari P. atlantica subsp.mutica, senyawa flavonoid dan fenolik merupakan komponen penting dari tanaman yang bertanggung jawab untuk aktivitas anti-melanogenesis dan antitirosinase dari P. atlantica subsp. mutika. Aktivitas antioksidan dan anti-melanogenik P. atlantica subsp. mutica mungkin menawarkan agen yang cocok untuk formulasi pemutih kulit dan dapat dimasukkan dalam produk kosmetik untuk formulasi perawatan kulit.

KESIMPULAN

Kesimpulannya, penelitian ini untuk pertama kalinya menunjukkan bahwa ekstrak MeOH dan EtOAc P. atlantica subsp. mutica memiliki kekuatantirosinaseaktivitas penghambatan yang sesuai dengan pengurangan melanin. Selain itu, P. atlanticasubsp. mutica juga menunjukkan aktivitas pemulungan yang tinggi danantioksidansifat, yang dapat dikaitkan terutama dengan tingkat tinggi flavonoid dan polifenol total. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kemampuan P. atlanticasubsp. mutica untuk mengurangi produksi melanin mungkin berkorelasi dengan penipisan ROS seluler dan tindakan penghambatannya pada jalur pensinyalan yang mengaturtirosinaseaktivitas. Karena ekstrak semipolar memiliki anti-tirosinase dan anti-melanogenikefek, oleh karena itu, kami menyimpulkan senyawa yang bertanggung jawab atas efek ini terakumulasi dalam ekstrak, bukan dalam minyak esensial.