Pengaruh Antimelanogenesis Ekstrak Daun Dan Fitokimia Dari Zaitun Ceylon (Elaeocarpus Serratus) Pada Model Ikan Zebra
Mar 23, 2022
Kontak:{0}}/ WhatsApp: 008618081934791
Chi-Ya Huang 1, I-Hsuan Liu 2, Xiang-Zhe Huang 1, Hui-Jen Chen 1, Shang-Tzen Chang 1, Mei-Ling Chang 3,Yu-Tung Ho 1 dan Hui-Ting Chang 1,*
Abstrak:Itumelanogenesisefek penghambatan pada ikan zebra (Danio rerio) danantitirosinaseaktivitas etanolekstrakdan fitokimianya dari daun zaitun Ceylon (Elaeocarpus serratus Linn.) diselidiki dalam penelitian ini. Di antara ekstrak daun dan empat fraksi larut, fraksi larut etil asetat menunjukkan antitirosinase danantimelanogenesiskegiatan. Satu asam fenolat, asam galat, dan dua flavonoid, myricetin, dan berarti timah, diisolasi dari subfraksi aktif melalui isolasi yang dipandu bioassay; strukturnya dijelaskan berdasarkan analisis spektroskopi 1D dan 2D NMR, FTIR, UV, dan MS. Senyawa ini memiliki signifikanantitirosinaseaktivitas apakah menggunakan L-tirosin atau L-DOPA sebagai substrat; mearnsentin menunjukkan aktivitas yang optimal. Dalam penyelidikan enzimkinetik, baik asam galat dan mearnsetin adalah inhibitor tipe kompetitif terhadap tirosinase jamur, dan myricetin bertindak sebagai tipe campuran.tirosinasepenghambat. Daunekstrakdan fraksi larut anethyl acetate menunjukkan kinerja yang efektif dalam penghambatan pembentukan melanin pada embrio ikan zebra. Mearnsetin juga memiliki efek antimelanogenesis yang menjanjikan, yang lebih unggul dari kontrol positif,arbutin. Hasil penelitian mengungkapkan bahwa ekstrak daun zaitun Ceylon dan fitokimianya terutama mearnsetin berpotensi untuk digunakan sebagaiantimelanogenesisdan bahan pemutih kulit.
Kata kunci: efek antimelanogenesis; Elaeocarpus serratus; melanin; penghambat tirosinase; ikan zebra
Tangki herbalmenghambat aktivitas tirosinase.
1. Perkenalan
Melanin memainkan peran penting dalam banyak fungsi biokimia; itu memberikan perlindungan untuk kulit dari kerusakan ultraviolet (UV), penghapusan spesies oksigen reaktif (ROS), dan reaksi biokimia lainnya [1–3]. Akumulasi melanin yang berlebihan juga menyebabkan hiperpigmentasi, melasma, bintik-bintik penuaan, penggelapan kulit, dll. [4,5]. Di dunia timur, orang tertarik pada masalah efek pemutihan pada kulit; industri kosmetik didedikasikan untuk mengembangkan kosmetik pemutih kulit melawan melanogenesis. Ada beberapa mekanisme, antara lain:tirosinaseaktivitas penghambatan, penghapusan melanosit, dan gangguan dengan sintesis melanin untuk menunjukkan aktivitas penghambatan melanogenesis. Reagen yang menjanjikan menghambat melanogenesis telah diselidiki sejak tahun 1940-an [2,4,6,7]. Namun, bagianmelanogenesisinhibitor memiliki beberapa efek samping; misalnya, hidrokuinon dapat menyebabkan okronosis eksogen dan hipomelanosis permanen [5,8]. Asam kojic yang berlebihan dapat menyebabkan alergi dan tumor tiroid [9,10].
Baru-baru ini, para peneliti telah didedikasikan untuk menemukan reagen melanogenik yang menjanjikan tanpa/efek samping ringan dari produk alami tumbuhan [11-13]. Alamitirosinaseinhibitor dari sumber tanaman telah dilaporkan, termasuk fenol sederhana, asam fenolik, stilbenes, flavonoid, lignan, terpenoid, quinoid, dll [2,14-16]. Solano dkk. menyatakan bahwa senyawa fenolik dan senyawa alam lainnya memiliki potensi penghambatan formelanin yang besar, misalnya arbutin (fenol glukosida yang ditemukan dalam Arctostaphylos uva-ursi), ekstrak teh hijau, asam alfa hidroksil (AHA), asam askorbat, dan sebagainya. ].Arbutinbanyak digunakan sebagai bahan utama produk pemutih komersial di pasaran [4,17].Gallocatechin-3-O-gallate (GCG), epigallocatechin-3-O-gallate (EGCG), dan epicatechin {{6 }}O-gallate (EKG) diidentifikasi dalam teh hijauekstrak; senyawa ini memiliki efikasi penghambatan tirosinase yang baik [17]. Arctigenin, suatu lignan yang diisolasi dari ekstrak Fructus arctic, dapat menurunkan kandungan melanin pada embrio ikan zebra (Danio rerio) [18]. Lee et al. melaporkan bahwa ginsenosides dari daun ginseng Panax dan berry menghambatmelanogenesisembrio ikan zebra; ginsenosides aktif adalah ginsenoside Rh6, vina-ginsenoside R4,vina-ginsenoside R13, ginsenoside Rh23, dan floralginsenoside A [19-21].
Elaeocarpus serratus Linn. (Tiliaceae), biasa disebut Ceylon olive, tersebar di Afrika, Australia, dan Asia Tenggara. Acar yang terbuat dari buah zaitun Ceylon yang dapat dimakan adalah umum di Sri Lanka [22]. Secara tradisional digunakan untuk mencegah kutu dan ketombe di SriLanka. Bioaktivitas ekstrak E. serratus dievaluasi dalam studi terkait [22,23]. Ekstrak daun E.serratus memiliki aktivitas antibakteri terhadap Plesiomonas, Salmonella typhi, dan Proteus spp. pada konsentrasi 400 g/mL dengan uji difusi pelat-lubang [23].E. ekstrak daun serratus berpotensi sebagai reagen antitumor, antimikroba, dan pestisida dalam uji sitotoksisitas uji kematian udang air asin (Artemia salina); LC50 daunekstrakadalah 40 g/mL terhadap udang air asin [23]. Flavonolglikosida antioksidan, termasuk myricitrin, mearnsetin 3-O- -D-glucopyranoside, mearnsitrin, andtamarixetin 3-O- -L-rhamnopyranoside, diisolasi dan diidentifikasi dari ekstrak daun E. serratus [22].
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi efek dari daun E. serratusekstrakdan pecahannya padaantitirosinaseaktivitas (in vitro) danmelanogenesispenghambatan aktivitas inzebrafish (in vivo). Teknik fraksinasi dan isolasi yang dipandu bioassay dilakukan untuk menemukan senyawa yang menjanjikan sebagai bahan antimelanogenesis yang potensial. Pengembangan bahan antimelanogenesis yang efektif dapat meningkatkan pemanfaatan bahan alam nabati secara optimal dalam industri farmasi dan kosmetika.
2. Bahan-bahan dan metode-metode
2.1. Bahan dan Ekstraksi Tanaman
Ceylon olive (Elaeocarpus serratus), berumur sekitar 50 tahun, daunnya dikumpulkan dari National Taiwan University, Taipei, Taiwan pada bulan September. Daun segar (3,95 kg) diekstraksi dengan etanol 95 persen selama 7 hari pada suhu kamar. yang difilterekstrakdikeringkan di bawah tekanan tereduksi dengan rotavapor dengan suhu mandi 50 C [24]. Hasil ekstrak daun (0.32 kg) adalah 12,0 persen (b/b berat kering).
cistancheekstrak
2.2. Partisi Cair-Cair
Ituekstrakmenjadi sasaran ekstraksi pelarut organik berturut-turut dalam urutan polaritas meningkat dengan partisi cair-cair [24,25]. Ekstrak daun difraksinasi menjadi fraksi larut ton-heksana (HF, 9,1 persen ), fraksi larut etil asetat (EF, 11,3 persen ), fraksi larut n-butanol (BF, 17,3 persen ), dan fraksi larut air (WF, 31,{ {13}} persen ).
2.3. Kromatografi Kolom dan Kromatografi Lapis Tipis
Fraksi larut etil asetat bioaktif selanjutnya difraksinasi dengan silika gel columnchromatography (CC). Kromatografi kolom terbuka dilakukan dengan elusi bertahap dengan perbandingan n-heksana dan etil asetat yang berbeda [26]. Sembilan belas subfraksi (E1-E19) diperoleh dengan kromatografi lapis tipis (KLT) [27]. Hasil subfraksi adalah E1(1,05 persen ), E2 (8,21 persen ), E3 (1,64 persen ), E4 (0,74 persen ), E5 (1,52 persen ), E6 ({ {59}}.86 persen ), E7 (1,51 persen ), E8 (9,50 persen ),E9 (7,78 persen ), E10 (3,97 persen ), E11 (2,65 persen ), E12 (8,49 persen), E13 (5,58 persen), E14 (4,43 persen), E15 (5,31 persen), E16 (1,14 persen), E17 (1,87 persen), E18 (0,76 persen), dan E19 (2,96 persen).
2.4. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Subfraksi aktif dari fraksi larut etil asetat dianalisis dan diisolasi dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC, L-2130, Hitachi, Tokyo, Jepang) yang dilengkapi dengan kolom RP-18 preparatif (Purospher®, STAR RP{{ 3}} penutup ujung, 250 × 10 mm,5 m). Fase gerak gradien terdiri dari air (A) dan asetonitril (B). Laju aliran adalah 3 mL/menit. Program elusi melibatkan gradien linier dari 30 hingga 35 persen B dalam A selama 0–15 menit, 35 hingga 100 persen B dalam A selama 15–25 menit, dan diikuti oleh 5 menit kesetimbangan dengan 100 persen B. Puncak yang dielusi terdeteksi oleh detektor UV pada 254 nm [25,28].
2.5. Identifikasi Senyawa Terisolasi
Struktur senyawa yang diisolasi ditentukan dan dikarakterisasi dengan analisis spektral, termasuk spektroskopi ultraviolet-tampak (UV/VIS, V-550, Jasco, Tokyo, Jepang), spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR, FTS{{2} }, Bio-rad, Hercules, CA,USA), dan spektroskopi massa (MS, MAT-958, Finnigan, MA, USA). Spektroskopi resonansi magnetik nuklir (NMR), termasuk 1D (1H-NMR, 500 MHz; 13C-NMR, 125 MHz) dan 2D NMR (HSQC dan HMBC), direkam dengan spektrometer Bruker AVIII NMR (Bruker Avance, Rheinstetten, Jerman) [ 29–32].
2.6. Uji Antitirosinase dan Studi Kinetik Enzim
In vitroantitirosinaseassay adalah analisis spektrofotometri berdasarkan metode yang dijelaskan sebelumnya [33-35]. L-DOPA (3,4-dihidroksifenilalanin) dan L-tirosin masing-masing digunakan sebagai substrat. Di dalam microplates 96-, 40 L larutan spesimen dan 70 L buffer kalium fosfat (0,1 M, pH 6,8) dicampur, yang diikuti dengan menambahkan 50 L 200 unit/mL tirosinase jamur ( EC1.14.18.1) setelah inkubasi pada 25 C selama 10 menit. Kemudian, kami menambahkan 40 L substrat 2,5 mM (L-tirosin/L-DOPA) ke dalam sumur, dan campuran diinkubasi selama 10 menit. Setelah inkubasi, absorbansi pada 475 nm dari setiap sumur diukur dengan pembaca ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (SPECTROstar Nano, BMG LABTECH, Offenburg, Jerman). Kontrol positif adalaharbutin, dan jumlah ulangan adalah tiga. Persentase penghambatantirosinaseaktivitas dihitung dengan persamaan berikut: Inhibisi ( persen )=[(Kosong Akontrol–Akontrol)–(Kosong Sampel–Asampel)/(Kosong Akontrol–Akontrol)] × 100. Kemudian, konsentrasi hambat setengah-maksimal ( IC50) dari spesimen dihitung dari kurva konsentrasi-respon.
Studi kinetika enzim dianalisis dengan plot resiprokal Lineweaver-Burk dari laju reaksi dan konsentrasi substrat untuk mengevaluasi pengaruh spesimen terhadap afinitas substrat dan enzim. konsentrasitirosinasedijaga konstan pada 200 unit/mL, sedangkan konsentrasi substrat (L-tirosin/L-DOPA) divariasikan pada 0.5, 0.75,1.0 , 1,25, dan 1,5 mM. Reaksinya mirip dengan uji antitirosinase seperti dijelaskan di atas; 40 L larutan spesimen dan 70 L buffer kalium fosfat (0,1 M, pH 6,8) dicampur, yang diikuti dengan menambahkan 50 L 200 unit/mL tirosinase, setelah inkubasi pada suhu 25 C selama 10 menit. Kemudian, kami menambahkan 40 L substrat ke dalam sumur dan mencampurnya secara menyeluruh, dan pengukuran kinetik larutan diukur segera untuk periode 3 minat panjang gelombang yang terdeteksi (475 nm). Kedua parameter kinetik, konstanta Michaelis-Menten (Km) dan kecepatan maksimum (Vmax), dihitung dari persamaan linier Lineweaver-Burk [36-38].
2.7. Evaluasi Efek Antimelanogenesis pada Ikan Zebra
Ikan zebra (Danio rerio) galur AB tipe liar dipelihara dalam lingkungan perairan yang sehat pada 26–30 C, dengan siklus terang-gelap 14:10 jam. Setelah 9 jam pasca fertilisasi (hpf), embrio ditempatkan ke dalam plat sumur 24-(3 embrio per sumur), diperlakukan dengan berbagai konsentrasi akhir spesimen yang dilarutkan dalam 1 persen DMSO, dan diinkubasi pada suhu 28 C selama 48 jam (pada 57 hpf). Gambar digital embrio ikan zebra hidup diambil melalui mikroskop stereo (Olympus SZ61, Tokyo, Jepang) dengan perbesaran total 40×; kemudian, kandungan melanin dari embrio ikan zebra dianalisis dengan perangkat lunak ImageJ. Kontrol positif adalaharbutin(bahan pemutih kulit komersial) dan 1-fenil-2-tiourea (PTU, penghambat sintesis melanin). Jumlah ulangan adalah enam [21,39,40].
2.8. Analisis statistik
Data yang diperoleh dalam penelitian dianalisis dengan Statistical Analysis System (SAS) v 9.2(Cary, NC, USA) dengan uji Scheffe, yang merupakan metode perbandingan berganda post hoc. Interval kepercayaan ditetapkan sebesar 95 persen .
dr vita OPC dipemutih kulit
3. Hasil dan Pembahasan
3.1. Aktivitas Antitirosinase Ekstrak Daun E. serratus dan Fraksinya
Diagram skematik ekstraksi, isolasi, identifikasi,antitirosinaseaktivitas danantimelanogenesisefek daun E. serratusekstrakditunjukkan pada Gambar 1. Ekstrak daun selanjutnya difraksinasi menjadi fraksi larut n-heksana (HF), fraksi larut etil asetat (EF), fraksi larut n-butanol (BF), dan fraksi larut air (WF) dengan cairan -partisi cair.
Tirosinase, diproduksi oleh sel melanosit, memainkan peran kunci untuk mengkatalisis sintesis melanin yang rumit; penjelajahantirosinaseinhibitor adalah salah satu cara yang menonjol untuk menghambatmelanogenesis[2,5,41]. Aktivitas penghambatan tirosinase daunekstrakdan empat fraksi ditunjukkan pada Gambar 2. Saat menggunakan L-tirosin sebagai substrat, hanya fraksi larut etil asetat yang memiliki efek penghambatan terhadap tirosinase pada konsentrasi 400 ug/mL. Ekstrak daun, fraksi larut etil asetat, dan fraksi larut n-butanol menunjukkan aktivitas antitirosinase ketika mengubah L-DOPA sebagai substrat. Di antara ekstrak daun dan empat fraksi, fraksi larut etil asetat menunjukkan yang terbaikantitirosinaseaktivitas dengan nilai IC50 279,38 dan 166,95 ug/mL saat menggunakan L-tirosin dan L-DOPA sebagai substrat, masing-masing (Tabel 1).
Tabel 1. Nilai IC50 subfraksi aktif terhadap tirosinase jamur.
Fraksi larut etil asetat menjadi sasaran fraksinasi yang dipandu bioassay menggunakan teknik kromatografi kolom preparatif dan kromatografi lapis tipis, dan diperoleh sembilan belas subfraksi (E1-E19). Di antara subfraksi ini, subfraksi E7–E10 menunjukkan efek penghambatan tirosinase yang lebih tinggi pada kedua pengujian substrat (L-tirosin dan L-DOPA). Nilai konsentrasi hambat setengah maksimal (IC50) dari subfraksi aktif terhadaptirosinasediberikan pada Tabel 1. Nilai IC50 dari semua subfraksi E7–E10 berada di bawah 200 g/mL; Subfraksi E7 dan E9 bahkan menunjukkan kinerja yang lebih baik dibandingkan denganarbutin, yang merupakan bahan pemutih komersial.
3.2. Isolasi dan Identifikasi Senyawa dari Subfraksi Bioaktif
Tiga senyawa (ES1–3) diisolasi dari subfraksi bioaktif (E7–E10) dengan kromatografi cair kinerja tinggi. Asam galat (ES1): bubuk putih; mp257 derajat ; UV (MeOH) maks (log ) 215,5 (3,94), 268.0 (3,46) nm; IR (KBr) maks 3495, 3416, 3285, 1647, 1542, dan 1220 cm−1; EI-MS m/z 171 [M plus H] plus , sesuai dengan rumus molekul C7H6O5. Myricetin (ES2): jarum kuning; mp358 derajat ; UV (MeOH) maks (log ) 252,5 (4,43) dan 374,0 (4,50) nm; IR (KBr) maks 3421, 1663, 1596, 1520, 1229, 1202, dan 1171 cm−1; EI-MS m/z 319,36 [M plus H] plus , rumus molekul C15H10O8. Mearnsetin (4′-O-metil myricetin, ES3): bubuk kuning; mp 184 derajat; UV (MeOH) maks (log ) 259,5 (4,21) dan 364,5 (4,26) nm; IR (KBr) maks 3409, 2960, 2927, 2853, 1661, 1599, 1507, 1208, dan 1163 cm−1; EI-MS m/z 333.0 [M plus H] plus , rumus molekul C16H12O8. Data NMR senyawa ini dirangkum dalam Tabel 2. Struktur kimia dari senyawa yang diidentifikasi ditunjukkan pada Gambar 3.
Tabel 2. Data 1H, 13C, dan HMBC NMR senyawa.
Di antara senyawa ini, asam galat adalah asam fenolik; myricetin dan mearnsetin termasuk dalam golongan flavonoid. Kandungan masing-masing senyawa dalam fraksi larut etil asetat dan subfraksi E7–E10 tercantum pada Tabel 3. Subfraksi E7 kaya akan mearnsetin (433,38 mg/g); primer subfraksi E8 mengandung asam galat (417,64 mg/g). Penyusun utama subfraksi E9 dan E10 adalah myricetin (masing-masing 406.41 dan 336.41 mg/g). Kandungan ketiga senyawa dalam fraksi larut etil asetat adalah 59.72 mg/g (asam galat), 45.21 mg/g (myricetin), dan 22,66 mg/g (mearnsetin).
3.3. Aktivitas Antitirosinase dan Studi Kinetik Enzim dari Senyawa Terisolasi
Antitirosinaseaktivitas senyawa ini dari subfraksi aktif disajikan pada Tabel 4. Bila menggunakan L-tirosin sebagai substrat, urutan aktivitas antitirosinase dari senyawa yang diperiksa adalah mearnsetin > myricetin > asam galat > arbutin; mearnsetin memiliki efek penghambatan terbaik dengan nilai IC50 sebesar 56,57 g/mL (0,17 mM). Hasil serupa diamati pada L-DOPA yang digunakan sebagai substrat; kemanjuran tiga fitokimia lebih unggul daripadaarbutin.
Inhibitor enzim sejati mengandung empat mode penghambatan, termasuk kompetitif, tidak kompetitif, tipe campuran (baik kompetitif dan tidak kompetitif), dan non-kompetitif [12]. Konstanta kinetik, Km dan Vmax, ditentukan oleh laju awal enzim pada substrat yang berbeda konsentrasi di plot Lineweaver–Burk; mereka berpotongan di sumbu y setara dengan 1/Vmax, dan mereka berpotongan di sumbu x adalah 1/Km. Dalam studi kinetika enzim senyawa terpenoid dari minyak atsiri kulit jeruk terhadaptirosinase, citralacted sebagai inhibitor nonkompetitif, dan myrcene adalah inhibitor kompetitif [36]. Mekanisme penghambatan 3,7-dioleylquercetin terhadap tirosinase jamur adalah melalui model penghambatan kompetitif untuk menekan produksi melanin [42].
Tabel 4. Nilai IC50 senyawa terhadap tirosinase jamur
Jenis penghambatan pada tirosinase dari tiga fitokimia dijelaskan oleh studi kinetika in vitroenzyme. Gambar 4 menunjukkan plot Lineweaver-Burk (plot timbal balik ganda) dari pendapatan. Dalam analisis kedua substrat, L-tirosin dan L-Dopa, garis regresi linier konsentrasi mearnsetin yang berbeda memiliki intersep yang sama pada sumbu y dan kemiringan yang meningkat. Parameter kinetik asam galat, myricetin, dan mearnsetin dirangkum dalam Tabel 5. Dengan adanya asam galat atau mearnsetin, diamati peningkatan Km dan konstan pada Vmax, yang menunjukkan bahwa asam galat dan mearnsetin adalah inhibitor kompetitif tirosinase. Hal ini menunjukkan bahwa asam galat dan mearnsetin dapat berikatan dengan bebastirosinasedengan afinitas tinggi dan mencegah pengikatan substrat (L-tirosin atau L-DOPA) ke situs aktif tirosinase. Myricetin ditemukan menjadi inhibitor tipe campuran, mengandung penghambatan kompetitif dan tidak kompetitif sejak Km meningkat dan Vmax menurun. Penghambatan tidak kompetitif menunjukkan bahwa senyawa mengikat tirosinase-substrat kompleks tetapi tidak ke tirosinase bebas.
3.4. Efek Antimelanogenesis Ekstrak, Fraksi, dan Fitokimia Terisolasi
Zebrafish (Danio rerio) adalah organisme model baru dan valid untuk penelitian melanogenesis dalam studi terbaru [18-21,40]. Ituantimelanogenesisefek ekstrak daun dan empat fraksi dalam uji ikan zebra in vivo ditunjukkan pada Gambar 5. Daunekstrakdan fraksi larut etil asetat menunjukkan kinerja yang baik dalam penghambatan pembentukan melanin embrio ikan zebra. Pada konsentrasi 200 g/mL, ekstrak daun dan fraksi larut etil asetat masing-masing menghambat 27,72 persen dan 35,60 persen produksi melanin embrio ikan zebra. Semua perlakuan tidak mempengaruhi pertumbuhan embrio ikan zebra dengan tingkat kelangsungan hidup 100 persen.
Gambar 6 menyajikan efek senyawa dan kontrol positif, PTU dan arbutin, padamelanogenesisikan zebra pada konsentrasi 50 M. PTU itu kuattirosinaseinhibitor untuk mencegah produksi melanin, sementaraarbutinadalah agen pemutih kulit komersial; kedua kontrol positif dapat mengurangi pembentukan melanin pada ikan zebra. Di antara tiga fitokimia, myricetin menunjukkan sedikit efek penghambatan melanin, sedangkan mearnsetin memiliki aktivitas penghambatan melanogenesis yang lebih baik pada ikan zebra.
Konsentrasi efektif darimelanogenesis inhibition activity in zebrafish of compounds are listed in Table 6. IC50 values of PTU and arbutin were 26.29 µM and 323.69 µM, respectively. The order of antimelanogenesis activity of examined compounds was PTU >mearnsetin >arbutindan myricetin > asam galat. Mearnsetin menunjukkan kemanjuran terbaik dengan nilai IC50 121,01 M di antara fitokimia yang diperiksa.
Untuk informasi lebih lanjut, silakan klik gambar.
4. Kesimpulan
Itumelanogenesisefek penghambatan danantitirosinaseaktivitas ekstrak daun zaitun Ceylon (E. serratus) dievaluasi dalam penelitian ini. Diantara daunekstrakdan keempat fraksinya, fraksi larut etil asetat memiliki yang terbaikantitirosinaseaktivitas. Fitokimia, termasuk asam galat, myricetin, dan mearnsetin, diisolasi dan diidentifikasi dari subfraksi aktif dengan kromatografi yang dipandu bioassay dan analisis spektral. Urutan aktivitas antitirosinase senyawa tersebut adalah mearnsetin > myricetin > asam galat. Studi kinetik enzim in vitro mengungkapkan bahwa asam galat dan mearnsetin adalah inhibitor kompetitif tirosinase, dan myricetin adalah inhibitor tipe campuran. Hasil dari uji ikan zebra in vivo mengungkapkan bahwa fraksi larut etil asetat dan tiga fitokimia memiliki kandungan yang signifikan.melanogenesisefek penghambatan. Efek antimelanogenesis dari mearnsetin lebih unggul daripada kontrol positif,arbutin, pada ikan zebra.
