Cistanche Deserticolapolysaccharides Mengurangi Penurunan Kognitif pada Tikus Model Penuaan Dengan Memulihkan Sumbu Mikrobiota-otak Usus

Kontak: ali.ma@wecistanche.com

Yuan Gao1,*, Bing Li1,*, Hong Liu1, Yajuan Tian2, Chao Gu1, Xiaoli Du1, Ren Bu1, Jie Gao1, Yang Liu1, Gang Li1

ABSTRAK

Bukti terbaru menunjukkan perubahan pada sumbu mikrobiota-otak usus dapat mendorong gangguan kognitif denganpenuaan. Dalam penelitian ini, kami mengamati bahwa pemberian D-galaktosa yang berkepanjangan pada tikus menyebabkan penurunan kognitif, disbiosis mikroba usus, peradangan perifer, dan stres oksidatif. Dalam model penurunan kognitif terkait usia ini,Polisakarida Cistanche deserticola(CDPS) meningkatkan fungsi kognitif pada tikus yang diobati dengan D-galaktosa dengan memulihkan homeostasis mikroba usus, sehingga mengurangi stres oksidatif dan peradangan perifer. Efek menguntungkan dari CDPS pada tikus model yang menua ini dihapuskan melalui ablasi mikrobiota usus dengan antibiotik atau imunosupresi dengan siklofosfamid. Profil metabolomik serum menunjukkan bahwa kadar kreatinin, valin, L-metionin, o-Toluidin, N-etianilin, asam urat, dan prolin diubah dalampenuaantikus model, tetapi dipulihkan oleh CDPS. Temuan ini menunjukkan bahwaCDPSmeningkatkan fungsi kognitif dalam D-galaktosa-inducedpenuaanmodel pada tikus dengan memulihkan homeostasis sumbu otak mikrobiota usus, yang mengurangi ketidakseimbangan asam amino, peradangan perifer, dan stres oksidatif.CDPSdengan demikian menunjukkan potensi terapeutik untuk pasien dengan gangguan memori dan belajar, terutama yang terkait dengan dysbiosis mikrobial usus.

Klik untuk Cistanche efek samping anti-penuaan

PENGANTAR

Pemberian D-galaktosa (D-gal) dan garam berilium yang berkepanjangan menginduksi penuaan pada model hewan percobaan dan kultur sel primer in vitro dan digunakan untuk mengidentifikasi mekanisme yang mendasari proses penuaan alami [1-4]. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa penurunan kognitif pada D-galaktosa-inducedpenuaanmodel tikus terkait dengan penurunan tingkat protein faktor pertumbuhan saraf (NGF) dan peningkatan spesies oksigen reaktif (ROS) di otak, yang keduanya menyebabkan degenerasi neuron hipokampus dan mengurangi neurogenesis [3, 4]. Studi terbaru juga menunjukkan bahwa komposisi dan jumlah mikrobiota usus manusia berubah secara signifikan selamapenuaanproses[5].

Bentengdeserticola adalah ramuan yang tumbuh terutama di wilayah gurun barat laut Cina dan digunakan dalam pengobatan tradisional Cina. Hal ini umumnya dikenal sebagai "ginseng gurun." Ekstrak Cistanche deserticola mengandung beberapa senyawa aktif secara farmakologis, termasuk glikosida fenilethanoid, iridoid, lignosa, oligosakarida, polisakarida, dan asam amino; senyawa ini dikaitkan dengan sifat anti-inflamasi, anti-oksidatif, anti-penuaan, neuroprotektif, dan imunomodulator [6, 7]. Misalnya, polisakarida yang diekstrak dari Cistanche deserticola telah digunakan dalam pengobatan tradisional Tiongkok untuk mengobati kanker kolorektal [8]. Berbagai polisakarida lemah beracun dengan bioaktivitas yang berguna telah diisolasi dari beberapa organisme, seperti polisakarida Chuanqiong, polisakarida Ganoderma lucidum, dan polisakarida Lycium barbarum [9-11]. CDA 0.05 adalah galaktoglukan yang diisolasi dariBentengdeserticola yang mendorong pertumbuhan beberapa bakteri usus yang menguntungkan, termasuk beberapa spesies Bacteroides dan Lactobacillus [12].

Mekanisme yang mendasari normalpenuaanProses ini juga terlibat dalam beberapa penyakit manusia seperti gangguan neurodegeneratif, aterosklerosis koroner, diabetes tipe 2 (T2DM), dan hipertensi [13, 14]. Studi terbaru menunjukkan bahwa perubahan flora usus memainkan peran penting dalam penuaan manusia [15]. Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa pemberian D-galaktosa yang berkepanjangan pada tikus percobaan dan tikus meniru proses penuaan normal dan merupakan model yang berguna untuk dipelajari.penuaanfenotipe terkait seperti penurunan kognisi [16]. Selain itu, tikus model penuaan yang diinduksi D-galaktosa menunjukkan perubahan komposisi mikrobiota usus [17]. Oleh karena itu, kami berhipotesis bahwa perubahan komposisi mikrobiota usus dapat menyebabkan penurunan kognitif pada tikus model penuaan yang diinduksi galaktosa D, dan diselidiki jikaPolisakarida Cistanche deserticola(CDPS) dapat mengurangi penurunan kognitif dengan memulihkan disbiosis mikrobiota usus.

HASIL

Tikus model penuaan yang diinduksi D-galaktosa menunjukkan penurunan kognitif dan disbiosis mikroba usus

Kami menganalisis kinerja perilaku tikus tipe liar (WT) dan tikus yang diobati dengan 150 mg D-gal per Kg berat badan selama 2 bulan (model atau Mod) menggunakan pengenalan objek baru dan tes labirin air Morris (MWM). Nilai indeks preferensial dalam uji pengenalan objek baru berkurang secara signifikan pada tikus kelompok Mod dibandingkan dengan tikus kelompok WT (Gambar 1A, 1B). Hasil pengujian MWM menunjukkan bahwa escape latency time setelah hari keenam meningkat secara signifikan pada kelompok Mod dibandingkan dengan kelompok WT (Gambar 1C, 1D). Selain itu, target penyeberangan platform dan waktu berenang dalam kuadran target berkurang secara signifikan pada kelompok Mod dibandingkan dengan kelompok WT (Gambar 1E, 1F). Hasil ini menunjukkan penurunan yang signifikan dalam kemampuan belajar dan memori dari D gal-inducedpenuaantikus model.

Kami kemudian menganalisis perbedaan dalam kelimpahan dan komposisi filum, genus, dan spesies mikroba usus dalam sampel tinja kelompok Mod dan WT tikus menggunakan data sekuensing RNA ribosom (rRNA) 16S dari sampel tinja. Flora usus yang dominan pada tikus kelompok WT dan Mod adalah Firmicutes dan Bacteroides. Namun, kelimpahan Bacteroides berkurang secara signifikan dan kelimpahan Firmicutes meningkat secara signifikan pada kelompok Mod dibandingkan dengan kelompok WT (Gambar 2A). Selanjutnya, kami melakukan analisis diskriminan linier (LDA) untuk menentukan skor ukuran efek LDA (LEfSe) diikuti oleh uji Kruskal-Wallis dan Wilcoxon untuk mengevaluasi kelimpahan relatif taksa yang berbeda pada tikus kelompok WT dan Mod. Hasil LDA ditunjukkan pada Gambar 2B. Selanjutnya, kami membuat kladogram yang menunjukkan pengayaan diferensial dari berbagai genera dan spesies yang termasuk dalam filum Bacteriodes dan Firmicutes dalam kelompok WT dan model (Gambar 2C). Secara keseluruhan, hasil kami menunjukkan gangguan kemampuan kognitif dan dysbiosis mikroba usus pada tikus model penuaan yang diinduksi D-galaktosa.

Perawatan CDPS meningkatkan kemampuan kognitif pada tikus model penuaan yang diinduksi D-gal

Kami menganalisis jikaCDPSpengobatan mengurangi penurunan kognitif pada D-gal-inducedpenuaantikus model. Selama 2 bulan pemberian, dilakukan penimbangan berat badan setiap hari. Bobot tubuh model dan kelompok CDPS tikus serupa (Gambar 3A). Lakukan eksperimen perilaku setelah dosis terakhir. Pengenalan objek baru dan hasil tes labirin air Morris menunjukkan bahwa memori jangka pendek secara signifikan lebih tinggi pada kelompok tikus CDPS dibandingkan dengan kelompok tikus model; memori jangka panjang pada kelompok tikus CDPS lebih tinggi tetapi secara statistik tidak signifikan dibandingkan dengan kelompok tikus model (Gambar 3B, 3C). Ini menunjukkan bahwa pengobatan CDPS membatalkan hilangnya memori pengenalan objek jangka pendek pada tikus yang diobati dengan D-gal.

Pembelajaran spasial dan memori tikus-tikus ini dievaluasi dengan uji labirin air Morris, dan hasilnya menunjukkan bahwa waktu latensi melarikan diri dari tikus-tikus tersebut.CDPSkelompok tikus sebanding dengan kelompok tikus WT dan secara signifikan lebih pendek dari kelompok tikus Mod (Gambar 3D). Selanjutnya, waktu latensi keluar secara signifikan lebih rendah pada hari keenam setelah pemberian CDPS dibandingkan dengan kelompok model (Gambar 3E). Waktu berenang dalam kuadran target secara signifikan lebih tinggi pada kelompok CH dan CM dibandingkan dengan kelompok model. Kelompok CL lebih tinggi dari kelompok model tetapi tidak signifikan secara statistik (Gambar 3F). Selain itu, jumlah penyeberangan platform secara signifikan lebih tinggi pada kelompok CM dan CL dibandingkan dengan kelompok model. Namun, kelompok CH lebih tinggi dari kelompok model dan tidak ada signifikansi statistik (Gambar 3G). Hasil ini menunjukkan bahwa pengobatan CDPS meningkatkan pembelajaran spasial dan memori pada tikus model penuaan yang diinduksi D-gal.

Perawatan CDPS mengembalikan homeostasis komposisi mikrobiota usus pada tikus model penuaan D-galaktosa

Monosakarida dan polisakarida adalah nutrisi esensial yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri [18-21]. Dilaporkan juga bahwaCDPSmengatur komposisi mikrobiota usus [22]. Oleh karena itu, kami menganalisis apakah perawatan CDPS mengurangi disbiosis mikroba usus pada tikus kelompok model dengan mengevaluasi data sekuensing 16S rRNA sampel feses dari kelompok tikus WT, model, dan CDPS.

Pertama, kami menghitung indeks keragaman alfa untuk mengevaluasi keseluruhan kekayaan mikrobiota tinja dan perbedaan struktural di antara kelompok-kelompok ini. Kami menganalisis indeks keragaman alfa ( -keanekaragaman) seperti spesies yang diamati, nilai indeks Shannon, Chao 1, ACE, dan Simpson untuk menentukan perubahan komposisi berbagai spesies bakteri dalam sampel tinja dari kelompok murine yang berbeda. Indeks -diversity (spesies yang diamati, indeks Shannon, Chao 1, ACE dan Simpson) lebih tinggi di WT danCDPSkelompok tikus dibandingkan dengan kelompok model, tetapi signifikansi statistik hanya diamati untuk nilai indeks Chao 1 antara kelompok CM dan kelompok Mod. Ini menunjukkan bahwa pemberian dengan CDPS meningkatkan kekayaan mikrobioma (Gambar 4A-4E). Selanjutnya, kami menganalisis indeks -diversity untuk mengidentifikasi perbedaan spesies mikroba usus antara kelompok tikus WT, model, dan CDPS menggunakan Non-metric Multidimensional Scaling (NMDS), Principal Coordinates Analysis (PCoA), dan Principal Component Analysis (PCA) . PCA menunjukkan variasi komposisi mikroba usus dari kelompok model tikus selamapenuaanproses, termasuk pengurangan dimensi dan pemeliharaan pola dan tren (Gambar 4F). Perbedaan mikrobiota tinja antara kelompok WT, model, dan CDPS diidentifikasi berdasarkan PCoA dari jarak UniFrac yang tidak tertimbang untuk gen 16S rRNA (Gambar 4G). Analisis pengelompokan menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam NMDS antara kelompok model dan kelompok WT dan CDPS (Gambar 4H).

Kami mengevaluasi 10 filum teratas dari mikrobiota usus dan menemukan bahwa kelimpahan filum Bacteroides secara signifikan lebih tinggi pada kelompok CH, CM dan CL dibandingkan dengan kelompok model (Gambar 4I). Ini menunjukkan bahwa CDPS memulihkan homeostasis mikrobiota usus pada tikus yang diobati dengan D-gal. Kladogram menunjukkan pengayaan diferensial dari berbagai genera dan spesies yang termasuk dalam filum Bacteriodes dan Firmicutes dalam kelompok WT, model, dan CDPS (Gambar 4J). Seperti yang ditunjukkan pada peta panas,CDPSperawatan mengurangi kelimpahan relatif Thermoplasmata, Bacillus, Actinobacteria, Fusobacteriia, dan Elusimicrobia yang tidak teridentifikasi dan meningkatkan kelimpahan relatif Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, Deferribacteres, Mollicutes, Nitrososphaeria, Anaeroline, dan Erysipelotrichia yang tidak teridentifikasi_ }Cyanobacteria dibandingkan dengan kelompok model (Gambar 4K). Hasil ini menunjukkan bahwa pengobatan CDPS secara signifikan memulihkan homeostasis mikrobiota usus pada tikus model penuaan yang diinduksi D-gal.

Perawatan CDPS mengurangi degenerasi saraf pada tikus model penuaan yang diinduksi D-gal dengan mengurangi stres oksidatif

Kami selanjutnya menganalisis efek CDPS pada peradangan dengan menganalisis kadar serum sitokin pro-inflamasi (IL-2 dan TNF- ), dan sitokin anti-inflamasi (IL-4 dan IL-10 ) pada kelompok tikus yang berbeda. Kadar serum IL-2 dan TNF- secara signifikan lebih rendah dan kadar serum IL-4 dan IL-10 secara signifikan lebih tinggi pada kelompok CH, CM dan CL dibandingkan dengan kelompok model . Itu menunjukkan bahwaCDPSmemiliki efek anti-inflamasi (Gambar 5A-5D).

Stres oksidatif disebabkan oleh peningkatan produksi spesies oksigen reaktif (ROS) dan merupakan salah satu faktor utama yang mempromosikanpenuaan[23]. Oleh karena itu, kami menganalisis efek CDPS pada stres oksidatif pada model tikus penuaan yang diinduksi D-gal dengan mengevaluasi kadar serum enzim antioksidan, SOD, dan produk peroksidasi lipid, malondialdehid (MDA). Kadar serum MDA secara signifikan lebih tinggi dan kadar serum SOD berkurang secara signifikan pada kelompok Mod dibandingkan dengan kelompok WT, tetapi,CDPSpengobatan membalikkan efek ini (Gambar 5E, 5F). Hasil ini menunjukkan bahwa stres oksidatif meningkat pada tikus model penuaan yang diinduksi D-gal, tetapi dikurangi dengan pengobatan CDPS.

Selanjutnya, kami menilai tingkat stres oksidatif di jaringan otak dengan menganalisis tingkat produk protein teroksidasi lanjutan (AOPP), peroksidasi lipid langsung (LPO), dan MDA serta aktivitas enzim antioksidan seperti glutathione peroxidase (GSH-Px ) dan superoksida dismutase (SOD) dalam homogenat jaringan otak. Otak tikus kelompok Mod menunjukkan penurunan aktivitas SOD dan GSH-PX secara signifikan dan peningkatan kadar AOPP, LPO dan MDA secara signifikan dibandingkan dengan kelompok WT, tetapi efek ini terbalik pada kelompok CH, CM dan CL (Gambar 6A-6E ).

Selanjutnya, kami melakukan pewarnaan histologis bagian otak dengan pewarnaan H&E dan Nissl untuk menilai efek perlindungan dariCDPSpada otak yang diinduksi D-galpenuaantikus model. Tikus kelompok Mod menunjukkan pengurangan yang signifikan dalam jumlah dan volume neuron, peningkatan kesenjangan antara neuron, susunan neuron yang tidak teratur, dan piknosis nuklir di wilayah CA1 hippocampus dibandingkan dengan kelompok WT, tetapi perubahan patologis ini berkurang secara signifikan dengan perawatan CDPS ( Gambar 6F). Hasil ini menunjukkan bahwa perawatan CDPS secara signifikan mengurangi stres oksidatif dan patologi otak pada tikus model penuaan yang diinduksi D gal.

Perawatan CDPS mengurangi peradangan perifer dan stres oksidatif dengan mempertahankan homeostasis mikroba usus pada tikus model yang diinduksi D-gal

Selanjutnya, kami menganalisis apakah perubahan komposisi mikrobiota usus dikaitkan dengan peningkatan peradangan perifer dan stres oksidatif selama penuaan. Menuju ini, kami menggunakan koktail tiga antibiotik (kelompok ABX) atau siklofosfamid (kelompok Cy; juga lihat Bahan dan metode) untuk mengikis mikrobiota usus atau menginduksi imunosupresi pada CDPS yang diobatipenuaantikus model. Pengobatan antibiotik membatalkan efek menguntungkan dari pengobatan CDPS pada tikus model yang menua. Kami mengamati gangguan pembelajaran dan memori (Gambar 7A), dan perubahan komposisi mikrobiota usus (Gambar 7B, 7C) pada tikus kelompok ABX dibandingkan dengan kelompok yang diobati dengan CDPS. Hasil di atas menunjukkan bahwa bahkan administrasiCDPStidak dapat meningkatkan kemampuan belajar dan memori tikus setelah mengubah flora usus. Selain itu, kami mengamati peningkatan kadar sitokin pro-inflamasi di otak dan serum tikus kelompok ABX dibandingkan dengan kelompok CDPS (Gambar 7D-7N). Hasil kelompok ABX dan kelompok CY menunjukkan bahwa setelah flora usus dan fungsi imun dirusak, pemberian CDPS pun tidak dapat meningkatkan kemampuan belajar dan memori mencit. Hasil ini menunjukkan bahwa pengobatan CDPS menurunkan peradangan perifer, stres oksidatif dan penurunan kognitif pada D gal-inducedpenuaantikus model dengan mencegah dysbiosis usus.

Kami kemudian menggunakan obat imunosupresif, siklofosfamid [24] untuk menentukan peran peradangan dalam efek menguntungkan dari CDPS. Tikus CDPS yang diobati dengan siklofosfamid (kelompok Cy) menunjukkan gangguan belajar dan kemampuan memori, perubahan dalam komposisi mikrobiota usus, dan tingkat sitokin pro-dan anti-inflamasi yang menyimpang di otak dan serum dibandingkan dengan tikus tipe liar dan tikus.CDPStikus kelompok. Namun, tidak ada signifikansi dibandingkan dengan model dan kelompok ABX. (Gambar 7A–7N). Data ini menunjukkan bahwa perubahan komposisi mikrobiota usus meningkatkan peradangan perifer pada D-gal-inducedpenuaantikus model.

CDPS mencegah penuaan yang diinduksi D-gal dengan mengatur metabolisme asam amino

Sistem imun pejamu dipengaruhi oleh metabolit yang dihasilkan oleh mikrobiota usus [25]. Metabolit tinja mewakili pembacaan fungsional metabolisme mikroba usus dan komposisi mikroba usus [26]. Selain itu, metabolit mikrobiota usus masuk ke dalam sirkulasi darah dan berdampak pada metabolisme dan kesehatan inang [26, 27]. Sebanyak 1058 metabolit diidentifikasi dalam sampel serum dari fWT, Mod danCDPStikus. Kemudian, kami menganalisis metabolit ini menggunakan BioCyc, Kyoto Encyclopedia of Gens and Genomes (KEGG) dan Human Metabolome Database (HMDB) dan menemukan bahwa 65 metabolit diekspresikan secara berbeda dalam kelompok Mod dibandingkan dengan kelompok WT. Lebih lanjut, kami menemukan bahwa kadar 8 metabolit (kreatinin, valin, L-(-)-Metionin, o-Toluidin, N Etilanilin, asam urat, prolin, dan fenilalanin) berbeda secara signifikan di antara kelompok WT, Mod, dan CDPS. Analisis pengayaan jalur dari 8 metabolit ini menggunakan MetaboAnalyst [28, 29] menunjukkan bahwa metabolit ini terkait dengan metabolisme arginin, histidin, arginin, prolin, dan purin (Gambar 8A, 8B). 7 metabolit yang berbeda dari kelompok MOD dan kelompok CDPS dalam kelompok WT.

Kami kemudian menganalisis apakah perubahan metabolisme asam amino terkait dengan perubahan komposisi mikrobiota usus. Kami mengamati bahwa 7 metabolit berbeda dari kelompok WT, Mod dan CDPS (kreatinin, valin, L-(-)-Metionin, o-Toluidin, N-Etilanilin, asam urat, dan prolin) menurun secara signifikan pada ABX, Cy, dan Kelompok mod dibandingkan dengan kelompok WT dan CDPS. Selain itu, tidak ada signifikansi antara kelompok ABX dan Cy (Gambar 8C). Akhirnya, untuk mengeksplorasi ada korelasi antara metabolisme diferensial dan penyakit terkait penuaan lainnya. Kami menganalisis korelasi antara tujuh metabolit yang diekspresikan secara berbeda dan penyakit manusia menggunakan database MetaboAnalyst dan menemukan bahwa metabolit ini terkait dengan penyakit Alzheimer (p=0.00173; Gambar 8D, 8E). Secara keseluruhan, data ini menyarankan bahwaCDPSmelindungi terhadap D-gal-inducedpenuaandengan mengatur metabolisme asam amino.

DISKUSI

Penurunan progresif dalam fungsi kognitif adalah ciri khas penuaan. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa pengobatan CDPS secara signifikan meningkatkan pembelajaran dan memori pada model tikus yang menua [30-33]. Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa pengobatan CDPS meningkatkan fungsi kognitif dengan menghambat peradangan perifer dan stres oksidatif melalui pemulihan homeostasis mikroba usus di D-gal-inducedpenuaantikus model (Gambar 9). Tikus Sprague-Dawley diberi makan denganPolisakarida Cistanchemenunjukkan peningkatan pertumbuhan bakteri usus yang menguntungkan dan peningkatan keragaman mikroba usus [34]. CDA-0.05, polisakarida netral Cistanche, meningkatkan pertumbuhan probiotik Lactobacilli [22]. Data ini menunjukkan bahwa polisakarida Cistanche meningkatkan homeostasis bakteri usus.

Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwaCDPSmemiliki efek anti-inflamasi dan meningkatkan kemampuan kognitif tikus model penuaan dengan memodulasi kelimpahan genera bakteri usus seperti Bacteroidetes, Firmicutes, dan Proteobacteria. Oleh karena itu, CDPS mungkin bermanfaat secara terapeutik untuk penyakit terkait penuaan dengan membentuk kembali komposisi mikrobiota usus [35,36]. Selain itu, penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa tingkat sitokin inflamasi dalam serum dan usus besar berhubungan dengan kelimpahan relatif genera bakteri seperti Bacteroidetes, Firmicutes, dan Proteobacteria [37, 38]. Selanjutnya, komposisi mikroba usus mengatur fungsi otak dengan memodulasi tingkat sirkulasi beberapa sitokin [39-43]. Hasil kami menunjukkan bahwa pengobatan CDPS menurunkan kelimpahan relatif Thermoplasmata, Bacillus, Actinobacteria, Fusobacteriia, dan Elusimicrobia yang tidak teridentifikasi, dan meningkatkan kelimpahan relatif Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, Deferribacteres, Mollicutes, Nitrososphaeria, Anaerolineae, yang tidak teridentifikasi. Erysipelotrichia, dan tidak teridentifikasi_Cyanobacteria.

Metabolit mikroba usus dilepaskan ke dalam aliran darah dan mengatur kesehatan dan metabolisme inang [26, 27]. Metabolit mikroba usus dapat diperkirakan dengan mengevaluasi komposisi metabolit tinja, yang berubah dengan perubahan komposisi mikroba usus [44]. Studi terbaru menunjukkan bahwa kadar plasma sitrulin, prolin, arginin, asparagin, fenilalanin dan treonin berhubungan dengan gangguan neurodegeneratif termasuk penyakit Alzheimer [45, 46]. Studi kami menunjukkan bahwa kadar serum kreatinin, valin, L-metionin, o-Toluidin, N etianilin, asam urat dan prolin dikaitkan dengan D-gal-inducedpenuaanpada tikus.

Lengan bawaan dan adaptif dari sistem kekebalan memainkan peran penting dalam mempertahankan homeostasis host-mikroba di permukaan luminal usus [47]. Mikrobiota usus juga memainkan peran penting dalam mengatur sistem saraf pusat (SSP) dan kekebalan dengan melepaskan sitokin dan metabolit ke dalam aliran darah [48, 49]. Sitokin pro-inflamasi memainkan peran kunci dalam beberapa penyakit neurodegeneratif [50-52]. Misalnya, degenerasi makula terkait usia (AMD) dan glaukoma berhubungan dengan akumulasi ekstraseluler amiloid (A) dan deposisi intraseluler tau hiper-fosforilasi (p-tau) dan besi dalam sel ganglion retina (RGC) [44]. Selain itu, peradangan memainkan peran penting dalam patogenesis yang terkait dengan glaukoma [53]. Gangguan penglihatan merupakan gejala awal penyakit Alzheimer (AD) dan dimanifestasikan sebelum timbulnya penurunan kognitif [54]. Studi kami menunjukkan bahwaCDPSmelindungi terhadap penurunan kognitif dan peradangan perifer dengan mempertahankan homeostasis mikrobiota usus.

Ada beberapa keterbatasan dalam penelitian ini. Pertama, hubungan antara metabolisme asam amino dan komposisi mikrobiota usus tidak diketahui dengan baik. Kedua, komposisi dan struktur molekul CDPS tidak diketahui. Oleh karena itu, penelitian di masa depan diperlukan untuk mengeksplorasi lebih lanjut peran regulasi CDPS dalam mengurangi AD melalui sumbu pensinyalan mikrobiota usus.

Sebagai kesimpulan, penelitian kami menunjukkan bahwaCDPSpeningkatan kemampuan kognitif di D-gal-inducedpenuaantikus model dengan memulihkan homeostasis mikrobiota usus, sehingga memulihkan ketidakseimbangan asam amino, peradangan perifer, dan stres oksidatif. Temuan ini menunjukkan bahwa CDPS adalah terapi potensial untuk pasien dengan gangguan belajar dan memori, terutama yang terkait dengan dysbiosis usus.

BAHAN DAN METODE

Persiapan CDPS

Sekitar 1.0 Kg dibersihkanDeserticola Cistanchedikeringkan di dalam oven pada suhu 40 derajat C dan dihaluskan menjadi bubuk kasar. Serbuk diekstraksi dalam etanol panas selama 3 jam. Residu disaring dengan kain kasa untuk menghilangkan filtrat kemudian diencerkan dengan air (8X) dan direfluks secara berurutan selama 2 jam, 1,5 jam, dan 1 jam pada suhu 90 derajat C. Pada setiap titik waktu, larutan disentrifugasi untuk memisahkan supernatan dan dikombinasikan dengan filtrat coklat-merah. Kemudian, filtrat dipekatkan di bawah tekanan yang dikurangi, didinginkan sampai suhu kamar, ditambahkan perlahan-lahan ke etanol 95 persen (3X), dan didiamkan pada suhu 4 derajat C selama 24 jam. Kemudian, larutan disentrifugasi pada 6000 r/min selama 20 menit pada 4 derajat C. Endapan dikumpulkan setelah ekstraksi air dan pengendapan alkohol tiga kali. Endapan dilarutkan dalam air, dideproteinisasi, didialisis, dan dikeringkan-beku untuk mendapatkan minyak mentahPolisakarida Cistanche deserticola(CDPS). Kandungan polisakarida lebih dari 90 persen seperti yang dievaluasi dengan spektrofotometri ultraviolet.

Pengelompokan dan perawatan hewan

Tikus Kunming jantan berusia delapan minggu (No. Lisensi SCXK2019-0010) dibeli dari SPF Biotechnology Co. Ltd (Beijing, China), ditempatkan di ruangan yang terang dan suhunya dikontrol, serta diberi makan dan minum. Semua percobaan hewan dilakukan sesuai dengan protokol yang disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional Universitas Kedokteran Mongolia Dalam. Eksperimen dilakukan sesuai dengan Panduan National Institutes of Health (NIH) untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium.

Setelah 1 minggu adaptasi dengan lingkungan baru, 120 mencit dibagi menjadi 7 kelompok berikut: (1) wild type control (WT); kelompok model (150 mg/Kg/hari D-gal; Mod); (3) CH: D-gal ditambah 100 mg/kg CDPS; (4) CM: D-gal ditambah 50 mg/kgCDPS; (5) CL: D-gal ditambah 25 mg/kg CDPS; (6) kelompok ABX: antibiotik plus D-gal plus 50 mg/Kg CDPS; (7) Kelompok Cy: siklofosfamid ditambah D-gal ditambah 50mg/kg CDPS.

Tikus-tikus dari model, kelompok ABX, Cy, dan CDPS menerima injeksi subkutan dari larutan garam 150 mg/kg D-gal setiap hari selama 2 bulan. Kelompok WT disuntik secara subkutan dengan volume saline yang sama selama 2 bulan. Tikus kelompok CDPS juga diberikan setiap hari dengan injeksi intragastrik yang mengandung 100 mg/kg, 50 mg/Kg atau 25 mg/Kg CDPS selama 2 bulan. Tikus kelompok ABX menerima air minum dengan 0,1 mg/mL ampisilin dan 0,5 mg/mL streptomisin selama 2 bulan selain D-gal danCDPSsuntikan. Sebelum pemberian D-gal, mencit mendapat suntikan yang mengandung 0.1 mg/mL ampisilin, 0.5 mg/mL streptomisin, dan 0.1 mg/mL colistin selama 7 hari dalam kelompok ABX. Tikus kelompok Cy menerima suntikan intraperitoneal 20 mg/Kg siklofosfamid setiap hari (qod) selama 2 bulan di samping suntikan harian D-gal dan CDPS.

Tes pengenalan objek baru

Lakukan eksperimen perilaku setelah dosis terakhir. Tes pengenalan objek melibatkan tahap pengenalan, pelatihan, dan pengujian. Selama tahap pengenalan, mencit dibiasakan dalam ruang pengujian yang kosong selama 10 menit selama dua hari. Kemudian, pada hari ketiga (hari pelatihan), dua benda dengan ukuran, bentuk, dan warna yang sama (A1 dan A2) ditempatkan pada ujung chamber yang berlawanan. Setiap tikus kemudian diberikan waktu 10 menit untuk menjelajahi dua objek yang serupa. Setelah 1-jam (pada hari ketiga) dan 24-jam (pada hari keempat) interval pelatihan-ke-pengujian, salah satu objek serupa (A1 atau A2) diganti dengan B atau C benda yang berbeda ukuran, warna dan bentuknya pada hari pengujian. Selama tahap pengujian, setiap tikus diuji selama 5 menit dan indeks preferensial dihitung untuk menentukan memori pengenalan objek baru (B atau C) menggunakan rumus berikut: Indeks preferensi=Waktu pada objek B atau C/( Waktu pada benda B atau C ditambah Waktu pada benda A)×100 persen .

Tes labirin air Morris

Pengujian water maze Morris dilakukan pada kolam berbentuk bulat dengan kedalaman 45 cm dan diameter 90 cm. Protokol yang dijelaskan oleh Ruediger S, et al. (2011) [55] dan Kayu RA, et al. (2018) [56] dipekerjakan di sini. Kedalaman air di kolam adalah 30 cm, dan suhu air 20±1 derajat C. Platform berdiameter 6 cm dan di bawah air 1 cm. Waktu untuk pelatihan dan pengujian masing-masing adalah 60 detik. Untuk pelatihan, kami melakukan empat uji coba masing-masing 60 detik dengan platform tersembunyi setiap hari selama lima hari berturut-turut. Jika platform tidak ditemukan oleh tikus dalam 60 detik, mereka dipandu ke platform dan ditempatkan di platform selama 5 detik. Selama tahap pengujian, latensi untuk mencapai platform tersembunyi dalam sesi pelatihan dan uji coba penyelidikan, jumlah persimpangan lokasi platform yang dihapus, dan waktu yang dihabiskan di kuadran target (platform) dicatat dan dianalisis.

tes ELISA

Kadar serum sitokin pro-inflamasi seperti IL-2(), IL-4, IL-10, dan TNF- dianalisis untuk setiap kelompok tikus menggunakan kit ELISA yang dibeli dari Shanghai Yi Li Biological Technology Co., Ltd.(Shanghai, China) sesuai dengan instruksi pabriknya. Aktivitas enzim antioksidan, superoksida dismutase (SOD), dan kadar produk peroksidasi lipid, malondialdehid (MDA), dalam serum setiap kelompok tikus dianalisis dengan kit uji yang dibeli dari Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China) . Tingkat produk protein oksidasi lanjutan (AOPP) dalam sampel hipokampus murine diperkirakan menggunakan kit ELISA dari Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd.(Shanghai, China) menurut petunjuk pabrik.

Estimasi stres oksidatif pada otak murine

Kami menghomogenkan 100 mg jaringan hipokampus dengan 0,9 ml saline dingin dan homogenat disentrifugasi pada 12000 rpm selama 30 menit pada suhu 4 derajat C. Kandungan protein dalam supernatan dianalisis menggunakan BCA Protein Assay Kit ( Bioteknologi Beyotime, Shanghai, Cina). Tingkat peroksidasi lipid (LPO) dan malondialdehid (MDA), dan aktivitas GSH-Px dan SOD dalam sampel hipokampus dianalisis dengan kolorimetri menggunakan kit dari Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, China) sesuai dengan instruksi pabrik.

Komposisi mikrobiota usus

Sampel tinja dikumpulkan dari semua tikus dan segera disimpan pada -80 derajat C. Wilayah V3 plus V4 dari gen 16S rRNA diurutkan menggunakan Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Beijing, China) dan dianalisis menggunakan QIIME platform terbuka untuk menentukan profil mikrobiota usus.

Analisis LC/MS dari metabolit serum

Sampel serum diinkubasi selama 10 menit dengan metanol pra-dingin dalam perbandingan 1:3 untuk mengendapkan protein. Sampel disentrifugasi pada 12000r/min selama 15 menit pada 4 derajat C. Supernatan dianalisis dengan Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 Rapid Resolution Liquid Chromatography dan spektrum massa QExactive. Kondisi kromatografi ditunjukkan pada Tabel 1. Analit dipisahkan dalam kolom kromatografi XBridge BEH Amide (2,1 × 100 mm; Waters Co., Milford, MA, USA) menggunakan 0,1 persen asam format dan asetonitril sebagai fase gerak A dan B , masing-masing. Laju aliran ditetapkan pada 0,4 ml/menit, volume injeksi adalah 5 l, dan suhu kolom diatur pada 25 derajat C (Tabel 1). Sinyal spektrum massa diperoleh dengan menggunakan mode pemindaian ion positif dan negatif. Tegangan semprotan ion dan parameter MS spesifik lainnya ditunjukkan pada Tabel 2.

Analisis statistik

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0 dan p< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">