R. Vesicarius L. Memberikan Efek Nefroprotektif Terhadap Stres Oksidatif yang Diinduksi Cisplatin
Mar 26, 2022
Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}
Md. Mahmudul Hasan1, Paling. Sayla Tasmin2, Ahmed M. El-Shehawi3, Mona M. Elseehy4, Md. Abu Reza1dan Ariful Haque2*
Abstrak
Latar belakang:Cisplatin adalah obat antikanker yang luar biasa, tetapi penggunaannya telah sangat berkurang karena nefrotoksisitas yang parah. R. vicarious L. adalah sayuran berdaun hijau yang terbukti memiliki potensi anti-angiogenik, anti-inflamasi, anti-proliferasi, hepatoprotektif, dan nefroprotektif. Oleh karena itu, penelitian ini dirancang untuk memeriksa ekstrak metanol (RVE) untuk kemungkinan efek nefroprotektif.
Metode:Terutama, secara in vitro, aktivitas antioksidan RVE dikonfirmasi berdasarkan 2, 2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) kemampuan menangkap radikal bebas. Setelah itu, tikus jantan Swiss Albino diobati dengan cisplatin (2,5 mg/kg) selama 5 hari berturut-turut untuk menginduksi nefrotoksisitas. Pemulihan dari nefrotoksisitas diteliti dengan memperlakukan hewan dengan RVE (25, 50, dan 100 mg/kg) secara intraperitoneal (ip) selama 5 hari berturut-turut berikutnya. Setelah selesai pengobatan, mencit dikorbankan dan diambil ginjalnya. Sebagian dihomogenkan dalam buffer natrium fosfat untuk menilai kadar malondialdehid (MDA), sebagian lagi digunakan untuk mengevaluasi ekspresi gen (NQO1, p53, dan Bcl-2). Selain itu, kapasitas penetralan hidrogen peroksida (H2O2) dari RVE dievaluasi dalam sel HK-2 secara in vitro. Akhirnya, fitokimia bioaktif dalam RVE ditentukan menggunakan kromatografi gas-spektrometri massa (GC-MS).
Hasil:RVE menunjukkan aktivitas antioksidan in vitro secara tergantung dosis dengan nilai IC50 37,39 ± 1,89 ug/mL.
Pengobatan dengan RVE sangat (p < {{0}}.05)="" menurunkan="" kandungan="" mda="" dalam="" jaringan="" ginjal.="" selain="" itu,="" ekspresi="" gen="" nqo,="" p53,="" dan="" bcl-2="" secara="" signifikan="" (p=""><0,05) dikurangi="" dengan="" cara="" yang="" bergantung="" pada="" dosis="" karena="" pemberian="" rve.="" rve="" secara="" signifikan="" (p=""><0,05) membalikkan="" tingkat="" h2o2="" dalam="" sel="" hk-2="" menjadi="" hampir="" normal.="" dari="" gc-ms,="" sepuluh="" senyawa="" termasuk="" tiga="" antioksidan="" yang="" dikenal="" "4h-pyran-4-satu,="" 2,="" 3-dihidro-3,5-dihidroksi-6-metil-"="" ,="" "asam="" heksadekanoat",="" dan="" "squalene"="" terdeteksi.="" ekstraknya="" kaya="" dengan="" alkaloid="">
Kesimpulan:Secara keseluruhan, RVE memiliki efek perlindungan terhadap kerusakan ginjal yang diinduksi cisplatin.
Kata kunci:Cisplatin, R. vicarious, Tikus, Ginjal, sel HK-2, Stres oksidatif, gen NQO1
Cistanche deserticola mencegah penyakit ginjal, klik di sini untuk mendapatkan sampelnya
pengantar
Stres oksidatif adalah hasil dari ketidakseimbangan antara pembentukan spesies oksigen reaktif (ROS) dan mekanisme pertahanan antioksidan reguler [1]. Reaksi biokimia yang teratur, sering terpapar lingkungan yang tidak menguntungkan, dan peningkatan asupan xenobiotik menghasilkan produksi ROS [1]. ROS berinteraksi dengan residu sistein dari molekul pensinyalan sensitif redoks termasuk faktor transkripsi, protein tirosin fosfatase, dan protein kinase; akibatnya, oksidasi gugus tiol pada residu ini memandu perubahan protein yang ditargetkan, tindakan biologis, kapasitas pensinyalan, kekebalan, dan paradigma sel hidup/mati tambahan [2]. Spesies kimia yang mengandung oksigen memiliki sifat reaktif yang dikenal sebagai ROS yang meliputi radikal bebas dan molekul non-radikal seperti superoksida dan H2O2, masing-masing [3]. Stres oksidatif yang disebabkan oleh ROS dikaitkan dengan etiologi berbagai penyakit termasuk kanker. Leukemia mieloid akut (AML) adalah pertumbuhan kanker sel darah di dalam sumsum tulang. Peristiwa seluler dan molekuler yang mendasari AML termasuk kerusakan DNA, propagasi klonal, peningkatan kematian sel, dan ketidakstabilan genetik lebih lanjut, yang merupakan hasil dari stres oksidatif yang diinduksi ROS [4]. Fisiologi manusia telah dikaruniai berbagai mekanisme yang dapat menghasilkan antioksidan untuk memberikan perlindungan terhadap stres oksidatif yang mengarah untuk melindungi sel dari efek toksik dan berfungsi untuk pencegahan penyakit [5]. Namun, sel mengembangkan mekanisme endogen untuk melawan stres oksidatif dan melestarikan ROS yang dibutuhkan [6].
NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1 (NQO1) adalah flavoenzyme [7] yang dapat mengkatalisis reduksi dua atau empat elektron dan memanfaatkan sifat ini untuk mendetoksifikasi kina [8]. Ini dapat melindungi sel dari kerusakan oksidatif dengan menjaga siklus redoks ke samping dan dengan mengurangi produksi radikal bebas [8]. Selain detoksifikasi xenobiotik, NQO1 juga terlibat dalam netralisasi superoksida, modulasi degradasi proteasomal p53 [9], penghambatan Bcl-2 [10], dan peningkatan kerentanan terhadap cedera sel [11].
Cisplatin adalah obat antikanker berbasis platinum pertama yang disetujui oleh Food and Drug Administration (FDA) [12]. Cisplatin memberikan apoptosis dengan menginduksi stres oksidatif dan ekspresi berlebih dari gen supresor tumor p53 [12]. Beberapa efek samping termasuk nefrotoksisitas, hepatotoksisitas, gastrotoksisitas, ototoxicity, myelosupresi, dan neurotoksisitas adalah hasil dari stres oksidatif yang diinduksi cisplatin [12]. Efek samping ini sangat mengurangi penggunaan cisplatin meskipun memiliki aktivitas antikanker yang luar biasa. Cisplatin diketahui dapat menginduksi stres oksidatif dan menekan gen NQO1 pada ginjal tikus [13]. Oleh karena itu, pencarian dan validasi sumber antioksidan alami yang efektif menjadi area kesadaran. Asupan antioksidan makanan yang berasal dari tumbuhan seperti flavonoid, karotenoid, dan senyawa fenolik dapat menyebabkan perlindungan terhadap penyakit kardiovaskular, katarak, dan kanker [14].
R. vicarious (Polygonaceae) dikenal sebagai "Takpalong/ Chukapalong/Amlabetom" dalam bahasa Bengali [15]. Tumbuh di gurun dan daerah semi-gurun di Asia, Australia, dan Afrika Utara [16]. Ini adalah tanaman langka yang jarang dipelajari di Bangladesh. Di Bangladesh, orang mengkonsumsi seluruh tanaman sebagai sayuran setelah dimasak dengan garam, rempah-rempah yang berbeda, dan minyak. Terkadang, orang hanya menggunakan daun segar dalam salad campuran sebagai alternatif selada. Daun mentah sedikit asam, tetapi menjadi sangat asam setelah dimasak. Selain itu, sedikit daun biasanya dicampur dalam masakan ikan selama memasak untuk memiliki rasa yang agak asam.
Tanaman ini digunakan sebagai sayuran dan ramuan obat di seluruh dunia [17]. Daun dan bijinya masing-masing digunakan sebagai penangkal racun ular dan kalajengking [17]. Dalam pengobatan tradisional, R. vicarious telah lama digunakan untuk mengobati penyakit hati, pencernaan yang buruk, sembelit, ambeien, muntah, perut kembung, gangguan jantung, nyeri, gangguan limpa, dispepsia, sakit gigi, bronkitis, asma, kudis, leukoderma, dan sebagai pencahar, perut, pembuka, tonik, diuretik, dan analgesik [18]. Tumbuhan ini mengandung berbagai senyawa biologis penting termasuk flavonoid, antrakuinon, karotenoid, vitamin, lipid, dan asam organik, yang dikenal sebagai agen antioksidan, antimikroba, dan antikanker [19]. Setiap bagian dari tanaman ini mengandung quercetin (flavonoid) dalam jumlah yang tinggi [15]. Tanaman ini mengandung 0 .25 mg vitamin A, 1,33 mg vitamin C, 2,37 mg vitamin E [15], 3,38 mg flavonoid, dan 5,66 mg polifenol [20] per 100 g berat kering.
Shahat dan rekan [21] menunjukkan efek anti-angiogenik dan anti-proliferatif ekstrak metanol (80 persen) dari bagian udara perwakilan R. terhadap karsinoma hepatoseluler pada model tikus. Studi lain menunjukkan potensi anti-angiogenik in vitro dari ekstrak perwakilan R. [22]. Ekstrak metanol dari seluruh perwakilan R. memberikan perlindungan terhadap hepatotoksisitas yang diinduksi karbon tetraklorida in vivo [23]. Efek anti-inflamasi pada kelinci telah dibuktikan dengan ekstrak daun metanol R. vicarious [24]. Sebuah studi baru-baru ini [25] melaporkan efek nefroprotektif in vivo dari ekstrak etanolik R. perwakilan terfraksionasi terhadap toksisitas gentamisin dan kalium dikromat.
Dengan mempertimbangkan informasi di atas, kami bertujuan untuk memeriksa efek ekstrak perwakilan R. (RVE) dalam hal pemulihan dari nefrotoksisitas yang diinduksi cisplatin melalui mempertahankan ekspresi gen NQO1 dalam model hewan.
manfaat kesehatan cistanche: mengobati penyakit ginjal
Bahan dan metode
Bahan kimia dan reagen
Cisplatin dan 2, 2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) dibeli dari SIGMA-ALDRICH (AS).
Kit Uji Kolorimetri Kreatinin (ID produk – 700.460) dibeli dari Cayman Chemical (AS). Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), serum janin sapi (FBS), dan antibiotik (10,000 U/mL penisilin dan 10,000 ug/mL streptomisin) dibeli dari Gibco (Gibco Laboratories, AMERIKA SERIKAT). Kit ROS-Glo™ H2O2 Assay dan GoTaq® qPCR Master Mix diperoleh dari Promega (AS). Kit transkripsi terbalik TIAN-Script M-MLV dibeli dari TIANGEN (China) dan primer dari IDT (Integrated DNA Technologies, Malaysia). Semua bahan kimia dan reagen lain yang digunakan dalam percobaan ini adalah kelas analitis.
Pengumpulan sampel tanaman dan preparasi ekstrak
Tanaman perwakilan R. segar dibeli dari pasar lokal di Sonadighi, Rajshahi, Bangladesh. Spesimen tanaman diidentifikasi dan disahkan oleh Dr. Ahmad Humayan Kabir, Departemen Botani, Universitas Rajshahi, Bangladesh. Sebuah spesimen di bawah voucher no. 00095 disimpan di herbarium Departemen Botani, Universitas Rajshahi. Bagian atas tanaman dibersihkan, dikeringkan pada suhu 37 derajat, digiling menjadi bubuk kasar menggunakan pengering elektronik, dan disimpan dalam wadah tertutup pada suhu 4 derajat. Serbuk halus (10 g) dilarutkan dalam metanol (500 mL). Konten disonikasi (Soniprep 150, China) pada 20 kHz selama 10 menit. Penyaringan ekstrak dilakukan dengan menggunakan kertas Filter Fiber Glass (Macherey NAGEL, GmBH, German) dengan DURAN Filtering Apparatus (Jerman). Akhirnya, filtrat dipekatkan menggunakan pengering beku (VirTis Benchtop Pro, SP SCIENTIFIC, USA). Ekstrak itu akhirnya diberi nama RVE.
Uji aktivitas antioksidan in-vitro
Kapasitas antioksidan in-vitro RVE dilakukan berdasarkan pemulungan DPPH seperti yang dijelaskan sebelumnya [26] dengan sedikit modifikasi. Kemampuan scavenging radikal DPPH dari RVE dinilai berdasarkan konversi warna ungu DPPH menjadi warna kuning. Campuran reaksi dalam setiap tabung mikrosentrifus (2 mL) terdiri dari 950 L larutan metanol radikal DPPH (0,1 mM) dan 50 L RVE dari lima konsentrasi yang berbeda (200, 500, 1000, 2000, dan 4000 ug /mL methanol) untuk membuat konsentrasi akhir 10, 25, 50, 100 dan 200 ug/mL. Tabung lain yang berisi 50 L metanol dan 950 L larutan metanol DPPH disimpan sebagai kontrol. Tabung reaksi dibiarkan selama 30 menit di tempat gelap. Absorbansi campuran diambil pada 517 nm menggunakan spektrofotometer GENESYS 10S UV-VIS (Thermo SCIENTIFIC, USA). Akhirnya, persentase aktivitas radikal scavenging (RSA) dihitung berdasarkan perubahan warna DPPH menggunakan rumus berikut persen RSA=[(ADPPH ARVE)/ADPPH] × 100 di mana ADPPH adalah absorbansi larutan DPPH (kontrol) dan ARVE adalah absorbansi larutan RVE. Konsentrasi di mana RVE menghasilkan 50 persen RSA disebut sebagai nilai IC50 dan dihitung menggunakan grafik yang menempatkan persen RSA terhadap konsentrasi RVE berbeda yang digunakan.
Hewan percobaan dan desain eksperimental
Mencit Swiss Albino jantan berumur 42 hari (30–32 g berat badan) diaklimatisasi selama 1 minggu sebelum memulai percobaan di ruangan (suhu sekitar 25 ± 2 derajat dan kelembaban ~ 50 persen, siklus gelap/terang 12 jam). Air minum dan makanan diberikan ad libitum.
Tikus secara acak dipisahkan menjadi delapan kelompok (n {{0}}). Kelompok pertama (kontrol) diperlakukan dengan 0.2 mL NaCl 0,9 persen. Empat kelompok berikutnya diobati dengan cisplatin pada 2,5 mg/kg selama 5 hari dengan interval 24 jam. Setelah pemberian cisplatin, satu kelompok (kelompok kedua) dibiarkan tanpa perlakuan lebih lanjut dan ditetapkan sebagai kelompok kontrol stres. Kelompok ketiga, keempat, dan kelima selanjutnya diobati dengan RVE pada 25, 50, dan 100 mg/kg, masing-masing selama 5 hari. Selanjutnya tiga kelompok diperlakukan dengan RVE hanya pada 25, 50, dan 100 mg/kg, masing-masing selama 5 hari. Cisplatin dan RVE dilarutkan dalam air suling. Semua perlakuan diberikan secara intraperitoneal. Setelah 24 jam perawatan terakhir, hewan di-eutanasia setelah dislokasi serviks [25]. Kemudian peritoneum dibuka dengan gunting, darah diambil setelah tusukan jantung, dan ginjal diambil dengan forsep. Darah menjadi sasaran untuk memeriksa tingkat kreatinin dalam serum. Ginjal menjadi sasaran evaluasi tingkat malondialdehid dan ekspresi gen.
Pengukuran kreatinin serum
Kreatinin serum diukur menggunakan Kreatinin Colorimetric Assay Kit-700,460 (Cayman Chemical, USA) mengikuti protokol pabrikan yang disediakan bersama kit.
Pengukuran peroksidasi lipid ginjal
Malondialdehid (MDA) adalah produk akhir peroksidasi lipid dalam jaringan ginjal dan biasanya diukur sebagai indikator produksi ROS. Namun, tingkat MDA diukur dalam jaringan ginjal menurut penelitian sebelumnya [27]. Mula-mula, jaringan ginjal dihomogenisasi dalam buffer natrium fosfat (0.1 M, pH 7.4). Larutan reaksi yang terdiri dari 0,8 persen asam tiobarbiturat (1,5 mL), 8,1 persen SDS (200 L), 20 persen (pH 3,5) asam asetat (1,5 mL), dan dH2O (600 L) ditambahkan ke 100 L jaringan homogen, dan campuran kemudian diinkubasi pada 95 derajat selama 1 jam. Setelah pendinginan, campuran disentrifugasi pada 10,000 g selama 10 menit pada 4 derajat dan absorbansi supernatan diukur pada 532 nm dengan standar 1, 1, 3, 3- tetra metoksi propana. Jumlah protein total diukur menggunakan Bradford Protein Assay kit (BIO-RAD, USA), dan membandingkannya dengan albumin serum sapi standar (BSA). Intensitas peroksida lipid diartikulasikan sebagai nanomol (nM) dari MDA per miligram (mg) protein.
Reaksi berantai polimerase waktu nyata (PCR waktu nyata)
PCR real-time dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [28, 29]. Total RNA dari jaringan ginjal diisolasi menggunakan reagen TRIzol® (Invitrogen) sesuai dengan protokol yang disediakan oleh pabrik. RNA yang diisolasi (1 ug) kemudian diubah menjadi cDNA. Pertama, 2 L heksamer acak (10 M), 2 L dNTPs (10 mM), 1 ug RNA, dan H O bebas nuklease hingga 15 L diambil dan diinkubasi selama 5 menit pada 70 derajat. Campuran itu langsung ditempatkan di atas es selama 2 menit. Kemudian ditambahkan 4 L buffer strand 1 (5x) dan 1 L M-MLV reverse transcriptase pada masing-masing tabung dan diinkubasi selama 10 menit dan 50 menit.
min pada 25 derajat dan 42 derajat , masing-masing. Akhirnya, enzim reverse-transcriptase M-MLV diinaktivasi dengan menginkubasi campuran pada suhu 95 derajat selama 5 menit. Produk cDNA yang disintesis menjadi sasaran PCR waktu nyata untuk kuantifikasi ekspresi gen NQO1, p53, dan Bcl-2 menggunakan primer spesifik (Tabel 1). Setiap reaksi (10 μL) dilakukan dalam rangkap tiga yang terdiri dari 5 L GoTaq qPCR Master Mix (2x) (Promega, USA), 0,5 L (10 mM) masing-masing primer, 3 L air bebas nuklease, dan 1 L cDNA dalam 48-pelat reaksi sumur. Siklus termal dilakukan menggunakan mesin PCR real-time (Eco™ Real-Time PCR System, Illumine®, USA) dengan kondisi siklus berikut: 95 derajat selama 10 menit, diikuti oleh 40 siklus 95 derajat selama 30 detik, 50 derajat selama 30 detik, dan 72 derajat selama 25 detik. Spesifisitas reaksi PCR dikonfirmasi dengan menganalisis kurva leleh pada 95 derajat selama 15 detik, 45 derajat selama 15 detik, dan 95 derajat selama 15 detik. Spesifisitas reaksi PCR dikonfirmasi dengan menganalisis kurva leleh pada 95 derajat selama 15 detik, 45 derajat selama 15 detik, dan 95 derajat selama 15 detik. Kuantifikasi relatif ekspresi gen dilakukan dengan menggunakan gen GAPDH endogen sebagai kontrol berdasarkan metode Cq.
Kultur dan pengobatan sel
Garis sel epitel tubulus proksimal ginjal manusia, sel HK-2, dipertahankan dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10 persen FBS dan antibiotik (50 U/mL penisilin dan 50 ug/mL streptomisin) dalam inkubator dengan 5 persen CO2 dan 95 persen kelembaban pada 37 derajat.
Uji pengukuran H2O2
Tingkat H2O2 dalam sel HK-2 diperkirakan dengan menggunakan ROS-Glo™ H2O2 Assay kit (Promega, USA) sesuai dengan protokol yang disediakan oleh produsen kit. Sel-sel HK-2 (1000 sel) dalam 70 L DMEM ditempatkan dalam sumuran pelat mikrotiter sumur 96-. Setelah memungkinkan perlekatan sel pada permukaan dinding, 10 L DMEM dari sumur pelat mikrotiter diganti dengan 10 L cisplatin (25 M dalam DMEM) dan disimpan dalam inkubator selama 12 jam. Kemudian, 10 L RVE ditambahkan untuk membuat konsentrasi akhir 125, 250, dan 500 ug/mL dalam DMEM dan diinkubasi lagi selama 12 jam. Setelah itu, 20 L H2O2 Substrate Solution dan 100 L ROS-Glo™ Detection Solution ditambahkan ke masing-masing sumur. Reaksi diinkubasi pada suhu kamar selama 20 menit. Akhirnya, luminesensi diukur dengan menggunakan GloMax Luminometer (Promega, USA).
Analisis GC-MS
Analisis GC-MS dari RVE (dilarutkan dalam metanol) dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [30] menggunakan GCMS- QP2020 (SHIMADZU) yang terdiri dari auto-sampler (AOC{ {5}}s), injektor otomatis (AOC-20i), dan Kromatografi Gas (GC-2010 Plus) yang dihubungkan ke Spektrometer Massa yang dilengkapi dengan SH-Rxi{{1{{ 37}}}}Kolom kapiler Sil MS (30 m × 0,25 m ID × 0,25 m DF). Gas pembawa Helium disimpan pada laju aliran konstan 1,72 mL/menit, dan volume injeksi 5 L menjadi sasaran dengan rasio split 10:1. Suhu injektor dipertahankan pada 220 derajat, suhu sumber ion adalah 280 derajat, suhu oven diprogram dari 80 derajat (tahan selama 2 menit), dengan peningkatan 5 derajat / menit hingga 150 derajat (waktu tahan 5.0 menit), kemudian 5 derajat / menit hingga 280 derajat , diakhiri dengan isotermal 8 menit pada 280 derajat . Spektrum massa diambil pada 1,5 kV dengan interval pemindaian 0,5 detik dan sampel dijalankan pada kisaran 45–350 m/z. Penundaan pelarut adalah dari 0 hingga 3 menit, dan total waktu berjalan GC-MS adalah 55 menit. Konsentrasi relatif senyawa yang terdeteksi diukur dengan membandingkan rata-rata luas puncaknya dengan luas total. Interpretasi spektrum massa dalam GC-MS dilakukan menggunakan database National Institute Standard and Technology (NIST) termasuk NIST08, NIST08s, dan NIST14.
Analisis statistik
Analisis statistik dilakukan dengan ANOVA mengikuti uji Dunnett's T3 menggunakan perangkat lunak IBM SPPS (versi 20). Data diartikulasikan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Perbandingan yang signifikan dipertimbangkan pada p<0.05. all="" of="" the="" graphs="" were="" prepared="" using="" microsoft="" excel="" (version="">
Hasil
Uji aktivitas antioksidan in-vitro
Meskipun sebelumnya RVE dilaporkan memiliki aktivitas antioksidan, kami memeriksa ulang aktivitas antioksidan ekstrak kami menggunakan kapasitas penangkal radikal bebas DPPH. RVE menetralkan DPPH dengan dosis yang tergantung (Gbr. 1). RVE mengungkapkan aktivitas antioksidan in vitro yang cukup besar dan nilai IC50 yang dihitung dari RVE adalah 37,39 ± 1,89 ug/mL.
Pengukuran kreatinin serum
Tingkat kreatinin serum pada tikus secara signifikan (p < {{0}}.05)="" meningkat="" setelah="" pemberian="" cisplatin="" (tabel="" 2).="" pengobatan="" dengan="" rve="" sangat="" (p=""><0,05) meningkatkan="" tingkat="" kreatinin="" dengan="" cara="" yang="" bergantung="" pada="" dosis="" (tabel="">
Pengukuran peroksidasi lipid ginjal
Dibandingkan dengan kontrol, cisplatin jauh (p < {{0}}.05)="" meningkatkan="" konten="" mda="" dalam="" jaringan="" ginjal="" tikus="" (tabel="" 3).="" sebaliknya,="" pengobatan="" rve="" secara="" signifikan="" (p=""><0,05) mengembalikan="" mda="" menjadi="" hampir="" normal="" dengan="" cara="" yang="" bergantung="" pada="" dosis="" (tabel="">
PCR waktu nyata
Cisplatin secara signifikan (p < {{0}}.05)="" menurunkan="" ekspresi="" mrna="" nqo1="" sebesar="" 0.15-lipat="" dan="" meningkatkan="" p53="" dan="" bcl-2="" mrna="" ekspresi="" oleh="" 24="" dan="" 4.2-kali="" lipat,="" masing-masing="" (gbr.="" 2).="" rve="" secara="" signifikan="" (p="">< 0.05)="" mengurangi="" ekspresi="" mrna="" nqo1,="" p53,="" dan="" bcl-2="" dengan="" cara="" yang="" bergantung="" pada="" dosis="" (gbr.="" 2).="" dibandingkan="" dengan="" satu-satunya="" kelompok="" yang="" diobati="" dengan="" cisplatin,="" ekspresi="" mrna="" nqo1="" meningkat="" sebesar="" 3,57,="" 6,36,="" dan="" 9,28-kali="" lipat="" pada="" 25,="" 50,="" dan="" 100="" mg/kg="" rve,="" masing-masing="" (gbr.="" 2a).="" sekali="" lagi,="" ekspresi="" mrna="" p53="" berkurang="" 0.63,="" 0.46,="" dan="" 0.21-kali="" lipat="" pada="" 25,="" 50,="" dan="" 100="" mg/kg="" rve,="" masing-masing="" (gbr.="" 2b).="" ekspresi="" mrna="" bcl-2="" juga="" berkurang="" sebesar="" 0,71,="" 0,40,="" dan="" 0,32-kali="" lipat="" pada="" masing-masing="" 25,="" 50,="" dan="" 100="" mg/kg="" rve="" (gbr.="" 2c).="" namun,="" tidak="" ada="" perubahan="" signifikan="" (p=""> 0,05) yang ditemukan pada tingkat ekspresi gen NQO1, p53, dan Bcl-2 karena pengobatan dengan RVE (Gbr. 3).
H2O2uji pengukuran
Dalam uji pengukuran H2O2, H2O2tingkat dianggap proporsional dengan luminescence. Pemberian cisplatin secara signifikan (p < {{{0}}.05)="" meningkatkan="" kadar="" h2o2="" sebesar="" 2,2-kali="" lipat="" (gbr.="" 4).="" perlakuan="" dengan="" rve="" sangat="" menurun="" (p="">< 0.05)="" kadar="" h2o2="" sebesar="" 0,25,="" 0,38,="" dan="" 0,49-kali="" lipat="" pada="" 125,="" 250,="" dan="" 500="">
Analisis GC-MS
Sebanyak 10 senyawa (Tabel 4 dan Gambar. 5) termasuk "Isoborneol, pentamethyldisilanyl ether (sesquiterpene alcohol)", "Thymine (pyrimidine nucleobase)", "4H-Pyran-4-one, 2,{{ 8}}dihidro-3,5-dihidroksi-6-metil- (saponin)", "Asam heksadekanoat, metil ester (asam lemak metil ester)", "9,12- Asam oktadecadienoat, metil ester (asam lemak metil ester)", "9-Asam oktadecenoat (Z)-, metil ester (asam lemak metil ester)", "Metil stearat (asam lemak metil ester)", "Diisooctyl phthalate (ester)", "13-Docosenamide, (Z)- (alkaloid)", dan "Squalene (triterpene)" terdeteksi di RVE.
manfaat cistanche tubolosa: menurunkan lipid darah
Diskusi
Antioksidan alami dan sintetis telah dipelajari secara komprehensif dan terbukti berfungsi baik untuk pencegahan atau perbaikan toksisitas pada fisiologi hewan [31]. Suplemen antioksidan adalah komponen yang dikembangkan baik oleh sintesis kimia atau ekstraksi dari makanan alami tetapi komposisinya tidak identik dengan antioksidan yang tersedia dalam makanan [5]. Oleh karena itu, pendapat terpisah dari waktu ke waktu apakah antioksidan sintetik memberikan manfaat kesehatan yang sama dengan antioksidan alami [32]. Muncul desakan untuk mengurangi penggunaan suplemen antioksidan sintetik dan mencari sumber antioksidan alami yang efektif, murah, terbarukan, alami, dan mungkin lebih aman.
Salah satu mekanisme yang paling penting adalah faktor inti eritroid-2 terkait faktor-2 (Nrf2) jalur yang umumnya melindungi sel dari stres oksidatif yang disebabkan oleh stres eksogen atau endogen [27]. Antioksidan yang efektif menginduksi ekspresi Nrf2, yang selanjutnya bergerak ke dalam nukleus dan mengikat elemen respon antioksidan (ARE) yang memicu ekspresi gen detoksifikasi fase II dan antioksidan NQO1 [33, 34]. NQO1 diekspresikan secara luas dan berbeda dalam cara spesifik jaringan. NQO1 adalah flavoprotein antioksidan sitosol yang mengkatalisis 2-reduksi elektron kuinon menjadi hidrokuinon, menghasilkan detoksifikasi elektrofil dan antisipasi siklus redoks [35]. Menurut penelitian sebelumnya [36], -lapachone mengaktifkan NQO1, yang selanjutnya meningkatkan tingkat NAD plus intraseluler dan melindungi ginjal dari cedera akut yang diinduksi cisplatin.
Cisplatin diketahui menginduksi kerusakan pada membran filtrasi glomerulus melalui stres oksidatif, peradangan, dan apoptosis yang semuanya menyebabkan penurunan laju filtrasi glomerulus dan hilangnya permeabilitas membran normal [37]. Oleh karena itu, kadar kreatinin serum meningkat. Kreatinin serum adalah salah satu penanda fungsi ginjal yang potensial. Pengobatan cisplatin meningkatkan kandungan MDA dalam jaringan ginjal yang merupakan produk sekunder dari peroksidasi lipid dan laporan ini konsisten dengan penelitian sebelumnya [27, 35, 37, 38]. Pengobatan dengan RVE secara signifikan mengurangi kandungan MDA dalam jaringan ginjal. Pada saat yang sama, tingkat kreatinin juga menurun menunjukkan efek perbaikan dari RVE.
Selain itu, ekspresi NQO1 menurun secara signifikan, dan ekspresi p53 dan Bcl-2 meningkat secara signifikan setelah terpapar cisplatin. Dalam hal ekspresi NQO1 dan p53 in vivo, hasil kami konsisten dengan penelitian sebelumnya [13]. Sebuah studi baru-baru ini [39] menunjukkan bahwa cisplatin secara signifikan menurunkan ekspresi Bcl-2 di ginjal tikus, tetapi secara mengejutkan kami menemukan peningkatan ekspresi. Perbedaan ini mungkin akibat dari perbedaan dosis [40] karena Mohamed dan rekan [39] menggunakan 8 mg/kg selama 12 hari, sedangkan kami menggunakan 2,5 mg/kg hanya selama 5 hari. Studi lain [41] menyatakan bahwa cisplatin dapat meningkatkan ekspresi Bcl-2 pada dosis non-sitotoksik. Sekali lagi, peningkatan ekspresi Bcl-2 membuat sel peka terhadap stres oksidatif [40].
Namun, ekspresi p53 rendah pada kondisi fisiologis normal tetapi diharapkan akan meningkat setelah diobati dengan cisplatin karena agen kemoterapi berbasis platinum ini mengaktifkan jalur apoptosis yang bergantung pada p53. Setelah kami merawat tikus dengan cisplatin, p53 meningkat secara signifikan pada ginjal tikus dibandingkan dengan kontrol. Proto-onkogen lain Bcl-2 juga berkorelasi dengan tingkat ekspresi NQO1. Meniru ekspresi p53, kami juga menemukan bahwa kadar Bcl- 2 meningkat dengan pengobatan cisplatin, tetapi pulih kembali secara signifikan setelah pengobatan dengan RVE. Hal ini dimungkinkan, sebagai respons terhadap stres oksidatif, gen p53 teraktivasi dan menghasilkan penghentian siklus sel, penuaan, atau apoptosis [6]. Dengan detoksifikasi, ekspresi berlebih NQO1 sering dianggap berkorelasi dengan apoptosis pada sel kanker [10], meskipun mekanisme yang mendasari apoptosis dan ekspresi berlebih NQO1 masih kontroversial. Selain itu, pada karsinoma hepatoseluler, ekspresi berlebih NQO1 menurunkan ekspresi Bcl-2 [10]. Proto-onkogen Bcl- 2 juga memiliki p53 seperti korelasi dengan ekspresi NQO1. p53 adalah faktor transkripsi spesifik urutan yang diaktifkan oleh berbagai jenis stres seluler [42], sedangkan ekspresi berlebih Bcl-2 bertindak sebagai penstabil pori mitokondria untuk memfasilitasi pelepasan sitokrom-c pada stres oksidatif [12]. Dalam kasus kami, kami memeriksa kedua respons gen dengan pengobatan cisplatin di jaringan ginjal normal dan menemukan peningkatan ekspresinya. Perawatan RVE mengembalikan ekspresi p53 dan Bcl-2 menjadi hampir normal dengan cara yang bergantung pada dosis. Jenis pembatalan ekspresi Bcl-2 ini juga ditunjukkan menggunakan ROS scavenger Trolox [43]. Selain itu, tingkat H2O2 juga meningkat secara nyata pada sel HK-2 karena pengobatan dengan cisplatin in vitro. Setelah pengobatan dengan RVE, tingkat H2O2 secara signifikan dikembalikan ke sekitar normal. Ini mungkin karena efek pengobatan RVE yang meningkatkan ekspresi NQO1 [44], yang memberikan perlindungan terhadap stres oksidatif [6].
Kromatogram GC-MS mengkonfirmasi keberadaan sepuluh senyawa dalam RVE. Di antaranya, "4H-Pyran- 4-satu, 2, 3-dihidro-3,5-dihidroksi-6-metil-", "Asam heksadekanoat", dan " Squalene" adalah antioksidan terkenal[45-47]. Ketiga senyawa ini secara keseluruhan mungkin memberikan efek nefroprotektif yang sinergis. Penelitian sebelumnya juga melaporkan tentang induksi ekspresi NQO1 oleh vitamin A [48], vitamin C [49], vitamin E [50], flavonoid [51], dan polifenol [50]. Oleh karena itu, laporan ini menyarankan untuk menjelaskan apakah ekstrak khusus ini mengandung vitamin A, vitamin C, vitamin E, flavonoid, dan polifenol, atau tidak.
Kesimpulan
Temuan keseluruhan menunjukkan bahwa RVE secara fisiologis efektif dalam melindungi ginjal dari kerusakan akibat cisplatin. Oleh karena itu, sangat penting untuk menjelaskan senyawa yang tepat yang bertanggung jawab untuk mengurangi nefrotoksisitas yang diinduksi cisplatin yang mungkin bermanfaat untuk aplikasi pada manusia.
Ucapan Terima Kasih
Para penulis berterima kasih kepada Dewan Penelitian Ilmiah dan Industri Bangladesh (BCSIR), Cabang Rajshahi karena memberikan dukungan laboratorium untuk mengukur RNA.
Kontribusi penulis
MMH melakukan desain eksperimental, eksperimen, analisis dan persiapan data, penulisan dan pengeditan naskah, revisi dan penyusunan naskah; MST & MME melakukan eksperimen dan analisis data; AME & MAR berkontribusi dalam pengawasan dan sumber daya; AH bertanggung jawab atas konseptualisasi, pengawasan, sumber daya, dan penyuntingan naskah. Semua penulis
meninjau naskah. Para penulis membaca dan menyetujui naskah akhir.
Pendanaan
Pekerjaan saat ini didanai oleh nomor Proyek Pendukung Peneliti Universitas Taif (TURSP - 2020/75), Universitas Taif, Taif, Arab Saudi.
Ketersediaan data dan bahan.
Semua data yang relevan tersedia dan dapat diberikan berdasarkan permintaan kepada penulis terkait.
Deklarasi
Persetujuan etika dan persetujuan untuk berpartisipasi
Etika untuk melakukan eksperimen ini telah disetujui oleh Institutional Animal, Medical Ethics, Biosafety, and Biosecurity Committee (IAMEBBC), Institute of Biological Sciences (IBSc), University of Rajshahi, dan diberikan di bawah nomor memo 31/{{1} }IAMEBBC/IBSc. Semua metode dilakukan sesuai pedoman dan peraturan yang diberikan oleh komite etik yang disebutkan di atas. Penelitian ini dilakukan sesuai dengan pedoman ARRIVE (Penelitian Hewan: Pelaporan Eksperimen In Vivo). "Persetujuan untuk berpartisipasi" tidak berlaku untuk penelitian ini.
Detail Penulis
1Laboratorium Biologi Molekuler dan Ilmu Protein, Departemen Rekayasa Genetika dan Bioteknologi, Fakultas Ilmu Hayati dan Bumi, Universitas Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladesh. 2Laboratorium Patologi Molekuler, Institut Ilmu Biologi, Universitas Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladesh. 3Department of Biotechnology, College of Science, Taif University, PO Box 11099, Taif 21944, Saudi Arabia. 4Jurusan Genetika, Fakultas Pertanian, Universitas Alexandria, Alexandria 21545, Mesir.
Referensi
1. Bagchi K, Puri S. Radikal bebas dan antioksidan dalam kesehatan dan penyakit: ulasan. Kesehatan Mediterr Timur J. 1998; 4:350–60.
2. Koh EM, Lee EK, Lagu CH, Lagu J, Chung HY, Chae CH, dkk. Ferulate, komponen aktif dari bibit gandum, memperbaiki ketidakseimbangan PTK/PTP yang diinduksi stres oksidatif dan inaktivasi PP2A. Toksikol Res. 2018;34(4):333–41.
3. Hassan AI, Ibrahim RY. Beberapa profil genetik di hati Ehrlich menyebabkan tikus yang mengandung tumor di bawah tekanan iradiasi. J Radiat Res Appl Sci. 2014;7(2):188–97.
4. Zhou FL, Zhang WG, Wei YC, Meng S, Bai GG, Wang BY, dkk. Keterlibatan stres oksidatif dalam kekambuhan leukemia myeloid akut. J Biol Chem. 2010;285(20):15010–5.
5. Pham-Huy LA, He H, Pham-Huy C. Radikal bebas, antioksidan dalam penyakit dan kesehatan. Int J Biomed Sci. 2008;4:89–96.
6. Srijiwangsa P, Na-Bangchang K. Peran NAD (P) H-quinone oxidoreductase 1 (NQO1) pada perkembangan kanker dan kemoresistensi. J Clin Exp Oncol. 2017;6:1–6.
7. Siegel D, Yan C, Ross D. NAD (P) H: kuinon oksidoreduktase 1 (NQO1) dalam sensitivitas dan ketahanan terhadap kuinon antitumor. Biokimia Farmakol. 2012;83(8):1033–40.
8. Dinkova-Kostova AT, Talalay P. NAD (P) H: quinone acceptor oxidoreductase 1 (NQO1), enzim antioksidan multifungsi dan sitoproteksi yang sangat serbaguna. Arch Biochem Biophys. 2010;501(1):116–23.
9. Cullen JJ, Hinkhouse MM, Grady M, Gaut AW, Liu J, Zhang YP, dkk. Penghambatan dicumarol NADPH: quinone oxidoreductase menginduksi penghambatan pertumbuhan kanker pankreas melalui mekanisme yang dimediasi superoksida. Kanker Res. 2003;63(17):5513–20.
10. Zhang X, Han K, Yuan DH, Meng CY. Ekspresi berlebih dari NAD (P) H: quinone oxidoreductase 1 menghambat proliferasi sel karsinoma hepatoseluler dan menginduksi apoptosis dengan mengaktifkan jalur AMPK/PGC-1. Biol Sel DNA. 2017;36(4):256–63.
11. Zeekpudsa P, Kukongviriyapan V, Senggunprai L, Sripa B, Prawan A. Penekanan NAD (P) H-quinone oxidoreductase 1 meningkatkan kerentanan sel cholangiocarcinoma terhadap agen kemoterapi. J Exp Klinik Kanker Res. 2014;33(1):1– 13.
12. Dasari S, Tchounwou PB. Cisplatin dalam terapi kanker: mekanisme aksi molekuler. Eur J Pharmacol. 2014;740:364–78.
13. Zhu X, Jiang X, Li A, Zhao Z, Li S. S-Allylmercaptocysteine melemahkan nefrotoksisitas yang diinduksi cisplatin melalui penekanan apoptosis, stres oksidatif, dan peradangan. Nutrisi. 2017;9(2):166.
14. Matkowski A. Tanam kultur in vitro untuk produksi antioksidan—sebuah tinjauan. Bioteknologi Adv. 2008;26(6)::548–60.
15. El-Bakry AA, Mostafa HAM, Alam EA. Aktivitas antioksidan Rumex vicarious L. pada fase pertumbuhan vegetatif. Asian J Pharm Clin Res. 2012;5:111–7.
16. Rechinger KH. Rumex (Polygonaceae) di Australia: pertimbangan ulang. Nuytsia. 1984; 5:75– 122.
17. Shahat AA, Alsaid MS, Alyahya MA, Higgins M, Dinkova-Kostova AT. NAD (P) H: aktivitas penginduksi kuinon oksidoreduktase 1 dari beberapa tanaman obat Arab Saudi. Planta Med. 2013;79(06):459–64.
18. El-Hawary SA, Sokkar NM, Ali ZY, Yehia MM. Profil senyawa bioaktif Rumex vicarious L. J Food Sci. 2011;76(8): C1195–202.
19. Barbosa-Filho JM, Alencar AA, Nunes XP, Tomaz AC, Sena-Filho JG, Athayde-Filho PF, dkk. Sumber alfa-, beta-, gamma-, delta-dan epsilon- karoten: tinjauan abad kedua puluh. Rev Bra. 2008;18(1):135–54.
20. Laouini SE, Ouahrani MR. Skrining fitokimia, antioksidan in vitro dan aktivitas antibakteri ekstrak Rumex vicarious L.. Studi Sains Res: Chem Chem Engi Biotech Food Ind. 2017;18:367–76.
