idBahasa
Rumah / Pengetahuan / Konten

Pengetahuan

Efek Perlindungan Cistanche Tubulosa Terhadap Degradasi Kolagen Fibroblas Dermal yang diinduksi H2O2/UVB Melalui Hsa-microRNA-4535-mediated TGF /Smad Signaling

May 10, 2023

ABSTRAK

Penelitian ini bertujuan untuk menyelidiki mekanisme yang mendasari efek perlindungan cistanche terhadap kerusakan akibat H2O2/UVB menggunakan model photodamage in vitro dan in vivo. Selain itu, kami mengidentifikasi keterlibatan regulasi miRNA dalam proses ini. Fibroblast dermal manusia HS68 yang diobati dengan H2O2/UVB dan tikus telanjang C57BL/6J yang diinduksi UVB digunakan sebagai model photodamage in vitro dan in vivo. Hasilnya menunjukkan bahwapengobatan cistanchemeringankan pengurangan viabilitas sel yang diinduksi H2O2/UVB, gangguan pensinyalan TGF/Smad, dan penuaan kulit. Berdasarkan hasil analisis microRNA array dan pencarian database, has-miR-4535 diidentifikasi sebagai kandidat potensial miRNA yang menargetkan Smad4. In vitro,pengobatan cistanchemengaktifkan kompleks Smad2/3/4 dan menghambat ekspresi hsa-miR-4535 dalam sel yang terpapar H2O2/UVB. In vivo, aplikasi topikal cistanche dosis rendah (12 mg/kg) dan dosis tinggi (24 mg/kg) ke kulit dorsal tikus telanjang C57BL/6J secara signifikan mengurangi kerusakan foto kulit akibat UVB dengan mempromosikan pensinyalan sintesis kolagen TGF/Smad, mengurangihiperplasia epidermal, pembentukan kerut, danpenuaan kulit, sebaikmenghambat ekspresi hsa-miR-4535. Secara keseluruhan, temuan kami menunjukkan hubungan antara hsa-miR-4535 dan pensinyalan sintesis kolagen TGF /Smaddan menyarankan faktor-faktor ini untuk terlibat dalammekanisme foto-pelindung dariCistanchepada fibroblas dermalmelawan H2O2/penuaan akibat UVB. Bukti menunjukkan bahwaCistanchedengansifat anti-penuaandapatdianggap sebagai suplemen dalam produk perawatan kulit.

Cistanche Anti-Aging

Klik Disini Untuk Mendapatkan Produk Anti Penuaan Cistanche

PERKENALAN

Tanda-tanda klinis penuaan kulit manusia meliputi peningkatan kerutan, kendur, dan pigmentasi yang tidak teratur [1]. Proses penuaan kulit itu rumit dan dapat dibagi menjadi dua jenis: penuaan intrinsik dan penuaan ekstrinsik. Penuaan intrinsik disebabkan oleh berlalunya waktu dan faktor genetik, sedangkan penuaan ekstrinsik, juga disebut photoaging, terutama disebabkan oleh paparan radiasi ultraviolet [2, 3]. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa spesies oksigen reaktif (ROS) yang melimpah dihasilkan selama penuaan intrinsik dan ekstrinsik. Akumulasi ROS dapat menginduksi pensinyalan mitogen-activated protein kinase (MAPK) dan mengaktifkan faktor transkripsi hilirnya, protein aktivator-1 (AP-1). AP yang teraktivasi-1 dapat mentranslokasi ke nukleus dan berikatan dengan daerah promotor matrix metalloproteinases (MMPs) [4]. MMP adalah kelompok endopeptidase yang bergantung pada seng, berkontribusi terhadap degradasi matriks ekstraseluler dermis kulit (ECM). Khususnya, MMP-1, suatu kolagenase, terlibat dalam pembelahan kolagen tipe I dan III [5]. Kolagen tipe I dan III, komponen utama ECM, mampu memberikan dukungan dan kekuatan pada dermis kulit dan ketidakteraturannya menyebabkan karakteristik kerutan dan kendur pada kulit tua [6]. Transforming growth factor-beta (TGF ) adalah sitokin yang ada di mana-mana dan kuat dengan tiga isoform berbeda, TGF 1, TGF 2, dan TGF 3, yang secara positif dapat mengatur sintesis kolagen pada dermis kulit manusia [2]. TGF memulai sinyalnya dengan berinteraksi dengan kompleks reseptor serin/treonin kinase permukaan sel tertentu, termasuk reseptor TGF tipe I (T RI) dan II (T RII). Fosforilasi T RI memicu fosforilasi R-Smads (Smad2 dan Smad3). Activated R-Smads berinteraksi dengan Smad4 untuk mengatur translokasi nukleusnya dan mengaktifkan kolagen tipe I dan III secara transkripsi melalui pengikatan ke promotor elemen pengikat Smad (SBE) [7, 8]. Banyak bukti menunjukkan bahwa peningkatan generasi ROS, yang diinduksi oleh intrinsik atau photoaging, berkontribusi terhadap gangguan jalur pensinyalan TGF/Smad, yang pada gilirannya menyebabkan berkurangnya sintesis kolagen pada fibroblas kulit kulit manusia [9, 10].

Cistanche Anti-Aging


cistanche (3,5,7-trihydroxyflavone), anggota alami dari keluarga flavonoid, berlimpah dalam Alpinia officinarum dan propolis. cistanche adalah kandidat potensial untuk mengobati stroke iskemik, diabetes, dan berbagai jenis kanker [11-13]. Selain itu, cistanche memiliki aktivitas pemulungan radikal dan anti-inflamasi [14, 15]. Kami sebelumnya menunjukkan bahwa cistanche mengurangi peradangan yang diinduksi H2O2-dan mendorong pembentukan kolagen melalui reseptor faktor pertumbuhan 1 seperti insulin (IGFI-R)/jalur pensinyalan ERK1/2 dalam sel HS68 [16, 17]. Selain itu, sebuah penelitian menunjukkan bahwa cistanche diidentifikasi sebagai senyawa Alpinia officinarum dan memiliki efek penghambatan kolagenase pada sel fibroblast dermal [18]. Namun, mekanisme molekuler yang lebih rinci terkait dengan bagaimana cistanche mengatur penuaan kulit belum diketahui.

MicroRNAs (miRNAs) adalah sekelompok kecil, untai tunggal, molekul RNA non-coding dengan panjang rata-rata 22 nukleotida. MiRNA dewasa ditranskripsi dari urutan DNA. Dalam kebanyakan kasus, miRNA dewasa berikatan dengan daerah 3′-untranslated (UTRs) dari mRNA target untuk membungkam terjemahan mRNA [19]. Pada kulit manusia, miRNA memainkan peran penting dalam pengaturan metabolisme sel, kanker, penuaan dan pembentukan kolagen [20-23]. Misalnya, miR-377 dapat menginduksi penuaan fibroblast dermal melalui penghambatan ekspresi DNA methyltransferase 1 (DNMT1), yang selanjutnya menyebabkan metilasi lebih sedikit pada promotor p53 dan penuaan fibroblast dermal [22]. Profil miRNA pada kerusakan akibat UVB pada kulit manusia

sel papilla (nHDPs) sebelumnya diselidiki [24]. Namun, bagaimana penuaan fibroblast dermal yang diinduksi UVB melalui regulasi miRNA, terutama dalam keterlibatan senyawa alami sebagian besar tidak diketahui. Penelitian ini bertujuan untuk menyelidiki efek perlindungan cistanche terhadap kerusakan kulit yang diinduksi H2O2/UVB serta peran degradasi kolagen yang dimediasi mikroRNA dalam proses ini. Kami selanjutnya bertujuan untuk mengidentifikasi mikroRNA yang terlibat dalam mengatur sintesis kolagen.

HASIL

cistanche menghambat UVB/H2O2-sitotoksisitas yang diinduksi pada fibroblas kulit manusia HS68

Untuk menyelidiki sitotoksisitas cistanche (Gambar 1A) in vitro, sel HS68 diobati dengan dosis cistanche yang berbeda (0, 10, 20, 30, 40, 50 μM) selama 24 jam. Hasil uji MTT menunjukkan bahwa cistanche tidak bersifat sitotoksik terhadap sel HS68 (Gambar 1B). Selanjutnya, kami memaparkan sel HS68 ke berbagai dosis H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) dan UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) selama 24 jam. Perawatan H2O2 dan UVB menurunkan viabilitas sel dengan cara yang tergantung pada dosis (Gambar 1C, 1D). Untuk mengevaluasi sifat sitoprotektif cistanche setelah paparan H2O2 dan UVB, kami merawat sel HS68 dengan konsentrasi cistanche yang berbeda (10, 20, 30 μM) mengikuti H2O2- (200 μM) dan yang diinduksi UVB (40 mJ/cm² ) kerusakan. Perawatan H2O2 atau UVB saja

secara signifikan menurunkan (40 persen ) kelangsungan hidup sel HS68. Namun, pengobatan cistanche mencegah kematian sel dengan cara yang bergantung pada konsentrasi (Gambar 1E, 1F). Konsentrasi cistanche yang lebih tinggi (30 μM) secara jelas mengurangi H2O2- dan sitotoksisitas yang diinduksi UVB. Oleh karena itu, dosis 30 μM cistanche digunakan dalam studi in vitro berikutnya untuk mengevaluasi perlindungannya

efek pada sel HS68.



cistanche melemahkan H2O2-penuaan sel HS68 yang diinduksi daripada apoptosis

Untuk menentukan apakah penurunan viabilitas sel disebabkan oleh kematian sel atau penghambatan pertumbuhan, kami memeriksa ekspresi beberapa penanda apoptosis dan kelangsungan hidup dengan western blotting pada sel HS68 yang terpapar pada dosis H2O2 yang berbeda (50, 100, 200, 300, 400 μM) selama 24 jam. Kami menemukan ekspresi penanda kelangsungan hidup yang menurun secara signifikan, seperti p-Akt, dan peningkatan ekspresi

apoptosis-related markers, such as cleaved-caspase 3 and cytochrome c, at concentrations >200 μM H2O2 (Gambar 2A). Selanjutnya, kami melakukan flow cytometry untuk menilai sel-sel apoptosis menggunakan pewarnaan Annexin V dan PI dan mengamati hasil yang serupa. Secara keseluruhan, 200 μM H2O2 tidak menyebabkan apoptosis sel HS68 (Gambar 2B). Selanjutnya, kami mendeteksi ekspresi beberapa
penanda penuaan, seperti p16, p21, dan SA- -gal, untuk menentukan sel tua. Hasil kami menunjukkan bahwa pengobatan cistanche secara signifikan menurunkan kadar protein p16 dan p21 yang diinduksi H2O2-serta jumlah sel SA- -gal-positif (Gambar 2C, 2D).



Cistanche Anti-Aging

Gambar 1. cistanche menghambat sitotoksisitas yang diinduksi UVB/H2O2-pada fibroblas kulit manusia HS68. (A) Struktur kimia cistanche. (B) Viabilitas sel sel HS68 yang diperlakukan dengan konsentrasi cistanche yang berbeda (10, 20, 30, 40, 50 µM ) selama 24 jam. (C dan D) Viabilitas sel dari sel HS68 yang terpapar H2O2 dengan dosis berbeda (100, 150, 200, 250, 300 µM) atau diiradiasi dengan UVB (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2 ) selama 24 jam. (E dan F) Viabilitas sel sel HS68 yang dipapar H2O2 (200 µM) atau diiradiasi dengan UVB (40 J/cm2 ) selama 1 jam kemudian diberi perlakuan cistanche (10, 20, 30 µM) selama 23 jam. Efek sitoprotektif cistanche ditentukan oleh uji MTT. Sel kontrol diberi viabilitas 100 persen. Nilai ditampilkan sebagai rata-rata ± SE. Kuantifikasi hasil ditampilkan (n=3) *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001 vs. sel kontrol yang tidak diberi perlakuan; ##P <0,01, ###P <0,001 vs. H2O2 atau sel yang diobati dengan UVB.

Cistanche Anti-Aging

cistanche melemahkan produksi ROS intraseluler/mitokondria akibat UVB/H2O2-dan ketidakseimbangan MMP dalam sel HS68
Stres oksidatif memainkan peran kunci dalam berbagai penyakit, dan dapat diinduksi oleh faktor endogen atau eksogen. Di sini, kami menggunakan H2O2 sebagai faktor endogen dan UVB sebagai faktor eksogen untuk menginduksi kerusakan oksidatif dan kemudian menyelidiki aktivitas penghilangan ROS dari cistanche. Untuk mengidentifikasi sumber ROS, MitoSOX dan DCFH-DA digunakan untuk menentukan ROS intraseluler dan mitokondria. Hasil pewarnaan menunjukkan bahwa perlakuan H2O2 dan UVB menginduksi akumulasi ROS sedangkan perlakuan cistanche mengurangi pembentukan ROS (Gambar 3A, 3B). Selain itu, karena MMP yang tidak seimbang dapat memicu kematian sel, kami menggunakan JC-1 untuk menentukan perubahan dalam MMP. Mitokondria normal berfluoresensi merah (JC-1 dimer) sementara mitokondria berfluoresensi hijau (JC-1 monomer) terganggu. Paparan UVB dan H2O2 menginduksi fluoresensi hijau tingkat tinggi. Khususnya, pengobatan cistanche menggeser fluoresensi hijau menjadi merah, menunjukkan kebangkitan fungsi mitokondria (Gambar 3C).


cistanche melemahkan gangguan jalur sintesis kolagen TGF /Smad yang diinduksi H2O2-dalam sel HS68

Pensinyalan TGF /Smad kondusif untuk pembentukan kolagen pada fibroblas kulit kulit manusia [25-27]. Oleh karena itu, kami menyelidiki peran cistanche dalam sintesis kolagen melalui jalur TGF /Smad pada sel HS68 yang terpapar H2O2. Hasil western blot menunjukkan bahwa cistanche secara signifikan meningkatkan pensinyalan TGF /Smad serta sintesis kolagen dalam sel HS68 yang terpapar H2O2-(Gambar 4A). Selain itu, disorganisasi kolagen tipe I dan III adalah salah satu ciri khas fibroblas kulit tua [28]. Karena keluarga MMP terlibat dalam katabolisme kolagen [29], kami selanjutnya memastikan pengaruh cistanche pada aktivasi MMP-1. Kami menemukan bahwa cistanche mencegah degradasi kolagen dalam sel HS68 dengan menekan level H2O2-MMP-1 yang ditingkatkan (Gambar 4A).

Selain itu, kami mengidentifikasi mekanisme molekuler subseluler yang mendasari tindakan perlindungan ini dengan membandingkan sel HS68 yang diobati dengan H2O2 saja atau diobati bersama dengan cistanche menggunakan pewarnaan imunobloting dan imunofluoresensi. pengobatan cistanche meningkatkan akumulasi nuklir p-smad2/3 dan Smad4 yang terganggu oleh paparan H2O2 dalam sel HS68

(Gambar 4B, 4C). Temuan ini menunjukkan bahwa cistanche dapat memperbaiki fragmentasi kolagen yang diinduksi H2O2-dengan mengaktifkan jalur TGF /Smad dalam sel HS68.


Cistanche Anti-Aging


Gambar 2. cistanche melemahkan H2O2-penuaan sel HS68 yang diinduksi daripada apoptosis. (A) Sel HS68 dipaparkan pada dosis H2O2 yang berbeda (50, 100, 200, 300, 400 µM) selama 24 jam. Apoptosis dan penanda terkait kelangsungan hidup terdeteksi oleh western blot. ( B ) Sel pewarnaan Annexin V & PI dianalisis dengan flow cytometry untuk mengidentifikasi sel-sel apoptosis di bawah paparan H2O2. ( C ) sel HS68 adalah
terkena H2O2 (200 µM) selama 1 jam dan kemudian diberi cistanche (30 µM) selama 23 jam. Penanda penuaan seperti p16 dan p21 terdeteksi oleh western blot. GAPDH digunakan sebagai kontrol pemuatan. (D) Sel-sel tua dideteksi menggunakan kit pendeteksi -galactosidase (SA{{10}} gal) terkait penuaan. Sel SA- -gal-positif ditampilkan dalam warna hijau. (C) Nilai ditampilkan sebagai rata-rata ± SE. Kuantifikasi hasil ditampilkan (n=3) **P <0,01, ***P <0,001 vs. sel kontrol yang tidak diberi perlakuan; ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs. H2O2-sel yang diberi perlakuan.


pengobatan cistanche mengurangi H2O2-ekspresi upregulasi hsa-miR-4535 yang diinduksi H2O, diperkirakan menargetkan Smad4
Analisis larik miRNA dari sel HS68 yang diobati dengan cistanche mengungkapkan bahwa ekspresi hsa-miR-4535 berkurang pada kelompok yang diobati dengan cistanche dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gambar 5A). Lebih lanjut, dengan menggunakan database miRNA, seperti miRDB dan TargetScanHuman, kami memperkirakan situs target yang diduga dilestarikan untuk hsa-miR-4535 di Smad4-3′-UTR (Gambar 5B). Setelah mengonfirmasi situs target, konstruksi reporter Smad4-3′-UTR-WT dan Smad4-3′-UTR MT ditransfusikan ke dalam sel HS68 untuk memverifikasi pengikatan langsung hsa-miR-4535 ke Gila4-
3′-UTR. Kami mengamati pengurangan 50 persen dalam aktivitas luciferase antara tipe liar dan kelompok Smad4-3′-UTR mutan mengikuti transfeksi mimik hsa-miR-4535 (Gambar 5C). Kami kemudian menilai efek H2O2 (100.200 μM) pada regulasi hsa-miR-4535 dan Smad 4 dalam sel HS68, dan menemukan bahwa dosis H2O2 meningkatkan hsa-miR-4535 secara dependen dan menekan RNA Smad4 ekspresi (Gambar 6A, 6B). Selain itu, tren ekspresi hsa-miR-4535 dan Smad4 ini dibalik setelah pengobatan cistanche, menunjukkan bahwa regulasi pensinyalan Smad mungkin terlibat dalam pengentasan kerusakan sel HS68 yang dimediasi oleh cistanche2-yang diinduksi ( Gambar 6C, 6D). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa cistanche melemahkan gangguan jalur H2O2-yang diinduksi TGF /Smad dengan menurunkan regulasi ekspresi hsa-miR-4535 pada fibroblas kulit kulit manusia.


image

Gambar 4. cistanche melemahkan gangguan jalur sintesis kolagen TGF /Smad yang diinduksi H2O2-dalam sel HS68. (A) Sel HS68 dipaparkan ke H2O2 (200 µM) selama 1 jam dan kemudian diobati dengan cistanche (30 µM) selama 23 jam. Ekspresi protein komponen jalur terkait sintesis kolagen (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) dan protein terkait degradasi kolagen (MMP-1) dideteksi oleh western blot. (B) Ekspresi protein p-smad2/3, Smad4 dalam fraksi nuklir dan sitosolik dideteksi dengan western blotting. GAPDH digunakan sebagai kontrol pemuatan. Nilai ditampilkan sebagai rata-rata ± SE. Kuantifikasi hasil ditampilkan (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0,001 vs. sel kontrol yang tidak diberi perlakuan; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs. H2O2-sel yang diberi perlakuan. (C) Anti-p-Smad2/3, antibodi Smad4 dan antibodi sekunder terkonjugasi FITC/PE digunakan untuk mendeteksi ekspresi p-Smad2/3 (hijau), Smad4 (merah). DAPI menunjukkan lokasi nukleus (biru). Gambar ditangkap menggunakan mikroskop floresens (200x).


Cistanche Anti-Aging

Modulasi Smad4 oleh hsa-miR-4535 terlibat dalam sintesis kolagen dalam H2O2-fibroblas dermal kulit manusia yang terpajan

Untuk menentukan lebih lanjut mekanisme dimana hsa-miR-4535 memberikan efeknya pada ekspresi Smad4 dan pensinyalan hilirnya dalam sel HS68, kami mentransfeksi sel HS68 dengan mimik atau inhibitor hsa-miR-4535 dan mengukur Smad4 dan ekspresi kolagen hilirnya. Hasilnya menunjukkan bahwa penghambatan hsa-miR-4535 oleh hsa-miR-4535 inhibitor secara signifikan membalikkan penurunan regulasi mRNA Smad4 dan ekspresi protein dalam sel HS68 yang diberi perlakuan H2O2-(Gambar 7A–7C) . Selain itu, penekanan hsa-miR-4535 H2O yang dipulihkan sebagian2-menginduksi kerusakan COL1A1 dan COL3A1 dalam H2O2-sel HS68 yang dirawat (Gambar 7C).

Sebaliknya, peningkatan ekspresi hsa-miR-4535 sebagai hasil dari transfeksi mimik hsa-miR-4535 memblokir upregulasi Smad4 yang dimediasi cistanche dalam sel HS68 yang terpapar H2O2 (Gambar 7D–7F). Ekspresi berlebih dari miR-4535 telah mengurangi sebagian level COL1A1 dan COL3A1 yang diinduksi cistanche (Gambar 7F). Ekspresi berlebih dari hsa-miR-4535 (Gambar 8A–8C) atau penghambatan Smad4 oleh siRNA (Gambar 8D, 8E) mengakibatkan berkurangnya sintesis kolagen di bawah pengobatan cistanche setelah paparan H2O2. Anehnya, kami menemukan bahwa Smad4 langsung

pembungkaman dan perawatan dengan hsa-miR-4535 meniru sintesis kolagen terbalik yang diinduksi cistanche dalam sel HS68 yang diberi perlakuan H2O2-. Secara keseluruhan, kami menyimpulkan bahwa cistanche mengatur sintesis kolagen, berpotensi melalui penurunan level hsa-miR-4535 untuk meningkatkan pensinyalan Smad4 dalam sel HS68 yang terpapar H2O2.


image



Gambar 5. Hsa-miR-4535 menargetkan Smad4. ( A ) Ekspresi MicroRNA dalam sel HS68 yang diobati dengan cistanche dinilai menggunakan microarray. (B) Diagram Venn menggambarkan kandidat mRNA potensial yang mungkin diatur oleh hsa-miR-4535 berdasarkan database miRDB dan TargetScanHuman. Analisis urutan situs pengikatan miRNA diduga di Smad4-3′-UTR mRNA untuk hsa-miR-4535. Kecocokan ditunjukkan dengan garis lurus. (C) Sel HS68 ditransfeksi bersama dengan Smad4-3′-UTR-WT (tipe liar; 0.5 µg/mL) plus hsa-miR-4535 mimik (2{ {25}} nM) atau Smad4-3′-UTR MT (mutan; 0.5 µg/mL) ditambah hsa-miR-4535 mimik (20 nM) selama 24 jam. Aktivitas Luciferase ditentukan dan dinormalisasi dengan aktivitas Renilla. Kuantifikasi hasil ditampilkan (n=3); ***P < 0,001, versus grup mimik Smad4-3′-UTR-MT plus hsa-miR-4535. Kontrol G1 =, G2=cistanche (10 μM), G3=cistanche (30 μM)



cistanche meningkatkan jalur sintesis kolagen TGF /Smad dan melemahkan penuaan kulit serta penghambatan ekspresi hsa-miR-4535 dalam sel HS68 yang terpajan UVBKarena sinar UV memainkan peran penting dalam berbagai gangguan dermis kulit, termasuk peradangan, imunosupresi, kanker, dan penuaan dini [30-32], kami menguji efek cistanche pada pensinyalan terkait sintesis kolagen pada sel HS68 yang terpapar radiasi UVB. Tingkat protein komponen jalur TGF /Smad dan COL1A1 hilir dan COL3A1 menurun pada sel HS68 yang diobati dengan UVB tetapi secara efektif diregulasi setelah pengobatan cistanche (Gambar 9A).

Hasil western blotting mengonfirmasi bahwa cistanche menekan ekspresi MMP-1 yang ditingkatkan UVB dalam sel HS68 (Gambar 9A). Selain itu, kami mengklarifikasi efek anti-penuaan cistanche pada sel HS68 yang terkena paparan UVB dengan menunjukkan bahwa cistanche mengurangi peningkatan level p16 dan p21 yang diinduksi UVB (Gambar 9A). Untuk menilai apakah cistanche dapat menipiskan kerusakan kolagen akibat UVB melalui penghambatan hsa-miR-4535 yang menargetkan Smad4, kami menyelidiki kadar hsa-miR-4535 dan Smad4 dalam sel yang diobati dengan UVB dan cistanche menggunakan qPCR. Kami menemukan bahwa ekspresi hsa-miR-4535 diregulasi secara signifikan dalam sel yang terpapar UVB tetapi menurun setelah pengobatan cistanche. Sebaliknya, ekspresi Smad4 ditekan oleh paparan UVB dan penekanan ini dibalik dengan pengobatan cistanche (Gambar 9B, 9C). Secara kolektif, temuan kami menunjukkan bahwa cistanche memberikan efek yang sama seperti H2O2 untuk memulihkan penurunan pembentukan kolagen yang diinduksi UVB dengan menekan level hsa-miR-4535 untuk mempromosikan pensinyalan Smad4 dalam sel HS68.



Aplikasi topikal dari cistanche melemahkan hiperplasia kulit yang diinduksi UVB dan degradasi kolagen serta meningkatkan pensinyalan TGF / Smad dikulit punggung tikus telanjang C57BL6/JUntuk menjelaskan efek foto-protektif dari cistanche pada cedera kulit akibat UVB in vivo, kami mengevaluasi tingkat microRNA-4535, Smad4, dan perubahan jaringan kulit. Gambar 10A menunjukkan skema desain eksperimental dan garis waktu untuk aplikasi topikal cistanche setelah iradiasi UVB pada kulit dorsal mencit telanjang C57BL6/J. Pembentukan kerutan diamati pada bagian kulit dorsal mencit C57BL/6J pada kelompok yang terpapar UVB. Aplikasi topikal cistanche secara signifikan mengurangi pembentukan kerutan, menunjukkan peningkatan konten kolagen yang dimediasi cistanche untuk menjaga integritas kulit (Gambar 10B). Selain itu, analisis histologis lapisan dermal menunjukkan kandungan dan kepadatan kolagen pada kulitsecara signifikan lebih rendah pada kelompok yang disinari UVB dibandingkan dengan kelompok kontrol kendaraan. Namun, aplikasi topikal cistanche (12 mg/kg dan 24 mg/kg) meningkatkan kandungan dan densitas kolagen dengan cara yang bergantung pada dosis dibandingkan dengan tikus yang dikenai iradiasi UVB (Gambar 11). Morfologi kulit dievaluasi dengan pewarnaan H&E. UVBpaparan meningkatkan ketebalan epidermis dibandingkan dengan kelompok kontrol kendaraan. Namun, aplikasi topikal cistanche secara signifikan mengurangi hiperplasia epidermal akibat UVB (Gambar 11). Selain itu, pewarnaan imunohistokimia -gal menunjukkan aplikasi cistanche mengurangi ekspresi -gal tinggi pada kulit yang diradiasi UVB (Gambar 11). Untuk menentukan apakah cistanche dapat memperbaiki hilangnya serat kolagen yang diinduksi UVB melalui penurunan regulasi hsa-miR-4535 untuk meningkatkan Smad4 in vivo, ekspresi RNA-nya dinilai dalam sampel kulit punggung yang dipotong oleh qRT-PCR. ekspresi hsa-miR-4535 meningkat pada kulit yang disinari UVB tetapi ditekan secara signifikan pada kulit yang diobati dengan cistanche pada dosis rendah dan tinggi. Selanjutnya, ekspresi Smad4 RNA tingkat rendah pada kulit yang disinari UVB dipulihkan dengan pengobatan cistanche (Gambar 12A, 12B)


Selain itu, aplikasi cistanche menyelamatkan ekspresi protein TGF , p smad2/3, dan Smad4 pada jaringan kulit yang rusak akibat UVB (Gambar 12C). Temuan kami menunjukkan bahwa cistanche berpotensi melindungi kulit dari kerusakan akibat UVB dengan menghambat HSAMIR-4535 untuk meningkatkan ekspresi Smad4 untuk aktivasi P-smad2/3 untuk akhirnya mendorong sintesis kolagen (Gambar 13).


Cistanche Anti-Aging

Gambar 9. cistanche meningkatkan jalur sintesis kolagen TGF /Smad dan melemahkan penuaan kulit serta penghambatan ekspresi hsa-miR-4535 dalam sel HS68 yang terpajan UVB. Sel HS68 dipaparkan ke UVB (40 mJ/cm2 ) dan kemudian diobati dengan cistanche (30 µM) selama 23 jam. (A) Ekspresi protein dari komponen jalur terkait sintesis kolagen (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), protein terkait degradasi kolagen (MMP{{20}}), dan penuaan- penanda terkait (p16 dan p21) terdeteksi oleh western blot. GAPDH digunakan sebagai kontrol pemuatan. (B dan C) Ekspresi RNA dari hsa-miR-4535 dan Smad4 terdeteksi oleh qRT-PCR. Nilai ditampilkan sebagai rata-rata ± SE. Kuantifikasi hasil ditampilkan (n=3) *P < 0.05, **P <0.01, vs sel kontrol yang tidak diberi perlakuan; #P <0,05, ##P <0,01 vs sel yang terpapar UVB.

Tanya lebih lanjut:

Surel:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950

Anda Mungkin Juga Menyukai