Bagian Nilai Ajuvan Herba Cistanches Ketika Digunakan Dalam Kombinasi Dengan Statin dalam Model Murine

Elaine Wat, Chun Fai Ng, Chi Man Koon, Cheng Zhang, Si Gao, Brian Tomlinson & Clara Bik San Lau

1 Institut Pengobatan Cina, Universitas Cina Hong Kong, Shatin, New Territories, Hong Kong.

2 Laboratorium Kunci Negara Bagian Fitokimia dan Sumber Daya Tumbuhan di Cina Barat, Universitas Cina Hong Kong, Shatin, New Territories, Hong Kong.

3 Divisi Farmakologi Klinis, Departemen Kedokteran dan Terapi, Universitas Cina Hong Kong, Shatin, New Territories, Hong Kong. Elaine Wat dan Chun Fai Ng berkontribusi sama dalam pekerjaan ini. Korespondensi dan permintaan materi harus ditujukan ke CBSL (email: claralau@cuhk.edu.hk)

Untuk informasi lebih lanjut: emily.li@wecistanche.com

Klik di sini untuk mendapatkan informasi lebih lanjut tentang Cistanche

Abstrak

Statin diketahui memiliki masalah toksisitas otot.jamuCistanches(HC) adalah ramuan Cina yang secara tradisional digunakan untuk nyeri di pinggang dan lutut. Studi in vitro kami sebelumnya menyarankan bahwa itu dapat melindungi terhadap toksisitas otot yang diinduksi statin. Namun, efek perlindungan in vivo belum pernah diteliti. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan apakah ekstrak air darijamuBenteng(HCE) dapat mencegah toksisitas otot yang diinduksi simvastatin pada tikus dan apakah Herba Cistanche E juga dapat memberikan efek menguntungkan dalam mengurangi hiperkolesterolemia akibat diet tinggi lemak dan peningkatan kolesterol hati, sehingga mengurangi dosis simvastatin bila digunakan dalam terapi kombinasi. Dari hasil kami, Herba Cistanche E secara signifikan memulihkan pengurangan bobot otot yang diinduksi simvastatin dan mengurangi peningkatan kreatin kinase plasma pada tikus.jamuBentengE juga meningkatkan pengurangan kadar glutathione otot yang diinduksi simvastatin, potensial membran mitokondria otot, dan mengurangi peradangan otot yang diinduksi simvastatin. Lebih lanjut, HCE dapat memberikan pengurangan pada berat hati, kadar lipid hati total, dan kadar lipid plasma pada tikus yang diberi makan tinggi lemak. Sebagai kesimpulan, penelitian kami memberikan bukti in vivo bahwajamu BentengE memiliki efek perlindungan potensial pada toksisitas yang diinduksi simvastatin pada otot, dan juga efek menguntungkan pada perlemakan hati non-alkohol dan hiperlipidemia yang diinduksi diet ketika digunakan sendiri atau dalam kombinasi dengan simvastatin pada dosis yang dikurangi.

Inhibitor reduktase HMG-CoA, juga dikenal sebagai statin, didokumentasikan dengan baik untuk bermanfaat bagi pasien hiperkolesterolemia dengan risiko penyakit kardiovaskular sedang dan tinggi1. Statin, salah satu kelas obat resep terlaris di dunia, bertindak melalui penghambatan reduksi HMG-CoA menjadi asam mevalonat selama tahap awal jalur mevalonat untuk mengurangi sintesis kolesterol endogen2, 3. Meskipun statin biasanya ditoleransi dengan baik , salah satu efek samping klinis yang paling penting dan terkenal adalah kelainan otot rangka, yang dapat berkisar dari mialgia jinak hingga miopati berat4, 5. Dalam survei besar pada 10.409 subjek Prancis yang dilakukan melalui wawancara telepon, 10 persen pasien menerima pengobatan statin melaporkan gejala otot, dari mana 30 persen dari pasien bergejala ini mengakibatkan penghentian pengobatan6. Gugus Tugas Keamanan Statin Asosiasi Lipid Nasional telah memberikan rekomendasi untuk pengelolaan gejala yang berhubungan dengan otot pada pasien yang menjalani terapi statin. Secara umum, disarankan bahwa pada pasien dengan gejala berat seperti peningkatan creatine kinase (CK) lebih dari 5 × ULN, statin harus ditahan, sampai kadar CK kembali normal5. Karena terjadinya efek samping ini, dan bahwa tidak ada pengobatan yang efektif untuk toksisitas otot yang diinduksi statin, ada dorongan untuk mencari terapi baru untuk pengelolaan masalah otot yang diinduksi statin.

Sementara berbagai mekanisme diusulkan dan dapat bertanggung jawab atas efek samping statin, mekanisme mitokondria diyakini terlibat dalam efek samping toksisitas otot dari statin1. Mevalonat bukan hanya prekursor kolesterol tetapi juga prekursor untuk senyawa penting, seperti selenoprotein, dolichol, dan ubiquinone7, 8. Statin dapat menurunkan regulasi selenoprotein seperti glutathione peroxidase (GPx), mengurangi kepadatan antioksidan dan berkontribusi terhadap efek sampingnya. efek4. Statin juga bisa menyebabkan penipisan ubiquinone, menyebabkan konsumsi oksigen berkurang dan sintesis ATP9. Lebih lanjut, peningkatan penelitian in vitro dan in vivo menunjukkan bahwa statin juga dapat bekerja langsung pada mitokondria jaringan yang menyebabkan peningkatan spesies oksigen reaktif (ROS) dan stres oksidatif mitokondria, yang menyebabkan kematian sel dan oleh karena itu berkontribusi pada cedera hati dan otot10, 11.

jamuCistanches, seluruh tanaman kering dariBentenggurun pasirYC Ma (famili Orobanchaceae), merupakan tumbuhan parasit yang sebagian besar tumbuh di daerah gurun di Cina utara dan timur laut12. Menurut teori pengobatan Cina, Herba Cistanches memiliki rasa manis, hangat, dan asin13. Ini adalah ramuan tonik Cina yang menyegarkan yang terutama digunakan untuk mengobati defisiensi ginjal dengan gejala seperti impotensi, infertilitas, ejakulasi dini. Ini juga merupakan ramuan Cina yang secara tradisional diresepkan untuk pasien untuk nyeri di pinggang dan lutut dan umumnya digunakan dalam formulasi Cina untuk pengobatan masalah otot12, 14. Menariknya, ini juga konsisten dengan studi ilmiah modern yang menunjukkan anti -aktivitas kelelahan dari ekstrak Herba Cistanches yang kaya polisakarida dan kaya feniletanoid pada tikus setelah berolahraga dengan mengurangi kerusakan otot dan meningkatkan penyimpanan ATP15. Selain itu, penelitian terbaru menunjukkan bahwa ekstrak metanol dari Herba Cistanches dapat meningkatkan generasi ATP mitokondria16.jamuCistanchesjuga terbukti menjadi antioksidan kuat dan pemulung radikal bebas di berbagai organ, mengurangi stres oksidatif dan aktivitas ROS dalam studi vivo17, 18. Dalam studi terbaru yang dilakukan oleh laboratorium kami, kami telah menunjukkan bahwajamuCistanchesekstrak air secara signifikan mencegah toksisitas yang diinduksi simvastatin dalam sel otot rangka L6, serta pengurangan produksi ATP yang diinduksi simvastatin yang dipulihkan tergantung dosis dalam sel L6, menunjukkan potensijamuCistanchesekstrak air dalam melindungi terhadap toksisitas otot yang diinduksi statin19. Meskipun demikian, bukti in vivo masih kurang.

Oleh karena itu, kami berhipotesis bahwajamuCistanchesekstrak air (HCE) dapat memberikan efek menguntungkan pada toksisitas otot yang diinduksi simvastatin. Dengan demikian, penelitian ini bertujuan untuk menentukan apakah penggunaan HCE dapat mengurangi toksisitas otot yang diinduksi simvastatin menggunakan model hewan in vivo, dan selain itu, apakah HCE juga dapat memberikan efek menguntungkan dalam mengurangi hiperkolesterolemia yang diinduksi oleh diet tinggi lemak dan peningkatan kolesterol hati. , sehingga mengurangi dosis simvastatin yang digunakan.

Bahan dan metode

Otentikasi dan ekstraksi bahan herbal.

Bahan herbal mentah darijamuCistanches(Cistanche deserticola, bersumber dari Mongolia Dalam) dibeli dari Zi Xin, pemasok terkenal di Guangzhou, Cina. Herba Cistanches diautentikasi secara kimia menggunakan kromatografi lapis tipis dan kromatografi cair ultra-kinerja sesuai dengan Farmakope Cina 201013 seperti yang dijelaskan sebelumnya19, denganverbaskosidadanechinacosida(dibeli dari National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, China) sebagai penanda kimia. Setelah otentikasi kimia, spesimen voucher herbarium darijamuCistanchesdisimpan di Museum Institut Pengobatan Cina di Universitas Cina Hong Kong, dengan nomor spesimen voucher 2014-3434.

jamuCistanchesekstrak air dibuat seperti yang dijelaskan sebelumnya19. Secara singkat, 1 kg herba mentah direndam selama 1 jam, dilanjutkan ekstraksi dua kali dengan pemanasan selama 1 jam di bawah refluks pada suhu 100 derajat menggunakan air suling 10x. Ekstrak air (HCE) kemudian digabungkan dan disaring, dan filtratnya dipekatkan di bawah tekanan tereduksi pada 60 derajat. Ekstrak pekat diliofilisasi sampai kering. Persentase hasil adalah 50,1 persen b/b. Semua bubuk yang diekstraksi dikemas vakum dan disimpan sampai digunakan.

Hewan percobaan.

Simvastatin dibeli dari SR Pharmasolutions Ltd. Tikus jantan Sprague Dawley (180–200 g) dan tikus jantan C57Bl/6J (berusia 8-minggu) dipasok oleh Laboratory Animal Services Centre, Chinese University of Hong Kong. Eksperimen hewan telah disetujui oleh Komite Etika Eksperimen Hewan dari Universitas Cina Hong Kong (Ref no. 12/074/MIS). Semua metode eksperimental dilakukan dengan pedoman yang disetujui yang ditentukan oleh Komite Etika Eksperimen Hewan Universitas Cina Hong Kong. Semua tikus (3 hewan per kandang) dan tikus (5 hewan per kandang) ditempatkan di kandang standar normal pada suhu konstan 21 derajat dengan siklus terang-gelap 12-h. Setiap kandang standar berisi aspen sebagai bahan alas tidur. Semua hewan diizinkan akses ad libitum ke makanan dan air.

Studi toksisitas otot yang diinduksi statin pada tikus.

Semua tikus secara acak dibagi menjadi 5 kelompok (n=5–10). Semua hewan menjalani diet chow normal. Mereka juga diberi air suling atau simvastatin setiap hari, dan dengan atau tanpa pengobatan HCE secara intragastrik. Untuk hewan yang harus diberikan simvastatin dan HCE, HCE diberikan 3 jam setelah pemberian simvastatin untuk mencegah interaksi kimia obat-herbal secara langsung. Ekstrak herbal atau simvastatin dilarutkan dalam 0,5 persen metilselulosa dalam air suling pada konsentrasi yang diketahui. Volume yang telah dihitung sebelumnya diberikan secara intragastrik kepada setiap hewan sesuai dengan berat individu sehingga volume yang dihitung berisi jumlah dosis yang diusulkan yang diperlukan. Rincian kelompok-kelompok tersebut adalah sebagai berikut:

Kelompok a) Diet normal-chow ditambah air suling (kelompok kontrol normal)

Kelompok b) Diet normal-chow ditambah simvastatin (640mg/kg)

Kelompok c) Diet normal-chow ditambah simvastatin (640mg/kg) ditambah HCE dosis rendah (1,1 g/kg hewan)

Kelompok d) Diet normal-chow ditambah simvastatin (640mg/kg) ditambah HCE dosis tinggi (2,2 g/kg hewan)

Kelompok e) Diet normal-chow ditambah HCE dosis tinggi (2,2 g/kg hewan)

Asupan makanan dicatat setiap hari dan berat badan diukur dua kali seminggu. Perlakuan diberikan selama 4 minggu. Setelah itu, hewan dibius menggunakan campuran ketamin (100mg/kg) dan xylazine (10mg/kg) secara intraperitoneal. Darah diambil dengan tusukan jantung dan dibiarkan menggumpal. Plasma kemudian dipisahkan dengan sentrifugasi (3,000 rpm selama 10 menit). Berbagai otot (paha depan, gastrocnemius, soleus, tibialis anterior, dan ekstensor digitorumlongus) dipotong dan disimpan pada 80 derajat sampai analisis.

Pengukuran kreatin kinase plasma. Aktivitas kreatin kinase (CK) plasma ditentukan menggunakan kit Stanbio CK Liqui-UV® (2910-430, Stanbio Laboratory, USA) sesuai dengan instruksi pabrik.

Pengukuran glutathione peroksidase otot. Otot glutathione peroksidase (GPx) diukur menggunakan kit yang tersedia secara komersial (703102, Cayman Chemical, USA) sesuai dengan instruksi pabrik. Singkatnya, jaringan otot dibilas dengan PBS pada pH 7,4 untuk menghilangkan sel darah merah, dan dihomogenisasi dalam buffer lisis dingin 5-10ml, setelah itu homogenat disentrifugasi pada 10,000 g selama 15 menit pada 4 derajat. Supernatan kemudian dihilangkan dan diuji untuk aktivitas GPx menggunakan kit komersial.

Persiapan fraksi mitokondria dan sitosol otot. Fraksi mitokondria dan sitosol dari sampel otot disiapkan menggunakan Kit Isolasi Mitokondria (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, USA) sesuai dengan instruksi pabrik. Secara singkat, sampel otot segar diberi perlakuan awal dengan ekstraksi mentega, dipotong kecil-kecil, dan dihomogenkan dalam buffer ekstraksi. Homogenat jaringan kemudian disentrifugasi. Supernatan dikumpulkan, dan dicadangkan untuk analisis fraksi sitosol. Pelet mitokondria kemudian dicuci dan disentrifugasi lagi dan digunakan untuk analisis fraksi mitokondria.

Pengukuran Muscle Mitochondrial Reactive Oxygen Species (ROS). ROS diukur dengan protokol yang dimodifikasi dari literatur sebelumnya20. Secara singkat, ROS diukur dari fraksi mitokondria (50 g protein/ml) menggunakan larutan DCFDA (C6827, Invitrogen, USA). Campuran diinkubasi pada 37 derajat selama 10 menit dalam gelap, setelah itu diinkubasi dengan larutan substrat (10 mM piruvat, 15 mM malat) untuk foto-aktivasi. Intensitas fluoresensi diukur setiap 5 menit selama 60 menit dengan BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader pada eksitasi 485 nm dan emisi 520nm. Intensitas fluoresensi dihitung untuk pengukuran generasi ROS.

Potensi membran mitokondria otot. Potensi membran mitokondria dari fraksi mitokondria dari sampel otot ditentukan sesuai dengan protokol Pabrikan (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, USA). Prosedur ini adalah uji titik tetap yang mengukur serapan JC-1 dengan pembentukan agregat-J. Secara singkat, suspensi mitokondria diencerkan untuk mengandung 20 g protein dan diinkubasi dengan pewarna JC-1 selama 7 menit pada suhu kamar. Menit 7-ini adalah waktu yang dioptimalkan dan divalidasi oleh Pabrikan menggunakan berbagai senyawa (sebagaimana dinyatakan dalam protokol pabrikan) karena fluoresensi yang diamati dari larutan akan naik ke dataran tinggi setelah 5-10 menit, diikuti dengan penurunan drastis dalam fluoresensi JC-1 karena pemerataan konsentrasi JC-1 di dalam dan di luar matriks mitokondria. Intensitas fluoresensi diukur dengan BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader pada eksitasi 490nm dan emisi 590nm. Intensitas fluoresensi dihitung untuk pengukuran gradien potensial.

Histologi otot dan penilaian peradangan. Imunohistokimia sel inflamasi di dalam otot dinilai dengan pewarnaan CD68 dan CD163 seperti yang dijelaskan sebelumnya21-23. Bagian parafn 5 m dipotong, dilekatkan pada slide kaca Superfrost™ Plus (Menzel-Gläser, Jerman). Antibodi CD68, ED1, dan CD163 anti-tikus utama tikus, ED2, (Bio-Rad, USA) diaplikasikan pada bagian pada pengenceran 1:100. Pewarnaan spesifik dideteksi oleh Sistem EnVision™ (Dako, Denmark), menggunakan antibodi sekunder, IgG anti-tikus terkonjugasi polimer EnVision-HRP pada pengenceran 1:200, dan dideteksi menggunakan larutan DAB (Dako, Denmark), diikuti dengan counterstaining dengan hematoxylin. Bagian kemudian dipasang di dibutil-ftalat dalam histon (DPX). Adanya neutrofil pada otot dideteksi dengan imunohistokimia kuantitatif menggunakan software ImageJ.

Analisis ekspresi gen otot. Uji PCR yang profil gen yang terkait dengan stres oksidatif dilakukan menggunakan Tikus Oksidatif Stres dan Antioksidan Pertahanan PCR-array (PARN-065Z, SABiosciences, Frederick, USA). Array PCR dilakukan sesuai dengan instruksi pabrik. Secara singkat, RNA total diisolasi dengan pengikatan selektif ke membran berbasis gel silika setelah lisis dan homogenisasi sampel otot dalam buffer guanidin tiosianat denaturasi (kit RNeasy, Qiagen). RNA ditranskripsi terbalik menjadi cDNA menggunakan RT2 First Strand Kit (SABIosciences, Frederick, USA). cDNA ini kemudian ditambahkan ke RT2 SYBR Green qPCR Master Mix (SABIosciences, Frederick, USA). Selanjutnya, setiap sampel diakuot pada Tikus Oksidatif Stres dan Antioksidan Pertahanan PCR-array (SABIosciences, Frederick, USA). Semua langkah dilakukan sesuai dengan protokol pabrikan.

Studi hiperlipidemia yang diinduksi diet tinggi lemak dan steatosis hati pada tikus.

Semua tikus secara acak dibagi menjadi 5 kelompok (n=8-10) dan menerima yang berikut: Kelompok a) Diet normal-chow (Tabel 1); Kelompok b sampai e) Diet tinggi lemak (mengandung 21 persen lemak dan 0,15 persen kolesterol) (Tabel 2). Pakan diberikan selama 8 minggu pada hewan untuk menginduksi obesitas. Setelah 8 minggu, semua kelompok yang diberi makan tinggi lemak diberi air suling, atau simvastatin setiap hari, dan atau pengobatan HCE secara intragastrik, 3 jam setelah pemberian simvastatin. Ekstrak herbal atau simvastatin dilarutkan dalam 0,5 persen metilselulosa (Sigma-Aldrich Corporation, USA) dalam air suling pada konsentrasi yang diketahui. Volume yang telah dihitung sebelumnya diberikan secara intragastrik kepada setiap hewan sesuai dengan berat individu sehingga volume yang dihitung berisi jumlah dosis yang diusulkan yang diperlukan. Rincian kelompok-kelompok tersebut adalah sebagai berikut:

Kelompok a) Diet normal-chow ditambah air suling

Kelompok b) Diet tinggi lemak ditambah air suling

Kelompok c) Diet tinggi lemak plus simvastatin (50mg/kg)

Kelompok d) Diet tinggi lemak ditambah HCE (4,4 g/kg)

Kelompok e) Diet tinggi lemak plus simvastatin (25mg/kg) plus HCE (4,4 g/kg)

Asupan makanan dicatat setiap hari dan berat badan diukur dua kali seminggu. Pada akhir 16-minggu penelitian, semua tikus dikorbankan setelah 16-jam puasa semalaman. Hewan dibius dengan campuran ketamin (100mg/kg) dan xylazine (10mg/kg) secara intraperitoneal. Darah diambil dengan tusukan jantung dan dibiarkan menggumpal. Plasma dipisahkan dengan sentrifugasi (3,000 rpm selama 10 menit). Hati dipotong dan disimpan pada suhu -80 derajat sampai analisis.

Pengukuran lipid plasma dan hati.

Kadar trigliserida plasma, kolesterol (1148872216 dan 11489232216, Roche Diagnostics, Swiss), high-density dan low-density lipoprotein kolesterol (L-Type HDL-C dan L-Type LDL-C, Wako Pure Chemicals Industries, Jepang) konsentrasi diukur dengan metode enzimatik menggunakan kit yang tersedia secara komersial sesuai dengan instruksi pabrik. Aktivitas kreatin kinase (CK) plasma ditentukan menggunakan kit Stanbio CK Liqui-UV® (2910-430, Stanbio Laboratory, USA). Total lipid hati ditentukan secara gravimetri setelah ekstraksi dengan metode Bligh dan Dyer24. Lipid hati individu diukur secara enzimatik (seperti dijelaskan di atas) setelah pelarutan dalam isopropanol (Sigma-Aldrich, USA)25.

Histopatologi hati dan penilaian peradangan. Pewarnaan hematoxylin dan eosin (pewarnaan H&E). Bagian centang (5 m) dari jaringan yang tertanam parafin dipotong dengan mikrotom dan ditempatkan pada slide mikroskop SuperFrost Plus® (Thermo Scientific, USA). Bagian menjadi sasaran pewarnaan H&E sesuai dengan metode Harris et al. 26 dan dipasang dengan dibutil-ftalat dalam histon (DPX) (Sigma-Aldrich, USA)25.

Pewarnaan dan kuantifikasi Mac-3. Bagian tebal (5 m) dari jaringan tertanam parafin dipotong menggunakan mikrotom dan ditempatkan pada slide mikroskop SuperFrost Plus® (Thermo Scientific, USA). Pengambilan antigen dilakukan, dilanjutkan dengan pemblokiran dengan Blok Peroksidase (Dako Cytomation, Denmark). Antibodi Mac-3 primer yang dimurnikan anti-tikus (BD Pharmingen, USA) diaplikasikan pada bagian pada pengenceran 1:50. Pewarnaan spesifik dideteksi menggunakan EnVision™ Systems (Dako, Denmark). Slide diinkubasi dengan antibodi sekunder, IgG anti-kelinci terkonjugasi polimer EnVision-HRP pada pengenceran 1:200. Mac-3 dideteksi menggunakan larutan DAB (Dako, Denmark) dan diwarnai dengan hematoxylin. Bagian kemudian dipasang di DPX. Adanya makrofag di hati dideteksi dengan imunohistokimia kuantitatif menggunakan software ImageJ.

Analisis statistik. Perbedaan antara kelompok perlakuan dan kontrol diuji dengan analisis varians satu arah (ANOVA), diikuti dengan uji perbandingan berganda Bonferroni posthoc. Semua analisis statistik dilakukan menggunakan GraphPad Prism Versi 6.0 (GraphPad, USA). Probabilitas p<0.05 would="" be="" considered="" statistically="">

Hasil

Efek darijamuBentengE pada toksisitas otot yang diinduksi simvastatin pada tikus. Berat otot dan pengukuran kreatin kinase plasma. Lima jenis otot yang berbeda (otot paha depan, gastrocnemius, soleus, tibialis anterior, dan ekstensor digitorum longus) diisolasi dari semua tikus yang diobati. Efek dari perlakuan yang berbeda pada berat otot ditunjukkan pada Gambar. 1a. Simvastatin (640mg/kg) menginduksi penurunan berat badan yang signifikan pada otot quadriceps, gastrocnemius, dan tibialis anterior pada tikus, sementara pengurangan ini secara signifikan dipulihkan oleh HCE pada otot quadriceps dan gastrocnemius dengan cara yang bergantung pada dosis. MeskipunjamuBentengE memberikan tren untuk mengembalikan bobot otot tibialis anterior pada tikus yang diobati dengan simvastatin, tidak satu pun dari kelompok perlakuan ini yang mencapai signifikansi statistik. Tidak ada efek signifikan dari pengobatan HCE saja pada berat otot yang diamati bila dibandingkan dengan tikus kontrol (Gbr. 1a).

Gambar 1b menunjukkan efek dari perlakuan yang berbeda pada tingkat plasma creatine kinase (CK) pada tikus. Simvastatin menginduksi peningkatan yang signifikan dalam aktivitas creatine kinase pada tikus, yang secara signifikan dikurangi dengan pengobatan bersama HCE pada kedua dosis. Juga tidak ada pengaruh yang signifikan dari pengobatan HCE saja pada tingkat CK dibandingkan dengan kelompok kontrol. Karena gastrocnemius tampaknya sensitif terhadap pengobatan simvastatin dan merupakan otot terbesar yang diisolasi berdasarkan massa, oleh karena itu, kami memilih otot ini untuk analisis lebih lanjut termasuk pengukuran glutathione peroksidase otot (GPx), pengukuran MMP dan ROS mitokondria, serta histologi otot dan penilaian peradangan. .

Pengukuran glutathione peroksidase (GPx) otot. Tingkat glutathione peroksidase otot diukur dan ditunjukkan pada Gambar. 2a. Pemberian simvastatin menginduksi tren penurunan pengukuran glutathione peroxidase (GPx) otot pada tikus. Namun, HCE memberikan tren untuk memperbaiki pengurangan GPx otot yang diinduksi simvastatin pada kedua dosis 1,1 g/kg dan 2,2 g/kg. Juga tidak ada efek signifikan dari pengobatan HCE saja pada tingkat GPx otot dibandingkan dengan tikus kontrol normal.

Pengukuran Potensi Membran Mitokondria (MMP) dan ROS. Pengobatan Simvastatin (640mg/kg) menginduksi penurunan MMP otot yang signifikan (Gbr. 2b). Pengurangan ini ditingkatkan tergantung dosis pada tikus yang menerima pengobatan bersama HCE dan simvastatin (Gbr. 2b). Di sisi lain, yang menarik, kelompok perlakuan simvastatin saja telah secara signifikan mengurangi tingkat ROS mitokondria otot dibandingkan dengan kelompok kontrol normal (Gbr. 2c). Namun, pengobatan HCE yang diberikan kepada tikus yang diobati dengan simvastatin memberikan tren yang bergantung pada dosis untuk mengembalikan tingkat ROS mitokondria otot ke tingkat normal. Juga tidak ada efek signifikan dari pengobatan HCE saja pada tikus dibandingkan dengan kelompok kontrol normal untuk pengukuran MMP dan ROS mitokondria.

Histologi otot dan penilaian peradangan. Otot gastrocnemius dari tikus yang diberi perlakuan berbeda dianalisis lebih lanjut secara histologis dan bagian yang diwarnai ditunjukkan pada Gambar. 3a. Hewan kelompok kontrol menunjukkan bagian histologis otot normal. Sebaliknya, bagian H&E dari hewan yang diobati dengan simvastatin mengungkapkan infiltrasi penanda inflamasi (panah kuning), yang berkurang secara signifikan pada bagian otot tikus yang diberi kombinasi simvastatin dan HCE. Analisis imunohistokimia juga dilakukan untuk keberadaan makrofag CD68 dan CD163 pada Gambar 4a dan 5a, masing-masing, dengan kuantifikasi masing-masing makrofag ditunjukkan pada Gambar 4b dan 5b. Analisis imunohistokimia bagian otot mengungkapkan adanya makrofag (CD68) pada tikus yang diobati dengan simvastatin (warna coklat), yang berkurang secara signifikan pada tikus yang diberikan pengobatan bersama HCE pada kedua dosis (Gbr. 4b). Juga tidak ada peradangan signifikan yang diamati pada hewan yang diobati dengan HCE saja. Demikian pula, analisis imunohistokimia bagian otot mengungkapkan adanya CD{11}}makrofag positif pada tikus yang diobati dengan simvastatin (warna coklat), yang berkurang secara signifikan pada tikus yang diberikan pengobatan bersama HCE pada 2,2 g/kg (Gbr. 5b). ). Juga tidak ada peradangan signifikan yang diamati pada hewan yang diobati dengan HCE saja.

Analisis ekspresi gen otot. Untuk menentukan efek simvastatin dan HCE pada gen yang terkait dengan stres oksidatif di dalam otot, uji PCR yang profil gen yang terkait dengan stres oksidatif dilakukan menggunakan Tikus Oksidatif Stres dan Antioksidan Pertahanan PCR-array. Gen yang secara signifikan dipengaruhi oleh pengobatan simvastatin dianalisis dan disajikan pada Gambar. 6. Untuk profil ekspresi gen yang mengatur antioksidan, tikus yang diberi simvastatin (640mg/kg) meningkatkan ekspresi gen yang mengatur antioksidan. Ini termasuk glutathione peroxidases (GPx) GPx1 dan GPx7, dan peroksidase lainnya termasuk Serpinb1b dan club (Gbr. 6a). HCE pada kedua dosis (1,1 atau 2,2 g/kg) mengurangi peningkatan GPx dan peroksidase lain yang diinduksi simvastatin ini ke tingkat normal. Di sisi lain, pengobatan HCE saja secara signifikan meningkatkan tingkat ekspresi GPx1. Mengenai ekspresi gen yang mengatur metabolisme ROS, simvastatin secara signifikan menginduksi ekspresi gen metabolisme superoksida lainnya, termasuk Cyba, Ncf1, Ncf2, Scd1, dan Ucp2. Demikian pula, HCE pada kedua dosis secara signifikan mengurangi peningkatan ini (Gbr. 6b). Lebih lanjut, simvastatin menginduksi ekspresi gen yang responsif terhadap stres oksidatif termasuk Apoe, Ccl5, dan Txn1, sementara ekspresi ini berkurang secara signifikan pada hewan yang diberi perlakuan bersama HCE pada kedua dosis (Gbr. 6c). Di sisi lain, simvastatin menyebabkan penurunan yang signifikan dalam ekspresi gen Txnip. Tidak ada efek signifikan dari HCE pada pengurangan ekspresi gen Txnip yang diinduksi simvastatin (Gbr. 6c). Simvastatin juga memberikan peningkatan yang signifikan dalam ekspresi gen yang mengatur pengangkut oksigen termasuk Slc38a1 dan Vim. Perawatan bersama HCE mengurangi ekspresi gen-gen ini pada kedua dosis (Gbr. 6d).

Efek penggunaan kombinasi Simvastatin dan HCE pada asupan makanan dan berat badan pada tikus. Gambar 7a menunjukkan asupan makanan harian mencit untuk semua kelompok perlakuan. Diet tinggi lemak menginduksi peningkatan yang signifikan dalam asupan makanan harian hewan dibandingkan dengan hewan yang diberi makan makanan (p<0.001). there="" was="" however="" no="" significant="" effect="" of="" the="" herb="" or="" drug="" treatments="" among="" all="" high-fat-fed="" groups="" (fig.="">

Pengukuran berat badan mingguan. Setelah 16 minggu pemberian pakan tinggi lemak, hewan yang diberi makan HF secara signifikan bertambah lebih berat daripada hewan yang diberi makan makanan ringan (Gbr. 7b). Namun, tidak ada efek yang signifikan antara tikus yang diberi HF dan semua kelompok perlakuan yang diberi HF. Juga tidak ada perbedaan yang signifikan antara tikus yang diberi HF yang menerima pengobatan bersama simvastatin dan HCE vs tikus yang diberi HF yang menerima pengobatan HCE atau simvastatin saja (Gbr. 7b).

Efek penggunaan gabungan Simvastatin dan HCE pada hiperlipidemia dan steatosis hati pada tikus. Pengukuran aktivitas lipid plasma dan kreatin kinase. Tingkat lipid plasma dari semua tikus ditunjukkan pada Gambar. 8. Dibandingkan dengan tikus yang diberi makan chow normal, tikus yang diberi makan HF memiliki kadar kolesterol total plasma (TC) yang meningkat secara signifikan, yang secara signifikan berkurang pada semua kelompok perlakuan (Gbr. 8a) . Tikus yang diberi HF yang diobati dengan simvastatin dan HCE memiliki TC plasma yang secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan hewan HF yang diberi simvastatin saja atau hewan HF yang diberi HCE saja (hal.<0.001 and=""><0.01, respectively)="" (fig.="" 8a).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" simvastatin="" alone="" treatment="" group,="" suggesting="" hce="" has="" comparable="" effects="" as="" simvastatin.="" besides,="" hf-fed="" mice="" also="" had="" significantly="" higher="" plasma="" triglyceride="" (tg)="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" a="" normal="" chow="" diet=""><0.05) (figure="" 8b).="" there="" was="" a="" trend="" for="" a="" reduction="" in="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" on="" plasma="" tg="" in="" hf-fed="" animals,="" though="" this="" did="" not="" reach="" statistical="" significance.="" however,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" significantly="" reduced="" plasma="" tg="" compared="" to="" control="" hf-fed="" animals=""><0.001 and=""><0.01, respectively).="" when="" comparing="" between="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" with="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" group,="" hce="" co-treatment="" with="" simvastatin="" had="">

TG plasma lebih rendah dibandingkan dengan tikus yang diberi HF yang diberi pengobatan simvastatin saja (p<0.01) (fig.="" 8b).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" the="" simvastatin="" treatment="" group,="" though="" hce="" had="" a="" slightly="" better="" reduction="" in="" tg="" levels.="" in="" addition,="" high-fat-diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" high-density="" lipoprotein="" (hdl)="" cholesterol="" and="" plasma="" low-density="" lipoprotein="" (ldl)="" cholesterol="" in="" mice="" compared="" to="" normal="" chow-fed="" animals="" (fig.="" 8c="" and="" d).="" simvastatin="" treatment="" alone="" significantly="" reduced="" both="" lipids="" in="" high-fat-fed="" mice.="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" also="" significantly="" reduced="" both="" types="" of="" plasma="" lipids="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone.="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" both="" lipids="" among="" all="" treatment="" groups.="" figure="" 8e="" showed="" the="" effect="" of="" different="" treatments="" on="" plasma="" creatine="" kinase="" (ck)="" levels.="" interestingly,="" hf="" diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels="" in="" mice="" compared="" to="" normal-chow-fed="" mice="" (fig.="" 8e).="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" the="" co-treatment="" of="" simvastatin="" significantly="" reduced="" plasma="" ck="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone=""><0.01 and=""><0.01, respectively).="" simvastatin="" treatment="" alone="" also="" significantly="" reduced="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels.="" there="" was="" also="" no="" significant="" difference="" in="" plasma="" ck="" levels="" among="" all="" active="" treatment="" groups="">pengukuran lipid.

Efek dari kelompok perlakuan yang berbeda pada hepatomegali yang diinduksi HF (pembesaran hati) dikaitkan dengan penurunan yang signifikan dalam kandungan lipid total hati, dinyatakan sebagai miligram lipid per hati (Gbr. 9a). Kandungan lipid hati total secara signifikan lebih tinggi pada tikus yang diberi HF dibandingkan dengan tikus yang diberi makan normal (3.0-kali lipat lebih tinggi, p<0.001). simvastatin="" exerted="" no="" significant="" effect="" on="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" total="" liver="" lipid.="" interestingly,="" hce="" significantly="" reduced="" such="" a="" diet-induced="" increase="" in="" liver="" lipid=""><0.05). on="" the="" other="" hand,="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" exerted="" a="" trend="" to="" reduce="" the="" liver="" lipid="" content="" though="" did="" not="" reach="" statistical="" significance="" (p="0.15)." however,="" when="" comparing="" the="" liver="" lipid="" content="" among="" all="" treatment="" groups,="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" among="" all="">

Seperti ditunjukkan pada Gambar. 9b dan c, pengukuran kolesterol total hati (TC) dan trigliserida hati (TG) mengungkapkan bahwa tikus yang diberi HF memiliki peningkatan kadar kedua lipid dibandingkan dengan tikus yang diberi makan chow normal (yaitu 3.{{4} }kali lipat peningkatan TC, p<0.001; and="" 3.4-fold="" increase="" in="" tg,=""><0.001). simvastatin="" treatment="" significantly="" reduced="" liver="" total="" cholesterol="" levels=""><0.05) but="" not="" triglyceride="" levels.="" on="" the="" other="" hand,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment,="" significantly="" reduced="" both="" liver="" total="" cholesterol="" and="" triglyceride="" levels="" in="" high-fat-fed="" mice.="" when="" comparing="" the="" effects="" among="" all="" groups,="" we="" observed="" no="" significant="" difference="" in="" liver="" total="" cholesterol,="" but="" there="" was="" a="" significant="" reduction="" in="" liver="" tg="" for="" the="" hce="" treatment="" group="" as="" compared="" to="" the="" simvastatin="" treatment="" group="" (fig.="" 9b="" and="">

Penilaian peradangan hati. Pewarnaan imunohistokimia dilakukan untuk menodai keberadaan makrofag (Mac-3) (Gbr. 10a). Analisis imunohistokimia bagian hati mengungkapkan keberadaan Mac-3 pada tikus yang diberi makan tinggi lemak dan normal (warna coklat). Peradangan ini semakin meningkat pada hewan yang diobati dengan simvastatin, meskipun peningkatan tersebut tidak mencapai signifikansi statistik. Menariknya, pengobatan HCE, dengan atau tanpa pengobatan bersama simvastatin secara signifikan mengurangi peradangan pada tikus yang diberi makan tinggi lemak. Ketika membandingkan di antara semua kelompok perlakuan, pengobatan HCE, dengan atau tanpa pengobatan bersama simvastatin juga memiliki peradangan yang secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan kelompok pengobatan simvastatin (hal.<0.001 and=""><0.001, respectively).="" these="" data="" are="" also="" presented="" as="" percentage="" areas="" in="" fig.="">

Lanjut membaca ...