Bagian 3: Echinacoside Terisolasi Dari Cistanche Tubulosa Diduga Merangsang Sekresi Hormon Pertumbuhan Melalui Aktivasi Reseptor Ghrelin
Mar 06, 2022
Echincoside Terisolasi dari Cistanche tubulosa Diduga Merangsang Sekresi Hormon Pertumbuhan melalui Aktivasi Reseptor Ghrelin
Chieh-Ju Wu 1, Mei-Yin Chien 2, Nan-Hei Lin 1, Yi-Chiao Lin 1, Wen-Ying Chen 3, Chao-Hsiang Chen 2,4,* and Jason TC Tzen 1,*
1 Institut Pascasarjana Bioteknologi, Universitas Nasional Chung-Hsing, Taichung 402, Taiwan; baby159357520@gmail.com (C.-JW); CMNHEI@mohw.gov.tw (N.-HL); s9755702@gmail.com (Y.-CL)
2 Ko Da Pharmaceutical Co. Ltd., Taoyuan 324, Taiwan; rd1@koda.com.tw
3 Departemen Kedokteran Hewan, Universitas Nasional Chung-Hsing, Taichung 402, Taiwan; wychen@dragon.nchu.edu.tw
4 Institut Farmakognosi Pascasarjana, Universitas Kedokteran Taipei, Taipei 110, Taiwan
* Korespondensi: gm@koda.com.tw (C.-HC); TCTZEN@dragon.nchu.edu.tw (JTCT); Tel.: plus 886-4-22840328 (ext. 776) (JTCT); Faks: plus 886-4-22853527 (JTCT)
Editor Akademik: Pinarosa Avato
Diterima: 22 Januari 2019; Diterima: 14 Februari 2019; Diterbitkan: 17 Februari 2019
Kontak:{0}}/ WhatsApp: 008618081934791
Abstrak:Bentengspesies, ginseng gurun, telah tercatat memiliki banyak aktivitas biologis dalam farmakope tradisional Cina dan telah digunakan sebagai obat anti-penuaan. Tiga glikosida fenilethanoid—echinacosida, tubuloside A, dan acteoside — terdeteksi dalam ekstrak airBenteng tubulosa(Schenk) R. Wight dan konstituen utama,echinacosida, selanjutnya dimurnikan.echinacosidakonsentrasi yang lebih tinggi dari 10_6 M menunjukkan aktivitas yang signifikan untuk merangsang sekresi hormon pertumbuhan sel-sel hipofisis tikus. Mirip dengan hormon pelepas hormon pertumbuhan-6, analog sintetik ghrelin, stimulasi sekresi hormon pertumbuhan oleh echinacosida dihambat oleh [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-substansi P , agonis kebalikan dari reseptor ghrelin. Pemodelan molekuler menunjukkan bahwa ketiga glikosida fenilethanoid cukup berinteraksi dengan kantong pengikat reseptor ghrelin, dan echinacoside menunjukkan interaksi yang sedikit lebih baik dengan reseptor daripada tubuloside A dan acteoside. Hasilnya menunjukkan bahwa glikosida fenilethanoid, khususnya echinacosida, adalah konstituen aktif yang diduga bertanggung jawab atas efek anti-penuaan C. tubulosa dan dapat dianggap berkembang sebagai analog non-peptidil dari ghrelin.
Kata kunci: cistanchetubulus;echinacosida; ghrelin; sekresi hormon pertumbuhan;feniletanoidglikosida
echinacosidadicistanchememiliki banyak efek
Pls klik di sini untuk Bagian 2
4. Bahan dan Metode
4.1. Bahan Kimia dan Tanaman
Bentengdeserticola YC Ma diperoleh dari pasar lokal dan disahkan oleh Dr. Nan-Hei Lin.Bentengtubulosa (Schenk) R. Wight dibeli dari Sinopharm Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., (Hangzhou, China). Asetonitril, asam format, dan metanol tingkat HPLC dibeli dari ECHO Chemical Co., Ltd, (Miaoli, Taiwan). Media Dulbecco yang dimodifikasi Eagle (DMEM), serum janin sapi yang dialisis (DFBS), dan Trypsin-EDTA dibeli dari Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). DNase Saya dibeli dari Worthington Biochemical (Lakewood, NJ, USA). Hormon pelepas hormon pertumbuhan-6 (GHRP-6) diperoleh dari Gen Way Biotech, Inc. (San Diego, CA, USA). Kolagenase tipe I dan [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-substansi P dibeli dari Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). Kit ELISA hormon pertumbuhan tikus dibeli dari Sunred Biological Technology Corporation (Shanghai, China).
4.2. Analisis HPLC/UV dan LC_MSn dari Ekstraksi Air Cistanche spp.
Batang kering (25 g) dariBentengdeserticola YC Ma orBentengtubulosa (Schenk) R diekstraksi tiga kali dengan 500 mL air suling selama 60 menit pada 50 derajat dalam penangas air. Solusinya disaring melalui Filter Syria 13 mm dengan filter membran PP 0,45 um (Pall Corporation, Glen Cove, NY, USA), dan dikenai analisis berikut. Konstituen kimia dalam ekstrak dianalisis
menggunakan kolom Syncronis C18 (diameter dalam 4,6 × 250 mm, 5 um, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) dalam sistem HPLC yang digabungkan dengan detektor susunan fotodioda model 600E (Waters Corporation,
Milford, MA, AS). Fase gerak terdiri dari (A) air yang mengandung {{0}},1 persen asam format dan (B) asetonitril. Gradien elusi adalah sebagai berikut: 0–60 menit, gradien linier dari 14 persen B; 0–3 menit, 14 persen hingga 17 persen B; 3-4 menit, 17 persen B; 4–15 menit, 17 persen hingga 20 persen B; 15-20 menit, 20 persen B; 20–50 menit, 20 persen hingga 14 persen B; 50–60
menit, 14 persen B. Panjang gelombang deteksi absorbansi ultraviolet (UV) ditetapkan pada 330 nm. Sebuah linear trap quadrupole (LTQ) spektrometer massa tandem (Thermo Electron, San Jose, CA, USA) yang dilengkapi dengan antarmuka ionisasi elektrospray (ESI) dihubungkan ke sistem Surveyor LC (Thermo Electron)
dengan loop sampel 5 uL. Gradien elusi adalah sebagai berikut: 0–90 min, gradien linier dari 14 persen B; 0–24 menit, 14 persen hingga 17 persen B; 24-25 menit, 17 persen B; 25–36 menit, 17 persen hingga 20 persen B; 36–37 menit, 20 persen B; 37–80 menit,
20% to 14% B; 80–90 min, 14% B. The heated capillary temperature was set at 300℃ with a spray voltage of 4.5 kV. Negative ESI mode was firstly scanned ranging from m/z 400–1000. Data-dependent MSN was obtained using the high purity helium (>99,99 persen) sebagai gas tumbukan.
4.3. Isolasi Echincoside
Ekstrak air dari batang kering (25 g) C. tubulosa dipekatkan di bawah tekanan rendah untuk menghasilkan sirup coklat tua. Ekstraksi kasar disuspensikan dengan air suling dan diliofilisasi dengan pengering beku. Bubuk 100 mg dilarutkan dalam air suling 5 mL dan dimurnikan menggunakan kolom Sephadex LH-20 (100 mL; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Swedia) dielusi dengan larutan metanol 10 persen dan dipantau dengan HPLC . Fraksi yang mengandung echinacosida dideteksi dengan membaca absorbansi pada 245 nm dan dipanen dengan menggunakan autosampler.
4.4. Hewan
Eksperimen tersebut disetujui oleh Institutional Animal Care and Use Committee of the National Chung_Hsing University dengan nomor persetujuan IACUC 106-079. Tikus Sprague jantan_Dawley dengan berat 250_300 g dibeli dari BioLASCO, Taiwan Co., Ltd. (Taipei, Taiwan). Dua hewan per kandang dipelihara dalam lingkungan yang terkendali 23 o2, 60 o 10 persen kelembaban, dan siklus terang/gelap 12 jam. Tikus diberi makan dengan diet chow standar (kalori disediakan
dengan 28,7 persen protein, 13,4 persen lemak, dan 57,9 persen karbohidrat, 5001 Rodent LabDiet, St. Louis, MO, USA) dan air suling ad libitum.
4.5. Kultur Sel Hipofisis Primer
Sel-sel hipofisis diisolasi menurut metode dispersi enzimatik yang dimodifikasi yang dikembangkan oleh Yamazaki et al. [29]. Singkat cerita, tikus jantan Sprague Dawley dibius dengan Zoletil 50 (40 mg/kg, IP; Virbac Laboratories, Carros, France), dan kelenjar hipofisis anterior dikeluarkan dan disebarkan ke sel kultur hipofisis dalam suspensi, seperti yang dijelaskan sebelumnya [30].
4.6. Uji Sekresi Hormon Pertumbuhan
Sel-sel hipofisis anterior primer 4 × 104 sel/sumur dikultur pada 37 derajat di bawah 5 persen CO2 selama 2 hari sebelum uji sekresi hormon pertumbuhan sesuai dengan protokol yang dijelaskan sebelumnya [30].
Setelah pemindahan media kultur, sel-sel dibiarkan kelaparan dalam medium Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) bebas serum selama 90 menit untuk menstabilkan sekresi hormon basal. Media kelaparan diganti dengan DMEM segar yang mengandung echinacoside (dari 10_8 ke 10_5 M) atau GHRP-6 (agonis reseptor ghrelin manusia, GHSR, 10_7 M) sebagai kontrol positif, dan sel diinkubasi selama 15 dan 30 menit pada 37 derajat di bawah 5 persen CO2. Untuk mendeteksi efek antagonis, sel diinkubasi dengan GHSR
agonis terbalik, [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-zat P (0.5 uM), dan kemudian diobati dengan DMEM yang mengandung echinacoside (10_5 M) atau GHRP-6 (10_7 M) selama 30 menit. Media dikumpulkan untuk
penentuan sekresi hormon pertumbuhan oleh kit ELISA hormon pertumbuhan tikus (Shanghai Sunred Biological Technology Corporation).
4.7. Analisis statistik
Data disajikan sebagai nilai rata-rata o SD. Perbedaan dianalisis dengan T-Test. Perhitungan statistik dilakukan oleh GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Tingkat p < 0.05="" dianggap="" signifikan="" secara="">
4.8. Pemodelan Homologi dan Docking
Pemodelan homologi dan docking ke reseptor ghrelin manusia, reseptor secretagogue hormon pertumbuhan (GHSR, nomor aksesi AAI13548), didirikan dengan mengikuti konstruksi kami sebelumnya [21,24]. Singkatnya, struktur kristal dari 1 dan 2 reseptor adrenergik (PDB 2YCY dan 3PDS) dengan ligan terikat, cyanopindolol, dan FAUC50 digunakan sebagai template untuk membangun struktur GHSR [31,32]. Struktur GHSR dengan energi total PDF terendah dipilih untuk docking lebih lanjut dengan GHRP-6, echinacoside, tubuloside A, dan acteoside. Semua proses pemodelan dilakukan menggunakan platform Discovery Studio 2.1 (http://accelrys.com/).
Struktur 3D GHRP-6 diunduh dari database gabungan Pub-Chem di situs web NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Struktur 3D echinacoside, tubuloside A, dan acteoside dibangun menggunakan program Chem3D (http://www.cambridgesoft.com/). Situs pengikatan ligan GHSR didefinisikan sebagai ruang bola dengan radius 14 dari pusat kantong pengikat dalam simulasi docking. Docking GHRP-6, echinacoside, tubuloside A, atau acteoside ke situs pengikatan GHSR dilakukan secara in silico dengan menggunakan modul LibDock dalam paket Discover Studio 2.1 dan selanjutnya diminimalkan dengan algoritme perkecil cerdas dengan medan gaya CHARMm di Paket Discover Studio 2.1 [33]. Untuk membandingkan afinitas pengikatan relatif echinacoside, tubuloside A, dan acteoside di GHSR, area pusat aktif yang dibangun dengan GHRP-6 di GHSR digunakan untuk docking, dan energi pengikatan dihitung oleh GEMDOCK (The Institute of Bioinformatics , Universitas Nasional Chiao Tung, Taiwan).
Kontribusi Penulis: Eksperimen hewan, C.-JW, Y.-CL, dan W.-YC; Identifikasi dan pemurnian: MY.C., N.-HL, dan C.-HC; Pemodelan molekul: C.-JW, Y.-CL, dan JTCT; Desain dan penulisan proyek: C.-HC dan JTCT
Pendanaan: Pekerjaan ini sebagian didukung oleh hibah kepada Jason TC Tzen dari National Chung-Hsing University (NCHU-102D604).
Ucapan Terima Kasih: Penulis berterima kasih kepada Tian-Shun Weng karena telah berbagi pengalaman profesionalnya dalam penggunaan spesies Cistanche.
Konflik Kepentingan: Semua penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan.
Referensi
1. Wang, T.; Zhang, X.; Xie, W. Cistanche deserticola YC Ma, "Ginseng gurun": Sebuah ulasan. Saya. J.Cin. Med. 2012,40, 1123-1141. [CrossRef] [PubMed]
2. Wang, T.; Chen, C.; Yang, M.; Deng, B.; Kirby, MG; Zhang, X. Cistanche tubulosa ekstrak etanol memediasi kadar hormon seks tikus dengan induksi enzim steroidogenik testis. Farmasi. Biol. 2016, 54, 481–487. [CrossRef] [PubMed]
3. Lin, WY; Chun, Y.; Jack, C.; Kao, ST; Tsai, FJ; Liu, Jalur Molekuler HP terkait dengan promosi umur panjang dan peningkatan kognitif Cistanche tubulosa di Drosophila. Fitomedika 2017, 26, 37–44. [CrossRef]
4. Wu, CR; Lin, HC; Su, MH Pembalikan oleh ekstrak air Cistanche tubulosa dari defisit perilaku pada model tikus seperti penyakit Alzheimer: Relevansi untuk deposisi amiloid dan fungsi neurotransmitter sentral. Pelengkap BMC. Alternatif Med. 2014, 14, 202. [CrossRef]
5. Xuan, GD; Liu, CQ Penelitian tentang efek glikosida fenilethanoid (PEG) dari Cistanche deserticola pada anti-penuaan pada tikus tua yang diinduksi oleh D-galaktosa. Zhong Yao Cai 2008, 31, 1385–1388. [PubMed]
6. Jiang, Y.; Tu, PF Analisis konstituen kimia dalam spesies Cistanche. J. Kromatografi. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]
7. Gao, C.; Wang, C.; Wu, G. Cistanche total glikosida pada pengaruh vaskular demensia tikus belajar dan memori dan penelitian mekanisme. Dagu. Herba. Med. 2005, 36, 1852–1855.
8. Li, F.; Yang, Y.; Zhu, P.; Chen, W.; Qi, D.; Shi, X.; Zhang, C.; Yang, Z.; Li, P. Echincoside mendorong regenerasi tulang dengan meningkatkan rasio OPG/RANKL dalam sel MC3T3-E1. Fitoterapia 2012, 83, 1443–1450. [CrossRef]
9. Shimoda, H.; Tanaka, J.; Takahara, Y.; Takemoto, K.; Shan, SJ; Su, MH Efek hipokolesterolemia ekstrak Cistanche tubulosa, obat mentah tradisional Cina, pada tikus. Saya. J.Cin. Med. 2009, 37, 1125-1138. [CrossRef]
10. Tang, F.; Hao, Y.; Zhang, X.; Qin, J. Pengaruh echinacosida pada fibrosis ginjal dengan menghambat jalur pensinyalan TGF- 1/Smads dalam model tikus DB/DB nefropati diabetik. Obat Des. Kembangkan Ada. 2017, 11.2813–2826. [CrossRef]
11. Xiong, WT; Gu, L.; Wang, C.; Matahari, HX; Liu, X. Efek anti-hiperglikemik dan hipolipidemik Cistanche tubulosa pada tikus DB/DB diabetes tipe 2. J. Etnofarmaka. 2013, 150, 935–945. [CrossRef] [PubMed]
12. Bao, XX; Bu, HH; Ding, H.; Li, WW; Zhu, M. Optimalisasi awal formula obat herbal Cina berdasarkan efek neuroprotektif pada model tikus dari penyakit Parkinson yang diinduksi rotenone. J. Integrasi Med. 2018, 16, 290–296. [CrossRef] [PubMed]
13. Kojima, M.; Hosoda, H.; Tanggal, Y.; Nakazato, M.; Matsuo, H.; Kanagawa, K. Ghrelin adalah peptida terasilasi pelepas hormon pertumbuhan dari perut. Alam 1999, 402, 656–660. [CrossRef] [PubMed]
14. Zigman, JM; Jones, JE; Lee, CE; Saper, CB; Elmquist, JK Ekspresi mRNA reseptor ghrelin di otak tikus dan tikus. J.Kom. saraf. 2006, 494, 528–548. [CrossRef] [PubMed]
15. Castaneda, TR; Tong, J.; Datta, R.; Culler, M.; Tschop, MH Ghrelin dalam pengaturan berat badan dan metabolisme. Depan. Neuroendokrinol. 2010, 31, 44–60. [CrossRef] [PubMed]
16. Rudman, D.; Penebang, AG; Nagraj, HS; Jerman, GA; Lalitha, PY; Goldberg, AS; Schlenker, RA; Cohn, L.; Rudman, IW; Mattson, DE Efek hormon pertumbuhan manusia pada pria di atas 60 tahun. N. Inggris. J. Med. 1990, 323, 1–6. [CrossRef] [PubMed]
17. Liu, H.; Bravata, DM; Olkin, saya.; Nayak, S.; Roberts, B.; Garber, AM; Hoffman, AR Tinjauan sistematis: Keamanan dan kemanjuran hormon pertumbuhan pada orang tua yang sehat. Ann. magang. Med. 2007, 146, 104–115. [CrossRef] [PubMed]
18. Giordano, R.; Bonelli, L.; Marinazzo, E.; Ghigo, E.; Arviat, E. Pengobatan hormon pertumbuhan pada penuaan manusia: Manfaat dan risiko. Hormon 2008, 7, 133–139. [CrossRef] [PubMed]
19. Sattler, FR Hormon pertumbuhan pada pria yang menua. Praktik Terbaik. Res. klinik Endokrinol. 2013, 27, 541–555. [CrossRef]
20. Nah, YH; Chen, YJ; Chang, CI; Lin, YW; Chen, CY; Lee, MR; Lee, VS; Tzen, JTC Teaghrelins, tetraglikosida flavonoid terasilasi unik dalam teh oolong Chin-shin, diduga merupakan agonis oral dari reseptor ghrelin.
J. Pertanian. Kimia Makanan. 2014, 62, 5085–5091. [CrossRef]
21. Hsieh, SK; Lihat, YH; Wu, CC; Chung, TY; Tzen, JTC Identifikasi intermediet biosintetik teaghrelins dan senyawa mirip teaghrelin dalam teh oolong, dan ikatan molekulnya ke reseptor ghrelin.
J. Makanan Obat Anal. 2015, 23, 660–670. [CrossRef]
22. Hsieh, SK; Chung, TY; Li, YC; Lihat, YH; Lin, NH; Kuo, PC; Chen, WY; Tzen, JTC Ginkgoghrelins, glikosida flavonoid terasilasi unik di Folium Ginkgo, merangsang sekresi hormon pertumbuhan melalui aktivasi reseptor ghrelin. J. Etnofarmaka. 2016, 193, 237–247. [CrossRef]
23. Han, L.; Mavis, OLEH; Liu, E.; Zhang, Y.; Li, W.; Lagu, X.; Fu, F.; Gao, X. Karakterisasi struktural dan identifikasi glikosida fenilethanoid dari Cistanches deserticola YC Ma oleh UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS. fitokimia. dubur. 2012, 23, 668–676. [CrossRef]
24. Lu, D.; Zhang, J.; Yang, Z.; Liu, H.; Li, S.; Wu, B.; Ma, Z. Analisis kuantitatif Cistanches Herba menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi yang digabungkan dengan deteksi susunan dioda dan spektrometri massa resolusi tinggi yang dikombinasikan dengan metode kemometrik. J.Sep.Sci. 2013, 36, 1945-1952. [CrossRef]
25. Bulan, M.; Kim, HG; Hwang, L.; Seo, JH; Kim, S.; Hwang, S.; Kim, S.; Lee, D.; Chung, H.; Oh, MS; dkk. Efek neuroprotektif ghrelin dalam model tikus 1-metil-4-fenil-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine penyakit Parkinson dengan memblokir aktivasi mikroglial. Neurotoks. Res. 2009, 15, 332–347. [CrossRef]
26. Lupien, SJ; Isabelle, OM; Hupbach, A.; Tu, MT; Bus, C.; Pejalan, D.; Pruessner, J.; Mcewen, BS Melampaui konsep stres: Beban allostatik-A perspektif biologis dan kognitif perkembangan. Dalam Psikopatologi Perkembangan: Volume Dua: Ilmu Saraf Perkembangan; John Wiley & Sons, Inc.: New York, NY, AS, 2015; hal.578–628.
27. Rizzo, M.; Rizvi, AA; Sudar, E.; Soski, S.; Obradovic, M.; Montalto, G.; Boutjdir, M.; Mikhailidis, DP; Isenovic, ER Sebuah tinjauan tentang efek kardiovaskular dan anti-aterogenik ghrelin. Curr. Farmasi. Des. 2013, 19, 4953–4963. [CrossRef]
28. Holst, B.; Lang, M.; Brandt, E.; Bach, A.; Howard, A.; Frimurer, TM; Beck-Sickinger, A.; Schwartz, TW Agonis terbalik reseptor Ghrelin: Identifikasi inti peptida aktif dan epitop interaksinya pada reseptor. mol. farmasi. 2006, 70, 936–946. [CrossRef]
29. Yamazaki, M.; Nakamura, K.; Kobayashi, H.; Matsubara, M.; Hayashi, Y.; Kanagawa, K.; Sakai, T. Regulasi efek ghrelin pada sekresi hormon pertumbuhan dari sel-sel hipofisis anterior tikus perfusi. J. Neuroendokrinol. 2002, 14, 156-162. [CrossRef]
30. Nah, YH; Chen, YJ; Chung, TY; Lin, NH; Chen, WY; Chen, CY; Lee, MR; Chou, CC; Tzen, JTC Emoghrelin, turunan emodin unik di Heshouwu, merangsang sekresi hormon pertumbuhan melalui aktivasi reseptor ghrelin. J. Etnofarmaka. 2015, 159, 1–8. [CrossRef]
31. Moukhametzianov, R.; Warne, T.; Edwards, PC; Serrano-Vega, MJ; Leslie, AG; Tata, CG; Schertler, GF Dua konformasi berbeda dari helix 6 diamati pada struktur terikat antagonis dari reseptor adrenergik 1-. Prok. Natal akad. Sci. AS 2011, 108, 8228–8232. [CrossRef]
32. Rosenbaum, DM; Zhang, C.; Lyons, JA; Hol, R.; Aragao, D.; Panah, DH; Rasmussen, SG; Choi, HJ; Devree, BT; Sunahara, RK; dkk. Struktur dan fungsi kompleks adrenoseptor agonis-beta (2) yang ireversibel. Alam 2011, 469, 236–240. [CrossRef]
33. Brooks, BR; Bruccoleri, RE; Olafson, BD; Serikat, DJ; Swaminathan, S.; Karplus, M. CHARMM—Program untuk perhitungan energi makromolekul, minimisasi, dan dinamika. J. Hitung. Kimia 1983, 4, 187–217. [CrossRef]
