Bagian 1: Cistanoside Of Cistanche Herba Memperbaiki Kerusakan Reproduksi Pria yang Diinduksi Hipoksia Melalui Penekanan Stres Oksidatif
Mar 26, 2022
Kontak:{0}}/ WhatsApp: 008618081934791
Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, HeWang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1
Abstrak:Semakin banyak bukti menunjukkan bahwa hipoksia adalah penyebab infertilitas pria, dan hipoksia mungkin terkait dengan stres oksidatif (OS). Cistanoside (Cis) adalah senyawa glikosida fenilethanoid yang dapat diekstraksi dari CistanchesHerba dan memiliki berbagai fungsi biologis. Penelitian ini bertujuan untuk menyelidiki efek perlindungan Cis terhadap kerusakan reproduksi yang disebabkan oleh hipoksia dan mengeksplorasi mekanisme spesifik yang mendasarinya. Model eksperimental hipoksia sel dan hewan dibangun, dan efek perlindungan dari subtipe Cis yang berbeda pada sistem reproduksi pria dinilai baik secara in vitro maupun in vivo. Hasilnya menunjukkan bahwa hipoksia secara signifikan mengurangi kelangsungan hidup sel GC-1 melalui penghentian siklus sel dan aktivasi apoptosis, yang dikaitkan dengan peningkatan OS. Selain itu, Cis menunjukkan efek antioksidan yang kuat baik secara in vitro maupun in vivo, secara signifikan memulihkan aktivitas enzim antioksidan. dan menurunkan tingkat spesies oksigen reaktif (ROS) sambil meningkatkan viabilitas sel dan menurunkan apoptosis. Yang penting, subtipe Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C, dan Cis-H) yang dipelajari di sini semuanya menunjukkan efek antioksidan tertentu, di antaranya efek Cis-B adalah yang paling signifikan. Studi ini menunjukkan bahwa Cis secara nyata melemahkan efek berbahaya dari OS yang diinduksi hipoksia dengan memengaruhi aktivitas enzim antioksidan di testis dan sel GC-1.
Kata kunci: Cistanoside, hipoksia hipobarik, infertilitas pria, stres oksidatif, perlindungan reproduksi
tanaman cistanche segar
pengantar
Saat ini, sekitar 48,5 juta (15 persen) pasangan usia reproduksi di seluruh dunia terkena infertilitas [1], di antaranya 40-50 persen kasus dianggap berasal dari infertilitas pria [2], suatu kondisi yang sangat terkait dengan lingkungan dan gaya hidup. faktor. Bukti menunjukkan bahwa kerentanan testis mamalia terhadap tekanan oksigen rendah merupakan faktor penyebab beberapa bentuk infertilitas pria [3]. Seperti yang ditunjukkan dalam penelitian sebelumnya, spermatogenesis terganggu dan berkurang saat terpapar hipoksia hipobarik [4-7].
Untuk mengeksplorasi mekanisme yang mendasari, penelitian telah menunjukkan bahwa paparan hipoksia hipobarik meningkatkan produksi spesies oksigen reaktif (ROS) [8, 9]. ROS memainkan peran penting dalam sistem reproduksi pria. Pada tingkat rendah, mereka diperlukan untuk kapasitasi sperma, reaksi akrosom, dan fusi spermatozoa-oosit[10]. Namun, ROS yang berlebihan dapat menyebabkan kerusakan DNA spermnuklear/mitokondria dan kerusakan peroksidatif membran plasma, yang pada gilirannya merupakan faktor etiologi utama untuk peningkatan risiko infertilitas pria [11, 12]. Dengan demikian, akumulasi ROS yang diinduksi hipoksia mungkin menjadi salah satu penyebab infertilitas pria.
Cistanches Herba, tanaman obat parasit abadi, tersebar luas di daerah kering [13] dan digunakan secara luas karena aktivitas farmakologisnya [14-17]. Di antara semua kandungan efektif Cistanches Herba, PhGs telah dianggap sebagai komponen aktif utama. Sampai saat ini, 34 PhGs telah diisolasi dari tanaman Cistanches [13]. Cistanoside (Cis), PhG anaktif yang diisolasi dari Cistanches Herba, telah mendapat perhatian karena efek antioksidannya.
Mempertimbangkan efek antioksidan Cis dan peran ROS dalam infertilitas pria yang diinduksi hipoksia, Cis dianggap sebagai kandidat obat potensial untuk pengobatan infertilitas pria yang diinduksi hipoksia. Namun, beberapa laporan telah membahas efek antioksidan Cis yang diekstraksi dari Cistanches Herba dalam pengobatan infertilitas pria yang diinduksi hipoksia atau jalur pensinyalan yang terlibat. Dalam studi ini, model eksperimental hipoksia in vitro, dan in vivo dibangun dan komponen efek dari Cis yang berbeda dinilai.
Cistanche memilikiefek produksi reproduksi.
Bahan dan metode
Kultur sel dan reagen
Garis sel spermatogonia tikus GC-1spg(GC-1) dibeli dari American TypeCulture Collection (ATCC) dan dibiakkan di DMEM(Invitrogen, USA) yang dilengkapi dengan 10 persen serum fetalbovine, 1 persen L- glutamin (100 mM), penisilin (100 U/mL), dan streptomisin (100 ug/mL) pada 37 derajat dalam inkubator yang dilembabkan dengan 5 persen CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) dibeli dari Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Cina).
Uji viabilitas sel
Viabilitas sel diuji dengan alat penghitungan sel{{0}}assay (CCK-8). Singkatnya, sel-sel GC-1 diunggulkan ke dalam 96-pelat sumur pada 1,5 × 103 per sumur dan dikultur pada suhu 37 derajat selama 24 jam. Kemudian, sel-sel diperlakukan dengan konsentrasi yang berbeda (20 persen ,15 persen , 10 persen , 5 persen ) oksigen atau konsentrasi yang berbeda (2 M, 0.2 M, 0.02 M) dari Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C , Cis-H) untuk waktu yang dibutuhkan. Kemudian, supernatan dibuang, dan viabilitas sel dideteksi menggunakan kit CCK-8 (DojindoJapan). Absorbansi masing-masing sumur diukur pada 450 nm menggunakan pembaca lempeng mikro (BioRad USA). Akhirnya, viabilitas sel dihitung menurut rumus berikut:
Viabilitas sel=(Grup eksperimen - grup ODblank)/(Grup kontrol OD - grup ODblank) × 100 persen .
Analisis Western blot
Sel atau jaringan yang dipanen dihomogenisasi dalam buffer RIPA untuk mengekstrak protein (RIPA BeyotimeCina; Koktail Roche Swiss). Supernatan dikumpulkan, dan konsentrasi protein diuji dengan metode BCA (Beyotime). Sekitar 40 ug protein yang diekstraksi dari setiap sampel dipisahkan oleh SDS-PAGE dan ditransfer secara elektro ke membran filter nitroselulosa (NC) (BeyotimeChina). Membran filter NC diblokir dengan 5 persen susu tanpa lemak selama 1,5 jam dan diinkubasi dengan antibodi spesifik (anti-PARP 1:1000, anti-Caspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax1: 1000, anti-GAPDH 1:1000; semua antibodi dibeli dari Cell Signaling Technology, USA) semalaman pada 4 derajat. Kemudian, semua membran NC diinkubasi dengan antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase lobak yang sesuai selama 1,5 jam pada suhu kamar dan dicitrakan dengan sistem pencitraan (Tannon, Cina).
suplemen bubuk ekstrak cistanche
Deteksi siklus sel
Sebuah uji aliran cytometric (FCM) dilakukan untuk menganalisis siklus sel. Sel diperlakukan dalam kondisi yang berbeda selama 72 jam dan dipanen. Sel-sel kemudian dicuci dengan PBS, difiksasi dalam etanol 75 persen, dan diwarnai dengan propidiumiodide (PI). Untuk setiap sampel, 1 × 104 sel dikumpulkan dan dianalisis dengan flow cytometry (FACSCalibur, BD Biosciences). Kemudian, proporsi sel fase G1/S/G2 dan indeks proliferasi [Fase(S plus G2)/Fase (G1 plus S plus G2) × 100 persen ] dihitung.
Ki{} pewarnaan
Sel dikultur dalam cawan confocal dan dirawat dengan hipoksia atau subtipe Cis yang berbeda selama 72 jam. Setelah memperbaiki semua sel dengan 4 persen paraformaldehyde, mereka diinkubasi dengan anti-Ki-67 anti-body (1:200, Cell Signaling Technology). Kemudian, semua sel diinkubasi dengan antibodi IgG anti-kelinci terkonjugasi CY-3-yang sesuai (1:200, Boster, China) dan larutan DAPI (1,0ug/mL, Beyotime). Fluoresensi diamati dengan mikroskop confocal Fluoview FV1000 (Olympus, Jepang).
Deteksi ROS
FCM diperkenalkan untuk mengukur level ROS intraseluler menggunakan DCFH-DA. Sel-sel tersuspensi diunggulkan di 6-piring sumur dan mengalami perlakuan yang berbeda. Setelah 72 jam pengobatan, sel-sel disuspensikan dalam DMEM bebas serum dengan 10 M DCFH-DA (Beyotime). Kandungan ROS kemudian ditentukan dengan penyortiran sel yang diaktifkan fluoresensi pada Sistem Sitometri Aliran Beckman Coulter dengan panjang gelombang eksitasi 488nm dan panjang gelombang emisi 525 nm [18].
Penentuan Lipid Peroxidation (LPO)
Uji zat reaktif asam tiobarbiturat (TBARS) dilakukan untuk mendeteksi LPO. Semua langkah operasi dilakukan sesuai dengan instruksi (Sigma USA). Konsentrasi dihitung menggunakan koefisien kepunahan molar 1,56x105/(M·cm), yang diperoleh menggunakan malondialdehid sebagai standar. Hasilnya dinyatakan sebagai nmol setara MDA/mg protein.
Penentuan aktivitas enzim
Aktivitas enzim diuji menggunakan assay kit yang meliputi glutathione reductase (GR), glutathione peroxidase (GPx), dan superoxide dismutase (SOD). Semua langkah operasi dilakukan sesuai dengan instruksi yang disediakan (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute China).
Hewan dan protokol eksperimental
Tikus Wistar jantan dewasa (180-220 g, 8 w tua) diperoleh dari pusat hewan Universitas Kedokteran Militer Keempat, Xi'an, Cina. Izin untuk penggunaan hewan diperoleh dari Komite Etika Universitas (Nomor referensi : 20190506). Eksperimen hewan dilakukan sesuai dengan pedoman universitas untuk perawatan dan penggunaan hewan laboratorium.
Semua tikus dibiarkan beradaptasi selama kurang lebih satu minggu sebelum dimulainya percobaan. Setelah aklimasi, tikus dibagi secara acak menjadi 6 kelompok dengan masing-masing kelompok 5 ekor. Tikus dalam kelompok kontrol dibesarkan di bawah tekanan normal (PO2: 20 persen; tekanan udara: 101,3 kPa), sedangkan tikus dalam model dan kelompok Cistreated dibesarkan di ruang oksigen bertekanan rendah (tekanan internal 61,6 kPa, setara dengan ketinggian 4000 meter di atas permukaan laut; PO2: 14,55 persen) untuk mensimulasikan lingkungan hipoksia ketinggian tinggi. Semua tikus memiliki akses bebas ke makanan dan air dalam kandang plastik pada suhu 22±2 derajat dan kondisi kelembaban dengan siklus terang/gelap 12-jam otomatis. Tikus dalam model dan kelompok perlakuan Cis tetap dalam kondisi hipobarik tetapi dipindahkan ke kondisi tonormobarik setiap 96 jam, di mana makanan dan air diberikan kepada mereka dan kandang dibersihkan. Durasi transisi dari hipobarik ke hipobarik adalah sekitar 2 jam. Semua kelompok perlakuan diperlakukan dengan Cis yang sesuai (8 mg/kg/hari) melalui gavage oral selama 8 minggu, sedangkan tikus kontrol dan model diperlakukan dengan volume air yang sama.
Setelah 8 minggu, tikus dikorbankan dengan anestesi. Testis, epididimis, dan vesikula seminalis dipisahkan dan ditimbang, dan indeks organ dihitung menurut rumus berikut: (berat organ/berat hewan) ×100 persen . Selanjutnya, sperma di epididimis dikumpulkan, dan motilitas dan aktivitas akrosomnya diuji. Demikian pula, jaringan testis dikumpulkan untuk studi histopatologi dan ROS, LPO, dan deteksi aktivitas enzim antioksidan.
Evaluasi tingkat sperma hidup
Epididimis diinsisi dengan gunting bedah, dan suspensi sperma disiapkan dalam salin normal. Untuk mengevaluasi tingkat sperma hidup, 5 L suspensi sperma dicampur dengan hati-hati dengan volume eosin-Ystain yang sama. Sperma kemudian dihitung di bawah mikroskop cahaya. Tingkat sperma hidup dinilai dengan menghitung sperma bernoda (sperma mati) dan tidak bernoda (sperma hidup).
Bubuk Cistanche tubulosameningkatkantingkat sperma hidup.
Untuk informasi lebih lanjut, silakan klik di sini.
Penentuan aktivitas enzim akrosom sperma
Uji aktivitas enzim akrosom sperma digunakan untuk mengevaluasi enzim akrosom sperma [19]. Hasil di setiap kelompok dihitung dengan menggunakan rumus berikut: Aktivitas enzim akrosom (μIU)=(Grup eksperimen ODE - grup ODBlank)/(247,5×10) × 106.
Analisis statistik
Semua data kuantitatif dinyatakan sebagai mean± SD dan dianalisis menggunakan perangkat lunak SPSS 22.0. Uji-t Independent Student digunakan untuk membandingkan data antara dua kelompok. *P< 0.05="" and="" **p="" <="" 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">
