Rezim Vaksinasi Chlamydia Trachomatis multi-komponen Prime-boost Menginduksi Respons Antibodi Dan Sel T Dan Mempercepat Pembersihan Infeksi pada Model Primata Non-manusia Ⅱ

Bahan dan metode

Antigen vaksin dan bahan pembantu

Antigen dan adjuvan vaksin yang berbeda digunakan dalam penelitian ini: antigen vaksin CTH522, berdasarkan MOMP (11) diberikan melalui rute intramuskular (IM) dengan adjuvan CAF01 (42) atau Aluminium hidroksida (AlOH), atau melalui rute intranasal ( DI) tanpa bahan pembantu. Vaksin DNA plasmid, pcDNA3.1-MOMP, dibuat dengan mengkloning MOMP konsensus ke dalam vektor plasmid pcDNA3.1 (14) dan diadministrasikan melalui rute intra-dermal (ID) dengan elektroporasi (EP) di belakang. Vaksin Human Adenovirus serotipe 5 (rHuAd5) rekombinan yang mengekspresikan MOMP (HuAd5-MOMP) dibuat dengan menggabungkan kembali konsensus MOMP (AAC45154.1) secara homolog menjadi vektor plasmid pAL1112 HuAd5 E1 dan E2 yang dihapus dan diberikan melalui rute intramuskuler (14) . Vaksin modifikasi Vaksin Ankara-MOMP dibuat olehmenggabungkan kembali MOMP konsensus(AAC45154.1) ke dalam plasmid p3186 dan vektor MVA yang dilemahkan (14), dan diberikan melaluirute intramuskular.

Klik Di Sini Untuk Mendapatkan Cistanche Untuk Anti-inflamasi

C. trachomatis serovar stok D

Chlamydia trachomatis serovar D (Ct SvD; UW{{0}}/Cx, ATCC® VR-885™) diperoleh dari American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) dan disebarkan di HeLa{ {2}} sel, dipanen, dan dimurnikan seperti yang dijelaskan oleh Caldwell et al. (43). Stok C. trachomatis SvD disimpan pada -80 derajat dalam 0,2 M sukrosa, 20 mM natrium fosfat (pH 7,4), dan 5 mM asam glutamat (SPG) dan konsentrasi unit pembentuk inklusi (IFU) ditentukan dalam Sel HeLa-229 dan sel McCoy.

Primata non-manusia

Tiga puluh kera cynomolgus (Macaca fascicularis) dengan berat 3 hingga 5 kg dimasukkan dalam penelitian yang ditangani di fasilitas NHP biosafety level 3 (ABSL3) IDMIT ("Infectious Disease Models and Innovative Therapies" di CEA "Commissariat à l'Energie Atomique," Fontenay-aux-Roses, Prancis; akreditasi no. #D92- 032-02). Protokol disetujui oleh komite etik kelembagaan "Comité d'Ethique en Expé rimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) di bawah pernyataan nomor A14-026. Studi ini disahkan oleh "Kementerian Riset, Inovasi, dan Pendidikan" dengan nomor registrasi APAFIS#720-201505281237660. Semua hewan diuji negatif untuk SIV, SHIV, STLV (simian Tlymphotropic virus), virus herpes B, filovirus, SRV-1, SRV-2 sebelum penelitian dan dipastikan seronegatif untuk infeksi Chlamydia. Semua prosedur eksperimental dilakukan sesuai dengan pedoman Eropa untuk perawatan hewan ("Journal Officiel de l'Union Europe enne", petunjuk 2010/63/ UE, 22 September 2010).

Protokol vaksinasi

3 kera0 dibagi secara acak menjadi 6 kelompok dengan masing-masing 5 hewan. Regimen pendorong utama vaksinasi yang berbeda untuk 6 kelompok diilustrasikan secara rinci pada Gambar 1. Selama semua vaksinasi, kera dibius dengan ketamin klorhidrat (10 mg/kg berat badan secara intramuskuler). CTH522 (85 µg per hewan) diberikan melalui rute intramuskular (IM) dengan CAF{{20}}1 adjuvant (625 µg/125 µg) atau adjuvant AlOH (0.425 mg ), seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1. Imunisasi IM dilakukan dalam volume 0,6 ml di paha kanan (M. quadriceps) hewan. Imunisasi CTH522 Intranasal (IN) (30 µg per hewan) dilakukan dengan perangkat Vaxinator yang terhubung ke jarum suntik 1 ml dengan dua pemberian berturut-turut 0,25 ml, satu di setiap lubang hidung. Vaksin DNA-MOMP diberikan melalui rute intradermal (ID) dengan elektroporasi (EP) pada kulit punggung. 6 volume berulang 0,1 ml disuntikkan ID (total 1 mg) diikuti oleh EP menggunakan sistem Nepagen™ (pengaturan: 6 pulsa peralatan persegi 10 ms dengan interval 90 ms pada 110V, (300- 700mA)) . Vaksin hAd5-MOMP diberikan IM dengan dosis 1011 partikel virus dalam 1 ml per hewan. Vaksin MVA-MOMP diberikan secara IM dengan dosis 4*108 PFU per hewan dalam volume 0,5 ml**. Kelompok naif tidak diberikan vaksinasi apapun dan dianggap sebagai kelompok kontrol.

Pengumpulan sampel

Selama semua prosedur pengambilan sampel, kera dibius dengan ketamin klorhidrat (10 mg/kg berat badan IM). Darah dikumpulkan melalui venipuncture femoralis pada minggu ke 0, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 18, 20, 22, 24. Cairan serviks untuk deteksi antibodi dikumpulkan dengan Weck-Cel®spears (Medtronic Ophthalmics, Jacksonville, FL , USA) pada minggu ke 4, 8, 16, 18, 20, 22 dan 24. Sampel serviks untuk deteksi beban klamidia dikumpulkan dengan swab flatlock biasa (Mast Diagnostic - ref.: 552C/ 10). Setelah kontak dengan mukosa vagino-serviks, swab ditempatkan dalam vial yang berisi media UTM-RT (Mast Diagnostic – ref.: 330C/6) dan disimpan di dalam es.

Infeksi tantangan vagina dengan 5*107 IFUs dari C. trachomatis SvD

Hewan-hewan itu dibius dengan ketamine chlorhydrate (10 mg / kg IM), ditempatkan dalam posisi ventral dengan pinggul ditinggikan dan 1 ml inokulum secara traumatis dioleskan langsung ke mukosa vagina pada transisi vagino-serviks menggunakan jarum suntik 1 ml. Dosis 5*107 IFU diberikan kepada setiap hewan. Hewan itu dibiarkan tetap berbaring di perut dengan pinggulnya ditinggikan untuk waktu yang singkat setelah inokulasi.

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

CTH522antibodi spesifikdalam sampel serum dan swab terdeteksi dengan ELISA tidak langsung. Pelat Maxisorp® (NUNC A/S, Roskilde, Denmark) dilapisi dengan CTH522 (0.5 µg/ml) semalaman pada suhu 4 derajat . Isotipe IgG dan IgA terdeteksi dengan antibodi terkonjugasi HRP yang spesifik terhadap IgG primata non-manusia (43R-IG020HRP, Fitzgerald, Acton, MA, USA, 1:75.{{10 }}) dan IgA (43C-CB1631, Fitzgerald, AS, 1:50.000). Reaksi divisualisasikan dengan substrat TMB PLUS (KemEnTec, Taastrup, Denmark) dan dihentikan dengan asam sulfat 0,5 M. Pelat dibaca pada pembaca ELISA pada 450 nm dengan koreksi pada 650 nm. Kontrol positif (serum dari penelitian sebelumnya) digunakan sebagai standar internal untuk mengoreksi variasi pelat ke pelat. Dua sumur dijalankan tanpa substrat sebagai kontrol negatif pada setiap pelat. Titer antibodi dihitung sebagai kebalikan dari pengenceran tertinggi dengan nilai optical density (OD) lebih tinggi dari cut-off. Cut-off ditentukan dari rata-rata sampel hari ke-0 ditambah 2*SD.

Susunan dan analisis peptida

Susunan peptida CTH522 dirancang dengan rangkap tiga peptida 15mer amobil yang tumpang tindih dengan 14 asam amino yang dicetak pada slide kaca yang difungsikan dan diinkubasi dengan sampel serum oleh JPT Peptide Technologies, Berlin. Secara singkat, array diinkubasi dengan sampel serum yang dikumpulkan pada minggu ke 24 dan kompleks peptida IgG divisualisasikan menggunakan IgG anti-monyet kambing biotinilasi dan Alexa Fluor® 647 Streptavidin. Slide dipindai dengan pemindai resolusi tinggi pada 635 nm dan data dilaporkan sebagai unit fluoresensi sewenang-wenang. Rata-rata nilai rangkap tiga ditentukan, jika koefisien variasi lebih besar dari 0.5, hanya 2 nilai terdekat yang digunakan. 10 persen dari sinyal intensitas maksimum (65.535) digunakan sebagai cut-off untuk arespon positif, dan sinyal rata-rata di bawah ambang ini diberi nilai yang sesuai dengan setengah nilai ambang (3277).

Uji netralisasi in vitro

Uji netralisasi in vitro dilakukan untuk menguji kapasitas antibodi serum yang diinduksi vaksin untuk menetralkan infeksi Chlamydia sel HaK secara in vitro. Pengujian ini terutama mengikuti protokol yang dijelaskan sebelumnya (44). Pertama, sampel serum dari masing-masing hewan diinkubasi pada suhu 56 derajat selama 30 menit untuk menonaktifkan komplemen. Stok Chlamydia (SvD, SvE, dan SvF) dicampur dan diinkubasi dengan pengenceran serial serum yang diinaktivasi dari masing-masing hewan yang divaksinasi selama 30 menit dan kemudian diinokulasi ke satu lapisan sel HaK dalam 96-pelat bawah datar yang baik di duplikat. Setelah 30 jam inkubasi, sel, dan inklusi difiksasi dan divisualisasikan dengan serum kelinci poliklonal anti-Ct043 dan antibodi sekunder berlabel fluoresensi (Alexa Flour 488, IgG anti-kelinci kambing, A11008, Life Technologies) dalam pengenceran 1:500 . Penghitungan inklusi dilakukan secara manual dalam 20 bidang pandang pada pembesaran 40x (mikroskop fluoresensi terbalik Olympus IX71). Netralisasi dihitung sebagai persentase pengurangan jumlah rata-rata IFU dibandingkan dengan kumpulan serum dari hewan kelompok kontrol (naif).

Pewarnaan sitokin PBMC intraseluler dan sesama sitometri

PBMC diisolasi dan ({{0}} x 106 ) disuspensikan kembali dalam 150 µl media lengkap yang mengandung 0,2 µg dari masing-masing antibodi kostimulatori CD28 dan CD49b. Stimulasi dilakukan di 96 sumur/pelat menggunakan 2 µM dari setiap kumpulan peptida atau SEB (sebagai kontrol positif) atau media saja (sebagai kontrol negatif). Brefeldin A ditambahkan ke masing-masing sumur pada konsentrasi akhir 10 µg/ml dan pelat diinkubasi pada suhu 37 derajat C, 5 persen CO2 semalam. Sel-sel kemudian dicuci, diwarnai dengan pewarna viabilitas (ungu, pewarna reaktif fluoresen, Invitrogen), difiksasi, dan permeabilisasi dengan reagen BD Cytofifix / Cytoperm. Sampel sel permeabil kemudian disimpan pada -80 derajat sebelum prosedur pewarnaan. Pewarnaan antibodi dilakukan dalam satu langkah setelah permeabilisasi. Semua yang digunakanantiboditercantum dalam Tabel 1. Setelah 30 menit inkubasi pada es dalam gelap, sel dicuci dalam buffer BD Perm/Wash. Sel dihitung dengan LSR II (BD) segera setelah prosedur pewarnaan dan perangkat lunak FlowJo digunakan untuk analisis data.

TABEL 1 Antibodi yang digunakan untuk pewarnaan penanda sel imun dan sitokin intraseluler

Deteksi DNA klamidia vagina dengan PCR kualitatif

Abbott RealTime CT/NG assay (ABBOTT, Rungis, France) adalah uji reaksi berantai polimerase (PCR) in vitro untuk deteksi kualitatif langsung DNA plasmid untuk genom CT (C.trachomatis) dan NG (N. gonorrhoeae) . Asam nukleat diekstraksi dari sampel UTM (universal transport media) pada M2000SP dan amplifikasi dilakukan pada M2000SP, sesuai dengan instruksi pabriknya. Hasil dinyatakan sebagai ambang batas siklus (Ct).

Analisis statistik

Semua statistik dilakukan dengan perangkat lunak GraphPad Prism (versi 8.1.2). Data yang tidak berdistribusi normal dianalisis dengan uji non-parametrik; Uji Kruskal–Wallis dan uji perbandingan berganda Dunn untuk menentukan signifikansi perbedaan antar kelompok. Kurva yang menunjukkan persen hewan negatif PCR dibandingkan dengan uji statistik Log-rank (Mantel-Cox). Perbandingan dianggap signifikan secara statistik jika nilai P adalah < 0.05 (P < 0.05). Tingkat signifikansi lebih lanjut ditunjukkan dengan tanda bintang *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

pernyataan ketersediaan data

Kontribusi asli yang disajikan dalam penelitian ini termasuk dalam artikel/Materi Pelengkap. Pertanyaan lebih lanjut dapat diarahkan ke penulis yang sesuai.

Pernyataan etika

Studi hewan ditinjau dan disetujui oleh "Comité d'Ethique en Expérimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) di bawah pernyataan nomor A14-026. Studi ini disahkan oleh "Kementerian Riset, Inovasi, dan Pendidikan" dengan nomor registrasi APAFIS#720-201505281237660.

Kontribusi penulis

Eksperimen yang disusun dan dirancang: JD, FF, EL, PA, RG, RS. Eksperimen yang dilakukan: VC, DD, BD, SL, CD, CJ, ND-B, CB, BB, AT. Vaksin yang diproduksi dan konstruksi antigen: IR, PM, AO. Menganalisis data: JD, EL, FF, IR, HJ. Menyusun dan mengedit makalah: JD, EL, FF. Masing-masing rekan penulis yang terdaftar memberikan kontribusi besar pada pekerjaan melalui desain dan konsepsi, dan/atau akuisisi, analisis, dan interpretasi data. Semua penulis berkontribusi pada artikel dan menyetujui versi yang dikirimkan.

Terima kasih

Kami berterima kasih kepada Fondation Dormeur, Vaduz atas donasi kepada Viral Evolution and Transmission Unit untuk instrumen laboratorium yang relevan dengan proyek ini.

Konflik Kepentingan FF, IR, PA dan AWO adalah co-inventor pada permohonan paten pada vaksin melawan klamidia [WO2014146663A1]. Semua hak telah dialihkan ke Statens Serum Institut, sebuah lembaga pemerintah nirlaba Denmark. Penulis yang tersisa menyatakan bahwa penelitian ini dilakukan tanpa adanya hubungan komersial atau keuangan yang dapat ditafsirkan sebagai potensi konflik kepentingan.

Catatan penerbit Semua klaim yang diungkapkan dalam artikel ini semata-mata milik penulis dan tidak selalu mewakili organisasi afiliasinya, atau milik penerbit, editor, dan peninjau. Produk apa pun yang dapat dievaluasi dalam artikel ini, atau klaim yang dibuat oleh pabrikannya, tidak dijamin atau didukung oleh penerbit.

Referensi

1. Newman L, Rowley J, Vander Hoorn S, Wijesooriya NS, Unemo M, Low N, dkk. Estimasi global prevalensi dan kejadian empat infeksi menular seksual yang dapat disembuhkan pada tahun 2012 berdasarkan tinjauan sistematis dan pelaporan global. PLoS Satu (2015) 10(12):e0143304. doi: 10.1371/journal.pone.0143304

2. Longbottom D, Coulter LJ. Chlamydioses hewan dan implikasi zoonosis. J Comp Pathol (2003) 128(4):217–44. doi: 10.1053/jcpa.2002.0629

3. Haggerty CL, Gottlieb SL, Taylor BD, Low N, Xu F, Ness RB. Risiko gejala sisa setelah infeksi genital klamidia trachomatis pada wanita. J Infect Dis (2010) 201 Suppl 2:S134–55. doi: 10.1086/652395

4. Dodet B. Hambatan, tantangan, dan peluang saat ini untuk pengembangan vaksin IMS yang efektif: sudut pandang produsen vaksin, perusahaan biotek, dan lembaga pendanaan. Vaksin (2014) 32(14):1624–9. doi: 10.1016/ j.vaccine.2013.08.032

5. Brunham RC, Kuo CC, Cles L, Holmes KK. Korelasi respon imun inang dengan pemulihan kuantitatif Chlamydia trachomatis dari endoserviks manusia. Infect Immun (1983) 39(3):1491–4. doi: 10.1128/iai.39.3.1491- 1494.1983

6. Cotter TW, Meng Q, Shen ZL, Zhang YX, Su H, Caldwell HD. Kemanjuran pelindung imunoglobulin spesifik protein membran luar utama a (IgA) dan antibodi monoklonal IgG dalam model murine dari infeksi saluran genital klamidia trachomatis. Infect Immun (1995) 63(12):4704–14. doi: 10.1128/iai.63.12.4704-4714.1995

7. Johansson M, Schon K, Ward M, Lycke N. Studi pada tikus knockout mengungkapkan bahwa perlindungan anti-klamidia membutuhkan sel TH1 yang memproduksi IFN-gamma: apakah ini berlaku untuk manusia? Scand J Immunol (1997) 46(6):546–52. doi: 10.1046/j.1365- 3083.1997.d01-167.x

8. Gondek DC, Olive AJ, Stary G, Starnbach MN. Sel CD4 plus T diperlukan dan cukup untuk memberikan perlindungan terhadap infeksi klamidia trachomatis pada saluran genital bagian atas murine. J Immunol (2012) 189(5):2441–9. doi: 10.4049/ jimmunol.1103032

9. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Wijburg OL, Beagley KW. Evaluasi IgA sekretori intra dan ekstra epitel pada infeksi klamidia. Imunologi (2014) 143(4):520–30. doi: 10.1111/imm.12317

10. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Blumberg RS, Beagley KW. Hasil yang berbeda setelah transcytosis IgG menargetkan antigen klamidia intraseluler dan ekstraseluler. Biol Sel Immunol (2014) 92(5):417–26. doi: 10.1038/icb.2013.110

11. Olsen AW, Follmann F, Erneholm K, Rosenkrands I, Andersen P. Perlindungan terhadap infeksi Chlamydia trachomatis dan perubahan patologis saluran genital bagian atas oleh antibodi penawar yang dipromosikan vaksin yang diarahkan ke VD4 dari protein membran luar utama. J Infect Dis (2015) 212(6):978–89. doi: 10.1093/infdis/jiv137

12. Nguyen N, Guleed S, Olsen AW, Follmann F, Christensen JP, Dietrich J. Th1/Th17 Kekebalan penghuni jaringan sel T meningkatkan perlindungan tetapi tidak diperlukan dalam strategi vaksin melawan infeksi kelamin dengan chlamydia trachomatis. Immunol depan (2021) 12:790463. doi: 10.3389/fifimmu.2021.790463

Tanya lebih lanjut:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: plus 86 15292862950

Tambahkan suplemen cistanche ke troli:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-toko