Administrasi Konsorsium Bakteri Usus In Vivo Mereplikasi Metabotipe Urolithin A dan B pada Model Tikus yang Tidak Memproduksi UrolithinⅠ
Dec 25, 2023
Selama beberapa dekade, konsumsi ellagitannins (ETs) dan asam ellagic (EA) telah dikaitkan dengan berbagai efek biologis, termasuk aktivitas replikasi antioksidan, antikanker, anti-inflamasi, antibakteri, dan anti-HIV.1 Namun, penyerapan dan bioavailabilitas ETs dan EA sangat buruk. Penelitian pada manusia sebelumnya menemukan bahwa ekskresi EA dan EA-O-glukuronida melalui urin kurang dari 1% dari asupan.2,3 Namun demikian, meskipun penyerapan ET dan EA rendah, mereka selanjutnya dimetabolisme oleh mikrobiota kolon menjadi urolitin (Uros), yang bertanggung jawab, setidaknya sebagian, atas efek menguntungkan dari makanan kaya ET dan (atau) EA.1,4
Pertama, EA dilepaskan melalui hidrolisis ikatan ester ET oleh enzim yang dikenal sebagai ellagitannase.5 EA mengalami degradasi lebih lanjut, menghasilkan 6H-dibenzo[b,d]pyran-6-satu turunan yang disebut Uros. Rangkaian reaksi ini dimulai dengan pembelahan cincin lakton oleh enzim laktonase, menghasilkan asam luteat, yang kemudian didekarboksilasi menjadi pentahidroksi-Uro (Uro-M5). Dehidroksilasi berturut-turut mengubahnya menjadi tetrahidroksi-Uros (Uro-D, Uro-E, dan Uro-M6) dan trihydroxy-Uros (Uro-C, UroM7, dan Uro-G), yang akhirnya menghasilkan dihydroxy-Uros (Uro-A andisoUro-A) dan monohydroxy-Uro (Uro-B), yang terakhir umumnya terdeteksi ketika isoUro-A juga diproduksi.1
Variasi yang luas dari profil metabolisme Uro yang terdeteksi pada manusia setelah mengonsumsi makanan kaya ET menunjukkan perbedaan antarindividu dalam mikrobiota kolon yang bertanggung jawab atas degradasi ET.6–8 Banyak kemungkinan interaksi antara bakteri kolon dan organisme yang menjadi tuan rumah dapat menjelaskan perbedaan nasib metabolik makanan (poli )fenol.6,9 Interaksi dua arah antara mikrobiota usus dan (poli)fenol telah mendorong komunitas ilmiah untuk mengelompokkan populasi berdasarkanfenotip metabolik (tipe logam) untuk menjelaskan perbedaan efek polifenol.10,11 Lebih khusus lagi, menurut metabolisme ET dan EA, individu dapat dikelompokkan menjadi Urometabotipe (UM) yang terkait dengan komposisi dan fungsi mikrobioma usus.7,8,12
Tiga UM manusia (UM-A,UM-B, dan UM-0) terkait dengan tiga profil produksi Uro yang berbeda telah dijelaskan dalam populasi Barat dan Timur.13–15 Dalam hal ini, individu metabotipe A (UM-A) menghasilkan beberapa Uro perantara tetapi hanya urolitin A (Uro-A), Uro utama yang diserap dalam UM ini, pada akhir jalur katabolik mikroba. Individu metabotipe B (UM-B) menghasilkan beberapa Uro perantara dan tiga Uro akhir, yaitu urolitin B (Uro-B), urolitin A (IsoUro-A), dan Uro-A, yang merupakan Uro serapan utama pada UM-B. Oleh karena itu, Uro perantara dapat bekerja terutama di usus, sedangkan Uro terakhir dapat mempunyai efek lokal dan sistemik.6 Sebaliknya, individu dengan tipe logam 0 (UM-0) tidak dapat menghasilkan Uro akhir ini (hanya Uro akhir). prekursor Urolithin-M5 telah terdeteksi sejauh ini, yang tidak diserap di usus).
Perbedaan profil Uro telah diamati antara UM dan di sepanjang usus besar, menunjukkan produksi Uro yang dominan di wilayah distalkolon.16–19 Hebatnya, persentase UM-0 pada sukarelawan sehat di Spanyol dan Tiongkok adalah sekitar 10% dan bisa lebih tinggi lagi di populasi AS.13–15 Genera bakteri Gordonibacter dan Ellagibacter telah diidentifikasi mampu memetabolisme EA menjadi beberapa Uros.20–23Namun, ditemukan bahwa beberapa zat antara (misalnya, Uro-D, Uro-E, Uro- M7, dan Uro-G) dan Uro akhir (Uro-A dan Uro-B) tidak diproduksi dalam kultur murni bakteri ini, yang berarti perlunya bakteri lain untuk melengkapi rangkaian Uro yang mengkonfigurasi UM-A dan UM-B . Baru-baru ini, konsorsium bakteri usus yang terlibat dalam metabolisme EA untuk menghasilkan metabotipe penghasil Uro (UM-A dan UM-B) secara in vitro telah diidentifikasi.24
Konsorsium bakteri yang mengandung genera Gordonibacter plus Enterocloster dan Ellagibacter plus Enterocloster masing-masing memproduksi urolitin yang terkait dengan UM-A dan UM-B secara in vitro.25 Namun, kemampuan konsorsium bakteri ini untuk mereplikasi profil Uro manusia yang terkait dengan UM-A dan UM-B secara in vivo masih belum diketahui. Selain itu, keamanan mengonsumsi bakteri penghasil Uro ini sebagai probiotik baru masih belum pasti karena belum pernah diuji sebelumnya pada hewan atau manusia. Dalam penelitian ini, konsorsium bakteri di atas dinilai kemampuannya dalam mengkolonisasi usus tikus yang tidak memproduksi Uro (seperti UM-0-) dan mengubahnya menjadi produsen Uro yang masing-masing meniru UM-A dan U-MB. Keamanan konsorsium bakteri ini juga dievaluasi. Selain itu, dua prosedur berbasis PCR kuantitatif real-time (qPCR) baru dikembangkan untuk mendeteksi dan mengukur Ellagibacter dan Enterocloster dalam sampel tinja.
Bahan dan metode
Kimia dan reagen
Uro disintesis dan dimurnikan secara kimia oleh VillapharmaResearch SL (Parque Tecnológico de Fuente Álamo, Murcia, Spanyol). EA dibeli dari Sigma-Aldrich (St Louis, MO,USA). Phosphate buffer saline (PBS) diperoleh dari FisherScientific (USA), sedangkan metanol, etanol, dan asam format diperoleh dari Panreac Química (Barcelona, Spanyol). Pelarut tingkat kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS) dibeli dari JT Baker (Deventer, Belanda). Air ultra murni Millipore (Bedford, MA, USA) digunakan selama penelitian. Semua bahan kimia dan reagen memiliki tingkat analitis.
Persiapan konsorsium bakteri
Gordonibacter urolithinfaciens DSM 27213T, Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T, dan Enterocloster melesat CEBASS4A9, semuanya diisolasi dan diidentifikasi di laboratorium kami (CEBAS-CSIC, Spanyol), dibudidayakan secara anaerobik dalam 5 mLWilkins - Tabung medium Chalgren anaerob (WAM, Oxoid) pada suhu 37 derajat selama 48 jam di ruang anaerobik Concept 400 (BakerRuskin Technologies Ltd, Bridgend, South Wales, UK) dan diresuspensi dalam PBS yang ditambah dengan 10% gliserol dan 0,05% L-sistein hidroklorida (PanReac Química, Barcelona, Spanyol). Setelah inkubasi anaerobik, konsorsium disiapkan.24,25 Secara singkat, "konsorsium bakteri A" berisi G. strain urolithinfaciens dan E.bolteae; "konsorsium bakteriB" mengandung kultur E. isourolithinifaciens dan E. bolteae; dan "koktail kontrol" mengandung PBS steril dengan 10% gliserol dan 0,05% L-sistein hidroklorida. Sebelum pemberian, semua koktail didistribusikan dalam 3,5 mL alikuot dan disimpan pada suhu−80 derajat.
Hewan, pola makan, dan desain eksperimental
Protokol eksperimental (referensi 624/2020) telah disetujui oleh pemerintah daerah, Komite Bioetika Dewan Penelitian Nasional Spanyol (Madrid, Spanyol), dan Komite Etika Eksperimen Hewan dari Universitas Murcia (Spanyol). Eksperimen tersebut mengikuti rekomendasi Uni Eropa mengenai eksperimen hewan (Petunjuk 2010/63/EU Parlemen Eropa dan Dewan Perlindungan Hewan yang Digunakan untuk Tujuan Ilmiah). Tikus wistar (n=18; 9 betina dan 9 jantan) dengan berat 240 ± 31 g diperoleh dari Envigo (Barcelona, Spanyol). Model tikus ini dipilih berdasarkan ketidakmampuannya menghasilkan Uros yang diamati dalam studi pendahuluan kami di mana sampel feses dari model tikus yang berbeda diuji. Tiga kelompok (A, B, dan C) dibentuk dengan menugaskan masing-masing 6 hewan secara acak (3 tikus betina dan 3 tikus jantan). ) per grup (Gbr. 1).
Setiap kelompok tikus ditempatkan di dua kandang berbeda, dibagi berdasarkan jenis kelamin, di ruangan dengan suhu lingkungan terkontrol (22± 2 derajat ) dengan kelembaban relatif 55 ± 10% dan siklus terang-gelap terkontrol (12 jam). Tikus menerima makanan chow standar (Teklad, Barcelona, Spanyol) yang mengandung (%/100 g berat segar) 14,3% protein (tepung gluten jagung), 48% karbohidrat (gandum, gandum giling, jagung giling) dan 4% lemak (minyak kedelai). ), kepadatan energi 2,9 kkal g−1, dan serat kasar 4,1%, ditambah dengan bubuk EA dengan kemurnian lebih dari atau sama dengan 95% (3,6 mg per 100 g makanan). EA dicampur secara homogen dengan pakan standar yang digiling, dipelet ulang dan diliofilisasi. Makanan yang diperkaya EA disimpan jauh dari kelembapan dan cahaya. Dosis EA yang diberikan kepadatikus dalam makanan adalah sekitar 0,72 mg per tikus per hari (diet EA1×), dosis setara manusia sebesar 41 mg hari−1,26 Semua kelompok diberi makanan EA 1× dan air keran ad libitum selama percobaan ( 5 minggu). Karena EA yang terdeteksi pada sampel feses rendah pada minggu pertama, beberapa EA tambahan ditambahkan pada hari berikutnya. Pada minggu ke-3, dosis tambahan 1,5 mgEA per tikus per hari yang dilarutkan dalam air diberikan secara oral melalui gavage kepada hewan (total=EA 3× diet), yang diberikan hanya selama 1 minggu. Akhirnya, pada minggu ke 4, ≈5 g kenari per tikus per hari (sumber EA lain) ditambahkan ke dalam diet EA 1× dan dipertahankan hingga akhir penelitian untuk mengevaluasi dampak EA yang mengandung matriks makanan terhadap kemampuan bakteri. untuk menghasilkan Uros. Berat badan, makanan, dan asupan air diukur setiap hari. Konsorsium bakteri usus diberikan secara oral melalui gavage. Kelompok A mendapat 500 µL bakterial cocktail A, Kelompok B mendapat 500 µL bakterial cocktail B, dan Kelompok C (kontrol) mendapat 500 µL PBS. Gavage oral dilakukan setiap 2 hari selama dua minggu pertama dan setiap hari selama 2 minggu berikutnya. Pada minggu terakhir (hari ke 28 hingga 32), hewan dilanjutkan dengan pakan yang sama ditambah dengan EA dan kenari tetapi tanpa pemberian bakteri mulut. Pada akhir penelitian, hewan dikorbankan menggunakan ruang CO2.
Prosedur pengambilan sampel
Sampel feses dikumpulkan selama penelitian untuk analisis Uro dengan UPLC-ESI-QTOF-MS/MS dan mikrobiota usus dengan sekuensing gen 16S rRNA dan qPCR. Darah diekstraksi pada titik waktu yang berbeda (awal, hari ke 28, dan akhir penelitian) untuk analisis hematologi dan biokimia serum. Sampel darah diambil dari vena ekor (≈500 µL) dan dikumpulkan dalam tabung yang mengandung heparin pada awal dan hari ke 28 dan 32 (Gbr. 1). Pemisahan plasma dilakukan segera dengan sentrifugasi pada 3000g selama 10 menit pada suhu 4 derajat dan dibekukan pada suhu - 80 derajat hingga penentuan variabel serobiokimia lebih lanjut. Hati, ginjal, dan limpa dikumpulkan, ditimbang, dan diperiksa untuk mendeteksi perbedaan morfologi pada korban.
Desain dan optimalisasi primer dan penyelidikan untuk kuantifikasi Ellagibacter dan Enterocloster dengan qPCR
Urutan gen 16S rRNA Ellagibacter isourolithinifaciens DSM 104140T dan E. bolted CEBAS S4A9 diperoleh dari database GenBank (database EMBL). Urutannya diselaraskan dengan genera bakteri yang dekat secara filogenetik menggunakan perangkat lunak Analisis Genetika Evolusioner Molekuler (MEGA 11) dan diperiksa untuk wilayah urutan yang dilestarikan dan variabel untuk merancang primer dan penyelidikan untuk mendeteksi dan mengukur Ellagibacter dan Enterocloster (Tabel 1). Primer dan probe dirancang dan divalidasi masing-masing dengan alat Primer Quest dan Oligo Analyzer (Integrated DNATechnologies, Inc., Belgia). Probe TaqMan diberi label pada ujung 5′ dan 3′ dengan 6-grup karboksi-fluorescein (6FAM) dan pemadam blackberry (BBQ), masing-masing. qPCR dilakukan menggunakan sistem deteksi urutan ABI 7500. Konsentrasi akhir masing-masing primer dan probe adalah 300 dan 375 nM untuk Ellagibacter dan 200 dan 500 nM untuk Enterocloster. Protokol qPCR konvensional dilakukan untuk amplifikasi DNA Ellagibacter danEnterokloster, masing-masing. Profil ramping untuk amplifikasi Ellagibacter adalah 1 siklus pada 95 derajat selama 5 menit, diikuti oleh 45 siklus 95 derajat selama 15 detik, 50 derajat selama 40 detik, dan 72 derajat selama 31 detik. Terakhir, 1 siklus pada 72 derajat selama 5 menit ditambahkan. . Profil ramping untuk amplifikasi Enterocloster adalah 1 siklus pada 95 derajat selama 5 menit, diikuti oleh 40 siklus 95 derajat selama 15 detik, 65 derajat selama 40 detik, dan 72 derajat selama 31 detik. Terakhir, 1 siklus pada suhu 72 derajat selama 5 menit ditambahkan.
Ekstraksi DNA feses dan analisis mikroba usus
Ekstraksi DNA dari sampel feses dilakukan dengan kit pemurnian DNA jaringan NucleoSpin® (Macherey-Nagel, Jerman), sesuai dengan instruksi pabrik dengan beberapa modifikasi. DNA diukur dengan fluorimetri (Qubit3.0 – ThermoFisher Scientific™, UK), dan kemurniannya diukur dari rasio serapan pada panjang gelombang 260/280 nm (A260/A280) (NanoDrop-ThermoFisher Scientific™, UK ). Komposisi mikrobiota usus ditentukan dengan mengurutkan wilayah variabel V3 dan V4 dari gen 16S rRNA mengikuti protokol Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) dengan panjang baca 2 × 300 bp pair-end run (MiSeqReagent Kit v3 , Illumina Inc.). Urutan metagenomik dilakukan pada platform MiSeq-Illumina (layanan sekuensing FISABIO, Spanyol). Pemrosesan data, penghapusan urutan chimeric, penyelarasan urutan, dan pengelompokan urutan gen 16S rRNA dilakukan seperti yang dijelaskan di tempat lain untuk mendapatkan klasifikasi taksonomi.8,27 Amplifikasi DNA Gordonibacter dicapai dalam sistem qPCR ABI 7500 seperti yang dijelaskan sebelumnya.19,28 Enterocloster dan Ellagibacter- primer dan probe spesifik yang dirancang dalam penelitian ini digunakan mengikuti protokol qPCR yang dijelaskan di atas. Kurva standar DNA genom Gordonibacter, Enterocloster, dan Ellagibacter digunakan untuk kuantifikasi. Semua sampel feses dianalisis dalam rangkap tiga.
Ekstraksi, deteksi, dan kuantifikasi urolitin dalam sampel feses
Sampel feses ({{0}}.2–0.5 g) diekstraksi, dengan perbandingan 1:10, dengan larutan MeOH/H2O (8{{ 20}}/20), diasamkan dengan0.1% HCl, dan dihomogenisasi dengan cara divorteks selama 2 menit dan dikocok dengan kecepatan 1500 rpm pada suhu kamar selama 10 menit dalam pemanas blok. Suspensi disentrifugasi pada 14 000g pada suhu 4 derajat selama 10 menit, dan supernatan disaring melalui filter membran PVDF 0,22 µm (Millipore Corp., Bedford, MA) dan diencerkan 3× dengan MeOH (asam format 0,1%). ) sebelum injeksi dalam sistem UPLC-ESI-QTOF-MS. Sistem UPLC (Agilent 1290Infinity) yang digabungkan dengan sistem quadrupole time-of-flight (QTOF) LC/MS (6550 Accurate-Mass) (Agilent Technologies, Waldbronn, Jerman) digunakan untuk menganalisis metabolit feses menggunakan metode elusi gradien seperti yang dijelaskan sebelumnya .29,30 Secara singkat, pemisahan dilakukan dalam kolom fase terbalik Poroshell 120 EC-C18, menggunakan air dan asetonitril, keduanya diasamkan dengan asam format 0,1%, sebagai fase gerak. Laju alir adalah 0,4 mL min-1, dan volume injeksi adalah 5 μL. Perangkat lunak Analisis Kualitatif MassHunter (versi B.10, Agilent Technologies, Waldbronn, Jerman) digunakan untuk pemrosesan data. Semua metabolit diidentifikasi melalui perbandingan langsung dengan standar dan dikonfirmasi oleh massa molekulnya. Kurva kalibrasi diperoleh untuk EA dan Uros yang berbeda dengan linearitas yang baik (R2 > 0,99).
Hematologi dan kimia klinis
Variabel hematologi ditentukan dalam darah yang diheparinisasi menggunakan penganalisis hematologi otomatis dengan perangkat lunak khusus untuk sampel darah tikus (AVDIA 120, Siemens, Munich, Jerman). Variabel yang dianalisis adalah mean corpuscular volume (MCV), mean corpuscular hemoglobin (MCH), mean corpuscular hemoglobinconsentration (MCHC), distribusi eritrosit (RDW), mean platelet volume (MPV), plateletcrit (PCT), platelet distribution width (PDW). , komponen trombosit rata-rata (MPC), massa trombosit rata-rata (MPM), jumlah trombosit (PLT), kandungan hemoglobin retikulosit (CHr), dan volume sel darah retikulosit rata-rata (MCVr). Variabel biokimia plasma, kalsium (Ca), dan fosfor (P) dianalisis menggunakan penganalisis kimia dan toksikologi Olympus AU400 (Beckman Coulter, California, USA). Variabel biokimia yang digunakan adalah protein total (PROT), albumin (ALBU), globulin (GLOB), kreatinin (CREA), glukosa (GLUC), kolesterol (CHOL), trigliserida (TRIGL), alkaline fosfatase (ALP), gamma-glutamyl transpeptidase ( GGT), aspartat aminotransferase (AST), dan alanine aminotransferase (ALT). Terakhir, kadar tiroksin (T4) dianalisis menggunakan sistem IMMULITE® 1000immunoassay (Siemens).
Analisis statistik
Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Analisis statistik dilakukan dengan perangkat lunak SPSS versi 27.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA), dan perbedaan denganp < 0.05 dianggap signifikan secara statistik. Normalitas data dievaluasi dengan uji Shapiro-Wilk. Perbandingan antara kelompok perlakuan yang berbeda dilakukan dengan menggunakan analisis varians terukur berulang (RM ANOVA) dengan uji post hoc T3 Tukey atau Dunnett, tergantung pada apakah data mengikuti distribusi normal atau tidak normal. Perbedaan antara laki-laki dan perempuan dieksplorasi dengan menggunakan uji-t Student berpasangan, atau uji peringkat bertanda Wilcoxon ketika masing-masing data berdistribusi normal atau tidak normal. Ukuran efek analisis diskriminan linier chi-kuadrat (LEfSe) digunakan untuk mendeteksi perbedaan fitur bakteri antar kelompok. Korelasi Pearson digunakan untuk menganalisis kemungkinan hubungan antar variabel pada data berdistribusi normal, sedangkan korelasi Spearman digunakan pada data berdistribusi tidak normal. Plot data dilakukan menggunakan Sigma Plot 14.5 (Systat Software, San Jose, CA, USA).
Obat Herbal Alami Untuk Meredakan Sembelit-Cistanche
Cistanche adalah genus tumbuhan parasit yang termasuk dalam famili Orobanchaceae. Tanaman ini dikenal karena khasiat obatnya dan telah digunakan dalam Pengobatan Tradisional Tiongkok (TCM) selama berabad-abad. Spesies Cistanche sebagian besar ditemukan di daerah kering dan gurun di Tiongkok, Mongolia, dan bagian lain di Asia Tengah. Tanaman Cistanche memiliki ciri khas batangnya yang berdaging dan berwarna kekuningan dan sangat dihargai karena potensi manfaat kesehatannya. Dalam pengobatan TCM, Cistanche dipercaya memiliki khasiat tonik dan biasa digunakan untuk menyehatkan ginjal, meningkatkan vitalitas, dan mendukung fungsi seksual. Hal ini juga digunakan untuk mengatasi masalah penuaan, kelelahan, dan kesejahteraan secara keseluruhan. Meskipun Cistanche memiliki sejarah panjang penggunaan dalam pengobatan tradisional, penelitian ilmiah mengenai kemanjuran dan keamanannya masih berlangsung dan terbatas. Namun, ia mengandung berbagai senyawa bioaktif seperti glikosida feniletanoid, iridoid, lignan, dan polisakarida, yang mungkin berkontribusi terhadap efek pengobatannya.
Wecistanchebubuk cistanche, tablet cistanche, kapsul cistanche,dan produk lainnya dikembangkan menggunakanguruncistanchesebagai bahan bakunya, semuanya berkhasiat baik dalam meredakan sembelit. Mekanisme spesifiknya adalah sebagai berikut: Cistanche diyakini memiliki potensi manfaat untuk meredakan sembelit berdasarkan penggunaan tradisionalnya dan senyawa tertentu yang dikandungnya. Meskipun penelitian ilmiah secara khusus mengenai efek Cistanche terhadap sembelit masih terbatas, diperkirakan ada beberapa mekanisme yang dapat berkontribusi pada potensinya untuk meredakan sembelit. Efek Pencahar:Cistanchetelah lama digunakan dalam Pengobatan Tradisional Cina sebagai obat sembelit. Dipercaya memiliki efek pencahar ringan, yang dapat membantu melancarkan buang air besar dan menyebabkan sembelit. Efek ini mungkin disebabkan oleh berbagai senyawa yang ditemukan di Cistanche, seperti glikosida feniletanoid dan polisakarida. Melembabkan Usus: Berdasarkan penggunaan tradisional, Cistanche dianggap memiliki sifat melembapkan, yang secara khusus menargetkan Usus. Meningkatkan hidrasi dan pelumasan Usus dapat membantu melunakkan alat dan memfasilitasi perjalanan yang lebih mudah, sehingga mengurangi sembelit. Efek Anti-inflamasi: Sembelit terkadang bisa dikaitkan dengan peradangan pada saluran pencernaan. Cistanche mengandung senyawa tertentu, termasuk glikosida feniletanoid dan lignan, yang diyakini memiliki sifat antiinflamasi. Dengan mengurangi peradangan di usus, dapat membantu meningkatkan keteraturan buang air besar dan meredakan sembelit.
