In Vitro Dan In Silico Wawasan Ke Inhibitor Tirosinase
Mar 28, 2022
Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}
Hee Jin Jung a,b,c, Sang Gyun Noh a,b,c, Yujin Park a, Dongwan Kang a, Pusoon Chun d, Hae Young Chung a,b,c,⇑,Hyung Ryong Moon a
Abstrak
Tirosinase adalah enzim kunci yang bertanggung jawab untuk biosintesis melanin dan efektif dalam melindungi kerusakan kulit yang disebabkan oleh radiasi ultraviolet. Sebagai bagian dari upaya berkelanjutan untuk menemukan inhibitor tirosinase yang kuat, kami secara sistematis merancang dan mensintesis tiga belas (E)-benzilidena-1-indanon derivatif (BID1-13) dan menentukan aktivitas penghambatannya terhadap tirosinase. Di antara senyawa yang dievaluasi, BID3 adalah penghambat tirosinase jamur yang paling kuat (IC50=0.034 mM, aktivitas mikofenolat; IC50=1.39 mM, aktivitas difenol). Studi kinetik mengungkapkan bahwa BID3 menunjukkan jenis campuran penghambatan tirosinase dengan nilai Ki 2,4 mM menggunakan L-DOPA sebagai substrat. Dalam simulasi docking molekuler silico menunjukkan bahwa BID3 dapat mengikat ke situs katalitik dan alosterik tirosinase untuk menghambat aktivitas enzim yang dikonfirmasi studi eksperimental in vitro antara BID3 dan tirosinase. Selanjutnya, kandungan melanin menurun dan aktivitas tirosinase seluler dihambat setelah pengobatan BID3. Pengamatan ini mengungkapkan bahwa BID3 adalah penghambat tirosinase yang kuat dan berpotensi dapat digunakan sebagai zat pemutih untuk pengobatan gangguan terkait pigmentasi.
Cistanche: ramuan agen pemutih kulit
1. Perkenalan
Melanin disintesis oleh melanosit di lapisan vassal epidermis umumnya mengacu pada keluarga pigmen yang biasa dikenal untuk melindungi kulit mamalia dari kerusakan yang disebabkan oleh radiasi UV yang berbahaya dengan menangkap radikal bebas atau menyebarkan sinar UV yang datang [1]. Namun, produksi melanin yang berlebihan dapat menyebabkan hiperpigmentasi epidermis yang terlihat, yang mungkin terlihat jelas sebagai melasma, bintik-bintik, bintik-bintik penuaan, atau lentigin pikun [2].
Tirosinase (EC 1.14.18.1), metalloenzyme yang mengandung tembaga, adalah enzim kunci yang terlibat dalam proses melanogenik. Tirosinase mengkatalisis dua langkah pembatas kecepatan dalam melanogenesis; hidroksilasi tirosin (kresolase atau aktivitas mikofenolat) untuk menghasilkan 3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA) dan oksidasi selanjutnya dari L-DOPA (aktivitas katekolase atau difenol) menjadi DOPA-kuinon yang sesuai. Ketika L-tirosin adalah substrat, produk reaksi yang dikatalisis tirosinase adalah DOPA-kuinon, yang kemudian diubah menjadi melanin [3]. Langkah-langkah ini sangat penting untuk perlindungan kulit terhadap kerusakan akibat sinar UV. Agaricus jamur digunakan untuk yang tersedia secara komersial dan homologi tinggi dengan enzim tirosinase mamalia yang membuatnya cocok sebagai model untuk studi tentang melanogenesis [4]. Pada manusia, melanin membantu mempertahankan kulit dari kerusakan akibat sinar UV [5]. Namun, kelebihan kadar melanin dapat menyebabkan berbagai gangguan dermatologis termasuk hiperpigmentasi, melasma, bintik-bintik, dan bintik-bintik penuaan. Oleh karena itu, inhibitor newtyrosinase yang menunjukkan sifat seperti obat dan pemutih kulit diperlukan untuk menghambat pigmentasi kulit yang berlebihan.
1-Indanon, dengan kerangka benzoil-siklopentanon, dianggap sebagai sepupu kaku dari kalkon, menggabungkan sistem keton tak jenuh dari kalkon yang membentuk cincin beranggota 5 siklik, yang merupakan komponen alami yang terdapat di berbagai sumber tanaman yang dapat dimakan [7 ]. Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa senyawa yang memiliki bagian 1-indanone memiliki kepentingan farmakologis, karena menunjukkan berbagai aktivitas biologis yang bermanfaat, termasuk anti-inflamasi [8-10], antikanker [11,12], antioksidan [13], anti-Parkinson. penyakit [14], penyakit anti-Alzheimer [15-17], antimikroba [18], anti-imun supresif [19], dan sifat anti-tirosinase [20].
Kalkon (1,3-diaril-2-yang-1-benar) adalah keton aromatik yang terdiri dari dua cincin aromatik yang dihubungkan dengan sistem karbonil tak jenuh tiga karbon a,b sebagai inti pusat [21, 22]. Ini adalah komponen alami yang ditemukan di berbagai tanaman alami yang dapat dimakan dan dianggap sebagai senyawa prekursor untuk rute sintetis flavonoid dan isoflavonoid seperti pirazolin, pirimidin, flavanol, flavon, flavanon, isoflavon, auron, antosianidin, dihidroflavanol, dan dihidrokalkon. Sistem karbonil tak jenuh a,b sangat penting untuk jenis aktivitas biologis, karena sistem ini didistribusikan di banyak produk alami seperti kalkon dan indanon, di mana molekulnya relatif lebih planar, dan transmisi efek elektronik dari substituen aril diarahkan ke gugus karbonil [7]. Sebelumnya banyak peneliti melaporkan bahwa chalcones disorot sebagai kelas baru inhibitor tirosinase dalam beberapa publikasi [26-29]. Baru-baru ini, Kim dan rekan kerja [30,31] merancang dan mensintesis serangkaian turunan chalcone dan mengevaluasinya untuk anti-in vitro mereka. aktivitas tirosinase dan anti-melanogenik terhadap melanosit murine.
Menurut data kami yang dilaporkan sebelumnya, turunan dengan perancah karbonil tak jenuh (E)-b-fenil-a,b menunjukkan penghambatan potensi tirosinase [32-34]. (E)-Benzylidene-1-indanones dapat menjadi agen anti-melanogenik yang menarik karena senyawa tersebut memiliki perancah karbonil (E)-b-fenil-a,b-tak jenuh dalam struktur kimianya. Khususnya, Radhakrishnan et al. (2015) [20]mendesain dan mensintesis serangkaian turunan benzilidena-1-indanonederivatif yang memiliki konfigurasi (Z) dan mengevaluasinya untuk aktivitas anti-tirosinase. Meskipun turunan (Z)-benzilidena-1-indanon ini telah diteliti aktivitas anti-tirosinase dan anti-melanogenik dari (E)-benzilidena-1-turunan indanon belum diteliti.
Oleh karena itu, kami merancang dan mensintesis tiga belas senyawa (BID1-13) dari kerangka 1-indanone yang mengandung benzilidena bentuk (E). Di antara senyawa sintetik ini, gugus 2,4-dihidroksi pada cincin B 1-indanon menunjukkan penghambatan tirosinase terbesar (sekitar 400-kali lipat lebih efektif daripada asam kojic, kontrol positif). Selain itu, kami mengevaluasi lebih lanjut aktivitas penghambatan tirosinase BID3 serta untuk mengkarakterisasi peran pengaturannya dalam sintesis melanin menggunakan sel melanoma B16F10. Dalam eksperimen yang diperluas, kami mengevaluasi potensi anti-melanogenik BID3 dan berusaha mengidentifikasi kinetika enzim dan studi docking molekuler. Dalam percobaan berturut-turut, potensi tirosinase seluler BID3 dan produksi melanin dalam sel melanoma B16F10 yang diinduksi oleh a-MSH dan IBMX juga dieksplorasi.
ANTI-OKSIDASI DAN MENURUT KULIT: EKSTRAK CISTANCHE
2. Bahan-bahan dan metode-metode
2.1. Reagen
Tirosinase jamur (EC 1.14.18.1), hormon perangsang alfa-melanosit (a-MSH), 3-isobutil-1-metilxantin (IBMX), L-tirosin, L-3,{{ 11}}dihidroksifenilalanin (L-DOPA), dimetil sulfoksida (DMSO), asam kojic, asam ftalat, dan asam trans-sinamat dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Dulbecco'smodified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), streptomycin, dan amphotericin dibeli dari WELGENE Inc.(Gyeongsan-si, Korea Selatan). Semua reagen lainnya dibeli dari Sigma-Aldrich.
2.2. Kimia
2.2.1. Metode umum
Semua reagen diperoleh secara komersial dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kolom dilakukan masing-masing pada pelat 60F245 pralapis Merck dan MP Silika 40–63, 60 . Data spektroskopi massa resolusi tinggi (HR) diperoleh pada Agilent AccurateMass quadruple-time of flight (Q-TOF) kromatografi cair (LC) spektrometer massa (Agilent, Santa Clara, CA, USA) dalam mode positif ESI. Spektrum resonansi magnetik nuklir (NMR) direkam pada spektrometer Varian Unity INOVA 400 atau spektrometer Varian UnityAS500 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) untuk 1H NMR (400 dan 500 MHz) dan untuk 13C NMR (100 MHz), masing-masing . DMSO d6, CD3OD, dan CDCl3 digunakan sebagai pelarut NMR untuk sampel NMR. Konstanta kopling (J) dan nilai pergeseran kimia masing-masing diukur dalam hertz (Hz) dan bagian per juta (ppm). Singkatan yang digunakan dalam analisis data 1H NMR adalah sebagai berikut: s (singlet), bs (broad singlet), d (doublet), dd (doublet doublet), t (triplet), TD (triplet doublet), q ( kuartet), dan m (banyak).
2.2.2. Prosedur untuk sintesis BID1–13
Suatu larutan benzaldehida (1,1–1,2 Persamaan) dan 1-indanon (100 mg, 0,76 mmol) dalam 1 M dalam asam asetat HCl (0,4 mL) diaduk pada suhu kamar selama 4-48 jam. Setelah penambahan air, endapan disaring dan dicuci dengan air dan heksana: etilasetat (1:1), heksana: diklorometana (4:1–1:1), atau campuran diklorometana dan metanol, tergantung pada sifat-sifat benzaldehida yang tersisa. untuk memberikan (E)-benzylidene-1-indanones (BID1–13) dengan hasil 32,8–99,1 persen . Karakterisasi struktural (1H dan 13C NMR dan data massa semua BID) dari senyawa yang disintesis disediakan dalam informasi tambahan.
2.2.2.1. (E)-2-(4-Hidroksibenzilidena)-2,3-dihidro-1H-inden-1-satu(BID1).
padat kuning; hasil, 93,4 persen; waktu reaksi, 6 jam; rumus molekul, C16H12O2; mp, 224,7–225,9 C; 1H NMR (400 MHz,DMSO d6) d 10,10 (s, 1H, OH), 7,72 (d, 1H, J=7.6 Hz, 7- H), 7,64–7,58 (m, 4H, 4-H, 5-H, 20-H, 60-H), 7,43 (s, 1H, vinylic H), 7,39 (t,1H, J=7.2 Hz, 6-H), 6,87 (d, 2H, J=8.0 Hz, 30-H, {{46 }}H), 3,99 (dtk, 2H,CH2); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193.9, 160.1, 150.4, 138.3,135.1, 134.0, 133.6, 132.2, 128.2, 127.2, 126.7, 124.1, 116,7, 32.6;HRMS (ESI plus ) m/z C16H13O2 (M plus H) ditambah calcd 237.0910, obsd 237.0911.
2.2.2.2. (E)-2-(3,4-Dihidroksibenzilidena)-2,3-dihidro-1H-inden-1-satu (BID2).
padat kuning; hasil, {{0}},6 persen ; waktu reaksi, 5 jam; rumus molekul, C16H12O3; mp, 251,2–252,4 C; 1H NMR (400 MHz,DMSO d6) d 9,65 (s, 1H, OH), 9,24 (s, 1H, OH), 7,72 (d, 1H,J=7 0,6 Hz, 7-H), 7,66–7,61 (m, 2H, {{30}}H, 5-H), 7,42 (t, 1H,J {{35 }}.2 Hz, 6-H), 7,35 (s, 1H, vinylic H), 7,19 (s, 1H, 20-H), 7.08 (d,1H , J=8.0 Hz, 60-H), 6,83 (d, 1H, J=8.0 Hz, 50-H), 3,98 (s, 2H,CH2 ); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193.8, 150.4, 148.7, 146.3.138.3, 135.1, 134,5, 132.0, 128.2, 127.3, 127.1, 125.0, 124.0.118.2, 116,7, 32.7; HRMS (ESI plus ) m/z C16H13O3 (M plus H) plus calcd253.0859, obsd 253.0857.
2.2.2.3. (E)-2-(2,4-Dihidroksibenzilidena)-2,3-dihidro-1H-inden-1-satu (BID3).
padat kuning; hasil, 5{{20}},9 persen ; waktu reaksi, 10 jam; rumus molekul, C16H12O3; mp, 198.5–199.9 C (des.); 1H NMR(500 MHz, CD3OD) d 8,17 (s, 1H, vinylic H), 7,82 (d, 1H, J=8.0 Hz,60-H), 7,67–7,63 (m, 3H , 4-H, 5-H, 7-H), 7,45 (t, 1H, J=7.0 Hz, 6-H), 6,45 (d , 1H, J=8.5 Hz, 50-H), 6,39 (dtk, 1H, 30-H), 4,01 (dtk, 2H,CH2); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193.9, 161.6, 160.4, 150.3,138.6, 134,8, 131.7, 130.3, 128.7, 128.1, 127,2, 123,9, 114,3,108.6, 103.1, 32.7; HRMS (ESI plus ) m/z C16H13O3 (M plus H) plus calcd253.0859, obsd 253.0858.
2.2.2.4. (E)-2-(4-Hidroksi-3-metoksibenzilidena)-2,3-dihidro-1Hinden-1-satu (BID4).
padat kuning; hasil, 52.0 persen ; waktu reaksi, 4 jam;rumus molekul, C17H14O3; mp, 186,9–187,4 C; 1H NMR(400 MHz, DMSO d6) d 9,71 (s, 1H, OH), 7,73 (d, 1H, J=7.6 Hz, 7- H), 7,67–7,62 (m, 2H, 4-H, 5-H), 7,45 (d, 1H, J=2.{{50}} Hz , 20-H), 7,43(t, 1H, J=7.2 Hz, 6-H), 7,31 (s, 1H, vinylic H), 7,24 (dd, 1H, J=8.0,2,0 Hz, 60-H), 6,87 (d, 1H, J=8.0 Hz, 50-H), 4,05 (d, 2H, CH2 ), 3,84(s, 3H, OCH3); 13C NMR (100 MHz, DMSO d6) d 193.9, 150.5.149.7, 148.5, 138.3, 135.2, 134.4, 132.3, 128.2, 127.3, 127.1,125.7, 124.1, 116,6, 115.4, 56,3, 32.5; HRMS (ESI plus ) m/z C17H15O3(M plus H) plus calcd 267.1016, obsd 267.1016.
2.3. Evaluasi biologis
2.3.1. Uji penghambatan tirosinase jamur
Uji aktivitas penghambatan tirosinase dilakukan menggunakan tirosinase jamur seperti yang dijelaskan sebelumnya, dengan sedikit modifikasi [35,36]. Secara singkat, 10 mL konsentrasi tertentu dari masing-masing senyawa (0,0005–50 mM) dan 20 mL jamur tirosinase (1000 unit/mL) dalam 50 mM dapar fosfat (pH 6,5) ditambahkan ke dalam reaksi 170 mL campuran dalam 96-mikroplate sumur (Corning, USA). Rasio 1 mM L-tirosin atau larutan L-DOPA, 50 mM buffer kaliumfosfat (pH 6,5), dan air suling adalah 10:10:9. Campuran reaksi diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit. Setelah itu, jumlah dopakrom yang dihasilkan di setiap sumur diukur dengan analisis spektrofotometri pada 492 nm (OD492) menggunakan pembaca lempeng mikro. Tingkat penghambatan tirosinase ( persen ) dihitung sebagai (1 Abssample/Abskontrol) 100 persen. Derajat inhibisi sampel dinyatakan sebagai konsentrasi yang dibutuhkan untuk inhibisi 50 persen (IC50).
2.3.2. Analisis kinetik enzim dengan tirosinase
Untuk menentukan mekanisme kinetik penghambatan, dua metode kinetika komplementer digunakan: Lineweaver-Burk dan Dixonplots [37-39]. Menggunakan plot Lineweaver-Burk (plot timbal balik ganda), jenis penghambatan BID3 ditentukan menggunakan berbagai konsentrasi L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5, dan 1 mM), sebagai substrat, dengan tidak adanya dan adanya berbagai konsentrasi BID3 (1, 2, dan 4 lM). Sebuah plot Dixon (plot timbal balik tunggal) penghambatan fortyrosinase diperoleh dengan adanya berbagai konsentrasi L-DOPA (0.125, 0.25, 0.5, dan 1 mM ). Konsentrasi BID3 adalah 1, 2, dan 4 mM. Prosedur enzimatik terdiri dari metode uji tirosinase yang dijelaskan sebelumnya. Konstanta penghambatan (Ki) ditentukan dari interpretasi plot Dixon.
2.3.3. Simulasi docking molekul tirosinase
Untuk menentukan struktur kompleks enzim-inhibitor dan untuk memastikan akurasi, pengulangan, dan keandalan hasil docking, kami menggunakan perangkat lunak AutoDock4.2. Untuk studi dicking, struktur kristal target protein tirosinase jamur diperoleh dari penyelarasan urutan protein (Protein Data Bank (PDB ID: 2Y9X) (http://www.rcsb.org/adb) [40] Simulasi docking otomatis dilakukan antara tirosinase dan asam kojic, asam ftalat, asam sinamat, atau BID3. Untuk prosedur docking: mengubah 2D menjadi struktur 3D, menghitung muatan, dan menambahkan atom hidrogen menggunakan program ChemOffice (http://www.cam bridgesoft.com) [41 Ligan Scout 4.1.5 digunakan untuk prediksi kemungkinan interaksi antara ligan dan tirosinase dan identifikasi farmakofor.
2.3.4. Kultur sel dan uji viabilitas sel
Sel murine melanoma B16F10 dibeli dari Korean Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea) dan dikultur dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10 persen FBS dan 1 persen streptomisin, dan kemudian diinkubasi pada 37 C, dilembabkan dengan 5 persen CO2 atmosfer. Analisis viabilitas sel dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [42]. Secara singkat, cellseeded pada kepadatan 1.104 sel/sumur dalam piringan 96-selama 24 jam. Pada hari berikutnya, sel-sel tersebut diberi konsentrasi BID3 yang berbeda dan diinkubasi selama 24 atau 48 jam, masing-masing. Kemudian, 10 mL larutan EZ-Cytox ditambahkan ke setiap sumur dan sel diinkubasi selama 2-4 jam. Absorbansi ditentukan menggunakan ELISA pada panjang gelombang 450 nm. Setiap pengujian dilakukan dalam rangkap tiga.
2.3.5. Uji kandungan melanin
Kandungan melanin ditentukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [43]. Sel melanoma B16F10 (2 105 sel/sumur) diunggulkan di 6-pelat kultur sumur. Untuk menentukan efek penghambatan BID3 pada melanogenesis, media segar diganti dengan media yang mengandung BID3 (1, 5, dan 10 lM) atau asam kojic (10 mM) sebagai kontrol positif selama 1 jam, dan kemudian distimulasi dengan a-MSH (5 lM). ) dan IBMX (200 mM) selama 48 jam. Setelah dicuci dua kali dengan PBS, sel-sel dipisahkan dengan inkubasi di Tripsin/EDTA, dan pelet dilarutkan dalam 100 mL NaOH 1 N, kemudian diinkubasi pada suhu 60 C selama 1 tangan dicampur untuk melarutkan melanin. Kandungan melanin ditentukan dengan mengukur absorbansi pada 405 nm dengan menggunakan pembaca ELISA (TECAN, Sunrise, Austria). Kandungan melanin dihitung menggunakan persamaan berikut: (sampel/kontrol) - 100 persen. Semua penentuan dilakukan dalam rangkap tiga.
2.3.6. Aktivitas tirosinase seluler
Aktivitas tirosinase seluler dinilai seperti yang dijelaskan sebelumnya, dengan sedikit modifikasi [44,45]. Secara singkat, 2 105/sel ditempatkan dalam cawan 6-well dan diinkubasi semalaman. Sel-sel diekspos ke berbagai konsentrasi asam orkojic BID3 (1, 5, dan 10 mM) (10 mM) selama 1 jam, dan kemudian distimulasi dengan a-MSH (5 mM) dan IBMX (200 mM) selama 48 jam. Setelah dibilas dua kali dengan PBS, sel dilisiskan dengan 100 mL larutan lisis yang mengandung 50 mM dapar fosfat (pH 6,5), 0,1 mM fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF), dan 1 persen Triton X-100 dan dibekukan pada 80 C selama 30 menit. Lisat dicairkan dan disentrifugasi pada kecepatan 12,000 rpm selama 30 menit pada suhu 4 C. Kemudian, supernatan (80 mL) digabungkan dengan 2 mg/mL L-DOPA (20 mL) dalam cawan sumur 96- . Setelah inkubasi pada 37 C selama 30 menit, kerapatan optik pada 492 nm diukur menggunakan pembaca ELISA (TECAN, Salzburg, Austria). Konsentrasi protein ditentukan menggunakan reagen uji protein BCA menggunakan BCA sebagai standar (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).
Manfaat ekstrak Cistanche: menghambat tirosinase.
2.3.7. Analisis statistik
Semua data disajikan sebagai mean ± standard error of mean (SEM). Data dianalisis dengan one way analysis of variance (ANOVA) untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan, dilanjutkan dengan uji posthoc Bonferroni. Nilai p < 0.05="" dianggap="" signifikan="" secara="">
3. Hasil dan Pembahasan
3.1. Kimia
(E)-benzilidena-1-turunan indanon (BID1-13) disintesis menurut Skema umum 1. Dalam penelitian ini, tiga belas (E)-2-benzilidena-1-turunan indanon disintesis dan sifat penghambatan tirosinase diperiksa. Target (E)-2-benzilidena-1-turunan indanon disintesis menggunakan kondisi asam (1 M HCl dalam asam asetat). Reaksi ini menghasilkan target (E)-2-benzilidena-1- turunan indanon dengan hasil 32,8–99,1 persen. Tampaknya hanya isomer-E dari 2-benzilidena-1-indanon yang dihasilkan karena regangan A yang dikenal sebagai regangan 1,3-alilik. Strain-A (sterikindrance) antara cincin fenil dan gugus karbonil pada isomer-Z tampaknya lebih besar daripada antara fenil ringan dan gugus metilen pada isomer-E. Struktur senyawa sintetik diverifikasi oleh 1H dan 13C NMR dan spektrometri massa seperti yang dijelaskan dalam bagian eksperimental (Gbr. S1-S38). Secara khusus, pergeseran kimia proton olefin dilindungi dalam isomer E dari 2- benzilidena karena efek anisotropik dari gugus karbonil dan muncul di bawah (di atas 7 ppm) dibandingkan dengan isomer Z (<7 ppm)="" [46].="" the="" chemical="" shifts="" of="" olefinic="" protons="" in="" the="" benzylidene-1-indanones="" appeared="" in="" the="" range="" of="" 7.31–8.17="" ppm.="" therefore,="" the="" benzylidene-1-indanone="" derivatives="" were="" determined="" to="" be="" (e)-stereoisomers.="" we="" found="" that="" the="" presence="" of="" hydroxyl="" or="" methoxyl="" group="" at="" the="" 2-position="" of="" the="" phenyl="" ring="" moves="" the="" chemical="" shift="" of="" the="" olefinic="" proton="" to="" 0.5–0.8="" ppm="">
Skema 1. Sintesis (E)-2-benzilidena-1-indanon.
3.2. Sifat penghambatan tirosinase dari senyawa
Potensi penghambatan tirosinase dari turunan (E)-benzilidena-1-indanones diperiksa menggunakan tirosinase jamur. Mikofenolat (L-tirosin) dan difenol (L-DOPA) digunakan sebagai substrat untuk percobaan ini [35]. Reaksi enzim dilakukan dengan tirosinase, substrat, dan inhibitor uji. Semua senyawa yang diuji menunjukkan penghambatan yang bergantung pada konsentrasi. Nilai IC50 dari (E)-benzylidene-1-indanonesturunan ditunjukkan pada Tabel 1.
Dalam substrat L-tirosin dan L-DOPA, BID3 menunjukkan aktivitas penghambatan yang kuat dengan nilai IC50 0.{{10}}34 ± 0.{{ 27}}224 mM dan 1,39 ± 0.00004 mM, masing-masing, dibandingkan dengan asam kojic kontrol positif, yang memiliki nilai IC50 masing-masing 13,77 ± 0,20 mM dan 33,14 ± 0,93 mM (Gbr. 1A). Selanjutnya, BID6 menunjukkan aktivitas yang kuat terhadap L-tirosin dan L-DOPA dengan nilai IC50 masing-masing sebesar 5,00 ± 0,91 mM dan 53,11 ± 2,79 mM. BID1 menunjukkan penghambatan yang signifikan terhadap tirosinase melalui jalur L-tirosin dan L-DOPA, dengan nilai IC50 masing-masing 39,74 ± 3,71 mM dan 130,0 ± 5,39 mM. BID4 dan BID11 menunjukkan aktivitas penghambatan tirosinase sedang. Turunan lainnya tidak aktif. Demikian pula, BID2 menunjukkan aktivitas yang signifikan terhadap L-tirosin dan L-DOPA, dengan nilai IC50 41,27 ± 3,03 mM dan 52,93 ± 2,62 mM. Selain itu, inhibitor tipe campuran yang dilaporkan, asam ftalat dan asam sinamat tidak menunjukkan penghambatan. efek pada konsentrasi 200 mm [47].
Konsisten dengan temuan studi hubungan struktur-aktivitas (SAR), turunan yang mengandung (E)-benzilidena-1-substituen indanon pada cincin fenil secara nyata mempengaruhi potensi penghambatan tirosinase. BID3, yang menghambat tirosinase dengan potensi tertinggi, mengandung 2-gugus hidroksi dengan adanya 4-gugus hidroksi dan sangat menghambat aktivitas tirosinase (BID1 vsBID3). Hasil ini menunjukkan bahwa 2,4-gugus dihidroksi (bagian resorsinol) dalam struktur cincin fenil mungkin bertanggung jawab untuk peningkatan penghambatan tirosinase. Menariknya, dalam penelitian sebelumnya tentang inhibitor tirosinase sintetik potensial, kami menunjukkan bahwa substitusi 2,4-dihidroksi berpotensi menghambat aktivitas tirosinase [48,49]. Selain itu, data SAR kami juga menunjukkan bahwa pengenalan gugus hidroksi 3-dengan adanya gugus hidroksi 4-mempengaruhi penghambatan tirosinase. Fenomena ini ditunjukkan dengan penemuan bahwa 4-metoksi-3-cincin hidroksi fenil meningkatkan aktivitas penghambatan terhadap tirosinase, sedangkan pengenalan gugus 3,4-dihidroksi (bagian katekol) menurunkan aktivitas penghambatan tirosinase ( BID2 vs BID6) [35]. Hasil ini menunjukkan bahwa gugus metoksi 3-hidroksi-4-juga bertanggung jawab atas aktivitas penghambatan tirosinase. Namun demikian, dalam penelitian kami saat ini, BID9 dan BID11, yang mengandung 2,4-dimetoksi fenil atau 3,5-gugus dimetoksi fenil, menunjukkan aktivitas penghambatan tirosinase sedang. Berdasarkan nilai IC50 melalui jalur L-tirosin dan L-DOPA, BID3 menunjukkan aktivitas penghambatan tirosinase yang paling kuat oleh karena itu, kami mempelajari lebih lanjut mekanisme yang mendasari efek penghambatan ini. Radhakrishnan dkk. (2015) [20] melaporkan bahwa hidroksil tersubstitusi (Z)-benzylidene-1-senyawa indanone inhibitor tirosinase kuat. Meskipun penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa hidroksil-tersubstitusi (Z)-benzilidena-1-turunan indanon memiliki aktivitas anti-tirosinase, sejauh pengetahuan kami, belum ada laporan penghambatan tirosinase oleh (E)-benzilidena-1- turunan indanone menggunakan eksperimen berbasis sel.
Tabel 1. Potensi penghambatan tirosinase jamur dari 2,3-dihydro-1H-inden-1-satu (1-indanone) seperti chalcone tersubstitusi
turunan (BID1-13).
Gambar 1. Penghambatan aktivitas tirosinase jamur yang bergantung pada konsentrasi oleh BID3 dan asam kojic (kontrol positif) (n=3).
3.3. Analisis kinetik enzim penghambatan tirosinase
Karena BID3 adalah penghambat paling kuat, kami mempelajari lebih lanjut mekanisme yang mendasari efek penghambatannya. Dalam upaya untuk menjelaskan cara penghambatan enzim, analisis kinetik dilakukan pada berbagai konsentrasi L-DOPA dan berbagai konsentrasi BID3. Plot Dixon dan Lineweaver-Burk digambar menggunakan data yang diperoleh dari studi kinetik untuk mengkonfirmasi pola inhibisi dan konstanta inhibisi (Ki) ditentukan dengan interpretasi plot Dixon (Gbr. 2A dan B). Konsentrasi L-DOPA dilambangkan sebagai berikut: 1, 2, 4 mM. Persimpangan terletak di sisi kiri, menunjukkan penghambatan tipe campuran terhadap tirosinase dengan nilai Ki 2,4 mM (Gbr. 2B). Nilai Ki menunjukkan konsentrasi yang diperlukan untuk membentuk kompleks enzim-inhibitor, sehingga inhibitor dengan nilai Ki yang lebih rendah menunjukkan aktivitas penghambatan tirosinase yang lebih besar.
Docking molekuler telah memberikan kontribusi wawasan penting dalam penemuan obat selama bertahun-tahun. Namun, prosedur docking bertujuan untuk mengidentifikasi posisi ligan yang benar dalam kantong pengikat aprotein dan untuk memprediksi afinitas antara ligan dan protein. Dengan kata lain, docking menggambarkan proses di mana dua molekul cocok bersama dalam ruang tiga dimensi. Untuk menentukan apakah BID3 mengikat ke situs aktif tirosinase, analisis docking molekuler dilakukan untuk mengidentifikasi kemungkinan posisi pengikatan BID3 dalam struktur kristal tirosinase jamur (PDB ID: 2Y9X) (Gbr. 3A). Hasil ini dihitung menggunakan AutoDock4.2. program. Posisi pengikatan yang paling stabil adalah dengan skor terendah [50]. Baru-baru ini, Hassani dkk. [47] melaporkan bahwa asam sinamat dan asam ftalat adalah inhibitor tirosinase mode campuran. Jadi, bantuan, asam sinamat, dan asam ftalat digunakan untuk memvalidasi hasil docking [51]. Model docking molekul BID3 dan asam kojic (penghambat tipe kompetitif yang terkenal) di situs katalitik tirosinase diilustrasikan pada Gambar. 3B [52 ]. Kompleks inhibitor tirosinase-BID3 menyajikan energi ikat 6,28 kkal/mol termasuk dua ikatan hidrogen dengan residu tirosinase ASN260 dan MET280, dan interaksi hidrofobik diamati antara residu BID3 dan tirosinase VAL248, PHE264, dan VAL283, yang selanjutnya menstabilkan interaksi di situs katalitik untuk jamur tirosinase (Tabel 2, dan Gambar 3E dan H). Selain itu, model docking molekul BID3, asam ftalat (inhibitor alosterik 1), dan asam sinamat (inhibitor alosterik 2) di dua situs alosterik diilustrasikan pada Gambar. 3C dan 3D. Asam ftalat dan asam sinamat diambil sebagai ligan referensi di situs alosterik 1 dan 2, masing-masing [47,51]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3F dan I, BID3 dan asam ftalat menunjukkan satu ikatan hidrogen dengan residu TRY140 dari tirosinase, dan tiga residu interaksi hidrofobik dengan LEU24, PHE147, dan ILE148 dari tirosinase di situs alosterik 1. Interaksi ligan yang sesuai dari BID3 dan asam sinamat di situs alosterik2 tirosinase termasuk ikatan hidrogen antara ASP312 dan LYS376 dari tirosinase, sedangkan THR308 berinteraksi secara hidrofobik di situs alosterik 2 (Gbr. 3G dan J). Selanjutnya, pengikatan tirosinase BID3-ditemukan untuk mengerahkan energi pengikatan di kedua situs alosterik tirosinase (4,38 dan 5,68 kkal/mol, masing-masing), menunjukkan afinitas pengikatan tinggi dengan kedua situs alosterik. Berdasarkan studi enzimkinetik, BID3 memberikan penghambatan tipe campuran, kemampuan mengikat BID3 dengan situs katalitik dan dua situs alosterik menegaskan penghambatan tipe campuran tirosinase.
Gambar 2. Plot Lineweaver-Burk (A) dan Dixon (B) untuk penghambatan tirosinase jamur oleh BID3 menggunakan L-DOPA sebagai substrat.
3.4. Aktivitas biologis
Untuk mengeksploitasi efek anti-tirosinase BID3 dalam model kultur sel, kami memeriksa efek sitotoksiknya pada sel B16F10. Sel diperlakukan dengan konsentrasi BID3 yang berbeda (1-20 mM) selama 48 jam dan dinilai menggunakan uji EZ-Cytox. Hasilnya menunjukkan bahwa BID3 tidak memiliki efek sitotoksik yang signifikan pada sel melanoma B16F10 hingga 20 mM (Gbr. 4A dan B). Oleh karena itu, percobaan selanjutnya dilakukan menggunakan BID3 hingga 20 mM.
Tabel 2 Tempat pengikatan dan skor docking BID3 pada tirosinase jamur (PDB ID: 2Y9X) sebagaimana ditentukan menggunakan program AutoDock4.2.
Melanogenesis diatur oleh kaskade enzim tirosinase. Untuk alasan ini, beberapa senyawa pemutih kulit telah dikembangkan untuk mengurangi aktivitas tirosinase. Asam kojic, penghambat tirosinase, digunakan sebagai kontrol positif [53]. Jadi, untuk menyelidiki efek BID3 pada hiperpigmentasi yang diinduksi peningkatan cAMP, sel B16F10 diperlakukan dengan a-MSH dan IBMX dengan adanya BID3 (1, 5, dan 2{{20}} mM) selama 48 jam, dan kandungan melanin, dan aktivitas tirosinase seluler ditentukan (Gbr. 4C dan D). Pengobatan dengan a-MSH dan IBMX menginduksi peningkatan yang signifikan (P <0,001#) dalam="" kandungan="" melanin="" (gbr.="" 4c)="" dan,="" aktivitas="" tirosinase="" seluler="" (gbr.="" 4d)="" dalam="" sel="" b16f10="" dibandingkan="" dengan="" kontrol="" yang="" tidak="" diobati.="" namun,="" pengobatan="" bid3="" secara="" signifikan="" (p="">< 0,01**;="" p="">< 0,001***)="" dan="" penurunan="" kandungan="" melanin="" dan="" aktivitas="" tirosinase="" seluler="" sel="" b16f10="" yang="" bergantung="" pada="" konsentrasi="" dibandingkan="" dengan="" sel="" yang="" diobati="" dengan="" a-msh="" atau="" ibmx,="" menunjukkan="" bahwa="" penurunan="" melanin="" seluler="" mungkin="" disebabkan="" oleh="" penghambatan="" aktivitas="" tirosinase="" .="" dengan="" demikian,="" temuan="" ini="" dengan="" jelas="" menunjukkan="" bahwa="" bid3="" memberikan="" efek="" anti-melanogenik="" yang="" menghambat="" aktivitas="" tirosinase="" dan="" sintesis="" melanin="" dalam="" sel="" b16f10="" tanpa="" menginduksi="">
Indanone adalah salah satu struktur istimewa kimia obat dan umumnya dikaitkan dengan berbagai senyawa farmakologis aktif [54]. Bagian indanon hadir dalam berbagai produk alami yang aktif secara fisiologis. Mengingat hal ini, Okpekonet al., [55] melaporkan senyawa 1-indanone baru, diisolasi dari akar Uvaria. Senyawa ini merupakan turunan 1-indanon pertama yang diisolasi dari tumbuhan. Nagle et al., [56] melaporkan indane-aldehida termetilasi baru diisolasi dari marinecyanobacterium sebagai pengatur angiogenesis tumor. Demikian juga, sejak pentingnya biologis inti indanone, beberapa tahun terakhir para peneliti telah berfokus pada pengembangan analog indanone yang aktif secara farmakologis sebagai agen terapeutik. Keragaman struktural 1-indanon menyiratkan berbagai respons biologis dan senyawa ini dapat diterapkan di bidang pertanian dan kedokteran. Berbagai senyawa berbasis indanon telah dikembangkan sebagai penyakit anti-Alzheimer [16,57–59], antikanker [60– 62), antimikroba [63,64], dan agen antivirus [65,66]. Karena potensi aplikasi yang luas, 1-indanon merupakan objek yang menarik untuk penelitian lebih lanjut dan diinginkan untuk merancang kelas baru untuk sintesisnya.
cistanche tubolosa: anti-penuaan
4. Kesimpulan
Untuk mengidentifikasi inhibitor tirosinase ampuh baru, kami telah merancang dan mensintesis tiga belas (E)-benzilidena-1-turunan indanon. Di antara senyawa ini, (E)-2-(2,4-dihidroksi-benzilidena){ {6}},3-dihydro-1H-in-1-one (BID3) berpotensi menghambat aktivitas tirosinase (IC50=0.034 dan 1,39 mM, untuk L-tirosin dan L-DOPA, masing-masing), yang lebih baik dari senyawa referensi, asam kojic (IC50=13,77 mM dan 33,14 mM, masing-masing). Hubungan struktur-aktivitas mengungkapkan bahwa keberadaan gugus dihidroksil pada posisi 2 dan 4-dari kerangka (E)-benzilidena-1-indanon meningkatkan aktivitas melawan tirosinase. Modus penghambatan enzimatik enzim, ditentukan oleh plot Lineweaver-Burk dan Dixon, menunjukkan bahwa BID3 adalah inhibitor tipe campuran. Studi docking molekuler menunjukkan bahwa pengikatan di situs aktif dan di situs alosterik adalah mekanisme penting terhadap aktivitas penghambatan tirosinase. Berdasarkan hasil ini, BID3 tampaknya merupakan inhibitor tirosinase yang poten untuk pengobatan kelainan kulit seperti hiperpigmentasi.
manfaat cistanche gurun: menghambat pembentukan melanin