Aktivitas Antioksidan Dan Anti-Melanogenik Dari Ekstrak Licorice (Wongam, Glycyrrhiza Glabra × G. Uralensis) yang Diperlakukan Panas

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

Min Hye Kang 1,2, Gwi Yeong Jang 1, Yun-Jeong Ji 1, Jeong Hoon Lee 1, Su Ji Choi 1, Tae Kyung Hyun 2,* andHyung Don Kim 1,*

Abstrak:Melanin adalah pigmen coklat atau hitam yang melindungi kulit dari radiasi ultraviolet dan spesies oksigen reaktif (ROS). Namun, kelebihan produksi melanin dikaitkan dengan lentigines, melasma, bintik-bintik dan kanker kulit.akar manistelah menunjukanantioksidan, anti-tumor, anti-platelet, anti-inflamasi, dan aktivitas imunomodulator dan digunakan sebagai pengobatan alami untuk kulitpemutih.Kami bertujuan untuk mengkonfirmasi potensi Wongam, kultivar baru licorice yang dikembangkan oleh RuralDevelopment Administration (RDA), sebagaipemutihagen kosmetik. Selain itu, kami memverifikasi efek perlakuan panas pada bioaktivitas licorice dengan membandingkanantioksidandananti-melanogenikaktivitas ekstrak licorice sebelum dan sesudah pemanasan (130 C). Ekstrak licorice yang diberi perlakuan panas (WH-130)menunjukkan aktivitas penangkap radikal yang lebih tinggi dalam ABTS plus (2,20-azino-bis-(3-etil benzotiazolin-6-sulfonik assay diammonium) dan DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil). Selain itu, WH-130 menghambat melanogenesis lebih efektif karena penurunan regulasi tirosinase dalam sel melanoma B16F10 daripada yang tidak dipanaskan.akar manisekstrak. Selain itu, perlakuan panas meningkatkan kandungan fenolik total. Secara khusus, isoliquiritigenin, danantioksidandananti-melanogeniksenyawa licorice, diproduksi dengan perlakuan panas. Kesimpulannya, WH-130, dengan peningkatan kadar fenolik bioaktif seperti isoliquiritigenin, memiliki potensi untuk dikembangkan menjadi kulit baru.pemutihbahan dengan aplikasi dalam kosmetik.

Kata kunci: anti-melanogenikaktivitas; perawatan panas;akar manis; sel melanoma murine (B16F10)

Cistanche adalah antioksidan

1. Perkenalan

akar manis(Glycyrrhiza spesies), ramuan abadi dengan penggunaan obat dalam keluarga Leguminosae, didistribusikan secara luas di Asia Tengah, Cina, Rusia, Manchuria, Mongolia dan Eropa [1]. Ini telah lama digunakan sebagai agen penyedap dan pemanis. Akar kering dan stolon licorice telah digunakan untuk pengobatan pilek, batuk, asma, kelelahan dan infeksi saluran pernapasan karena aktivitas biologis licorice termasukantioksidanaktivitas anti-mikroba, anti-tumor, anti-platelet, anti-inflamasi dan imunomodulator [2,3]. Genus Glycyrrhiza terdiri dari sekitar 22 spesies licorice, termasuk G. uralensisFisch, G. glabra L. dan G. inflata Batal.

Wongam, kultivar hibrida interspesifik baru dari licorice, dikembangkan oleh Administrasi Pembangunan Pedesaan sebagai hibrida dari Glycyrrhiza glabra x G. uralensis (G. korshinskiGrig). Wongam memiliki hasil yang lebih tinggi dan ketahanan penyakit yang lebih baik daripada G. uralensis. Banyak penelitian telah dilakukan pada aktivitas biologis G. uralensis, sedangkan penelitian yang ada pada Wongam, kultivar baru, terbatas pada aktivitas anti-alergi, imunomodulator dan anti-ulkus [1,2]. Dengan demikian, perlu untuk menyelidiki bioaktivitas luas Wongam.

Komponen bioaktif utama dalamakar manisakar adalah flavonoid dan saponin triterpen, termasuk liquiritin, liquiritigenin, isoliquiritigenin (ISL) dan glycyrrhizin (atau glycyrrhizicacid) [4,5]. ISL adalah flavonoid yang ditemukan dalam licorice yang telah menunjukkan berbagai aktivitas farmasi, termasuk anti-platelet, anti-alergi, anti-tumor, anti-inflamasi danantioksidankegiatan [6-8]. ISL adalah produk hidrolisis dari isoliquiritin dalam akar licorice. Ini dapat menghambat melanogenesis melalui degradasi microphthalmia-associated transcriptionfactor (MITF) dengan aktivasi jalur sinyal protein kinase (ERK) yang diatur sinyal ekstraseluler. Akibatnya, degradasi MITF menekan ekspresi gen tirosinase(TYR) dan protein terkait tirosinase (TRP-1 dan TRP-2) dalam sel SK-MEL-2 [9,10].ISL dapat menghambat aktivitas mono dan difenolase TYR jamur serta themelanogenesis dalam melanosit [11].

Melanin, pigmen utama yang memberikan warna kulit, disintesis dalam melanosit epidermis dan disimpan dalam organel intraseluler yang disebut melanosom [12]. Pigmen melanin terdiri dari dua jenis yaitu eumelanin coklat atau hitam dan pheomelanin merah atau kuning. Melanogenesis dapat diinduksi oleh rangsangan eksternal, termasuk radiasi ultraviolet (UV), spesies oksigen reaktif (ROS) dan bahan kimia seperti -melanocyte-stimulating hormone (-MSH) dan isobutylmethylxanthine (IBMX), yang meningkatkan kadar siklik adenosin monofosfat (cAMP). Melanin melindungi kulit terhadap rangsangan ini, sementara produksinya yang berlebihan menyebabkan hiperpigmentasi kulit, yang dapat menyebabkan penyakit seperti kanker kulit [13-17]. Kulitpemutihagen seperti asam kojic, hydroquinone, arbutin dan asam askorbat, yang merupakan inhibitor TYR, telah digunakan untuk mengobati hiperpigmentasi pada beberapa produk kosmetik [13,18]. Melanogenesis diatur melalui berbagai jalur pensinyalan, dan sinyal ini terkait dengan peningkatan regulasi MITF. Aktivasi MITF mempromosikan ekspresi TYR dan TRPs (TRP-1, TRP-2). Kemudian, TYR mengkatalisis oksidasi L-tirosin menjadi3,4-dihidroksi-L-fenilalanin (L-DOPA), yang selanjutnya dioksidasi menjadi DOPAkuinon. TRP-2 mengubah dopakrom menjadi 5,6-dihidroksiindole-2-asam karboksilat (DHICA) atau 5,6-dihidroksiindole (DHI). Akhirnya, DHICA dan DHI dioksidasi oleh TRP-1, menghasilkan inmelanogenesis [19].

Proses termal mempengaruhi sifat fisikokimia dan biologi ekstrak tumbuhan. Mereka menghancurkan dinding sel dan memutuskan ikatan kovalen, menghasilkan pelepasan senyawa bioaktif [20,21]. Perlakuan panas pembuat bir menghabiskan ekstrak biji-bijian di atas 130 Meningkatkan kadar total fenolik (TPC) dan kadar flavonoid total (TFC), dengan peningkatan yang sesuai dalam aktivitas antioksidan [16,20,21]. Pemanasan kulit jeruk dapat menyebabkan pelepasan senyawa fenolik dan meningkatkanantioksidankegiatan [17].

Tujuan utama kami adalah untuk mengkonfirmasi potensi Wongam sebagai kulit alamipemutihbahan dalam kosmetik. Selain itu, penelitian ini juga dimaksudkan untuk membuktikan apakah perlakuan panas dapat meningkatkan aktivitas antioksidan dan anti-melanogenikakar manis. Kami menyelidikiantioksidankegiatan, bersama-sama dengan TPC ekstrak Wongam.Anti-melanogenikefek ekstrak Wongam diverifikasi oleh aktivitas penghambatan TYR dan kandungan melanin dalam sel melanoma.

Cistanche itu alamikulitpemutih herba

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Persiapan Sampel

Sampel disiapkan menurut metode yang dilaporkan sebelumnya [22].akar manis(Wongam, Glycyrrhiza glabra x G. uralensis, diidentifikasi oleh Yun Ji Lee dari NIHHS, RDA dan terdaftar di Herbarium Sumber Daya Obat Korea dengan nomor voucher MPS006326) dibudidayakan dan dipanen di Departemen Penelitian Tanaman Herbal (Eumsung,Chungcheongbuk-do, Korea ) pada tahun 2018, dan dikeringkan pada suhu 60 C selama 20 jam. 10 kgakar manisdipanen dan 1 kg digiling. Setelah pencampuran, masing-masing diperoleh 3 sampel WC atau WH. Licorice bubuk (5 g) ditempatkan dalam wadah kaca dengan 1 mL air suling dan diolah dalam autoklaf (Jisico, Seoul, Korea) selama 1 jam pada 130 C (WH-130). Licorice kontrol yang tidak diolah (WC , 5 g) dan WH-130 diekstraksi secara terpisah menggunakan 70 persen etanol (sampel: pelarut, 1:50, v:v) selama 24 jam pada suhu kamar (RT). Setelah penyaringan, ekstrak diuapkan di bawah vakum, beku-kering dan disimpan pada -80 C. Semua ekstrak dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO, USA) dan metanol (Sigma, St. Louis, MO, USA).

2.2. Penentuan Browning

Indeks kecoklatan dariakar manisekstrak (WC dan WH-130) dicatat berdasarkan nilai absorbansinya pada 420 nm (A420) yang diukur menggunakan pembaca lempeng mikro (BioTek, Winooski, VT, USA). Nilai absorbansi yang lebih tinggi pada 420 nm sesuai dengan indeks browning yang lebih tinggi [23,24].

2.3. Kandungan Fenolik Total (TPC)

Menurut metode yang dilaporkan sebelumnya [25], TPC diukur berdasarkan prinsip bahwa reagen Folin-Ciocalteu direduksi menjadi kromofor biru yang terdiri dari kompleks aphosphotungstic-phosphomolybdenum tergantung pada kondisi basa dan pada konsentrasi senyawa fenolik. Setiap sampel (10 L) dicampur dengan 2 persen natrium karbonat (200 L) dan kemudian reagen Folin-Ciocalteu (10 L). Campuran diaktifkan selama 30 menit di RT. Kemudian, absorbansi diukur pada 750 nm menggunakan pembaca lempeng mikro (BioTek, Winooski, VT, USA). TPC dihitung dari kurva standar asam galat dan hasilnya dinyatakan sebagai nilai ekivalen asam galat, ekstrak mg GAE g−1.

2.4. Penentuan Kapasitas Antioksidan

Aktivitas penangkapan radikal diukur dengan menggunakan 2,20-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin 6-asam sulfonat) garam diammonium (ABTS) menurut metode yang dijelaskan sebelumnya dengan sedikit modifikasi [19, 26]. Larutan kation radikal ABTS diproduksi dengan mencampurkan 2,6 mM kalium persulfat dan 7,4 mM ABTS dan membiarkan keduanya bereaksi selama 24 jam pada RT. Larutan ABTS kemudian diencerkan dengan air suling untuk mengatur absorbansi pada kisaran 1,000-1,500. Selanjutnya, 20 L sampel direaksikan dengan 180 L larutan ABTS plus, terlindung dari cahaya, dan campuran sampel dan larutan diinkubasi selama 30 menit pada RT. Absorbansi diukur menggunakan pembaca lempeng mikro (BioTek, Winooski, VT, USA) pada 735 nm. Dari kurva standar Trolox, ekuivalen Troloxantioksidankapasitas (TEAC) dihitung dan dinyatakan dalam mg setara trolox (TE) per g sampel kering.

2,2-Difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) larutan radikal dibuat dengan melarutkan0.2 mM DPPH ke dalam 99 persen etanol. Solusi DPPH diencerkan dengan air suling untuk anabsorbansi pada 520 nm 1000-1500. Kemudian, 50 L sampel dicampur dengan 200 L larutan DPPH dan direaksikan selama 30 menit di RT. Setelah reaksi, absorbansi campuran ditentukan pada 520 nm. Dari kurva standar Trolox, TEAC dihitung dan dinyatakan dalam mg TE per g sampel kering.

2.5. Analisis Kromatografi Cair Berkinerja Tinggi (HPLC)

Sebuah metode HPLC dimodifikasi diterapkan [22]. Konten ISL dariakar manisekstrak dianalisis oleh HPLC dengan detektor UV-terlihat (HPLC: 1200 series, Agilent Technologies,Santa Clara, CA, USA; kolom: SynergiTM, 250 × 4,6 mm, 4 m, Fusion-RP 8{{40}} , Phenomenex, Torrance, CA, USA). Fase gerak terdiri dari pelarut A (0,1 persen asam format dalam air) dan pelarut B (0,1 persen asam format dalam asetonitril). Program gradien untuk fase gerak dioperasikan di bawah gradien berikut: 0–8 menit (20–20 persen B), 8–30 menit (20–38 persen B), 30–42 menit (38–50 persen B), 42–47 menit (50–90 persen B), 47–53 menit (90–90 persen B), 53–54 menit (90–20 persen B) dan 54–60 menit (20–20 persen B) . Laju aliran, panjang gelombang deteksi dan volume injeksi masing-masing diatur ke 1,0 mL/menit, 360 nm dan 10 L. Larutan standar ISL dianalisis dengan empat konsentrasi yang berbeda (0,05, 0,1, 0,2, 0,4 mg/mL). Kurva kalibrasi (y=ax plus b) digunakan untuk menentukan konten ISL. Dalam persamaan regresi, x mengacu pada konsentrasi ISL (mg mL−1) dan y berarti luas puncak.

2.6. Uji Aktivitas Penghambatan Tirosinase Jamur

Uji aktivitas penghambatan TYR dilakukan menggunakan kit skrining penghambat TYR (BioVision, Milpitas, CA, USA). Setiap ekstrak (WC dan WH-130) dilarutkan dalam DMSO hingga konsentrasi akhir 250 g/mL. Asam kojic, yang digunakan sebagai kontrol positif, juga diencerkan hingga 250 g/mL dalam DMSO. Singkatnya, 20 L ekstrak atau asam kojic digabungkan dengan 50 L larutan enzim TYR. Setelah inkubasi di RT selama 10 menit, 30 L larutan substrat TYR ditambahkan ke setiap sumur. Konsentrasi akhir ekstrak dan asam kojic adalah 50 g/mL. Kerapatan optik sumur kemudian diukur pada 510 nm dalam mode kinetik selama 1 jam dengan pembaca pelat mikro (BioTek, Winooski, VT, USA).

bubuk cistanche: anti-oksidasi

2.7. Budaya sel

Sel murine melanoma B16F10 diperoleh dari American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Sel B16F10 dikultur dalam media Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) yang dilengkapi dengan 10 persen fetal bovine serum (FBS), 100 unit/mLof penisilin dan 100 g/mL streptomisin (Gibco, Grand Island, NY, USA) dalam suasana lembab yang mengandung 5 persen CO2 pada 37 C.

2.8. Uji Viabilitas Sel

Sitotoksisitas dariakar manisekstrak (WC dan WH-130) ke sel B16F10 ditentukan menggunakan MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,{{8 }}diphenyltetrazolium bromide] assay. Sel B16F10 dikultur pada 4 × 103 sel/sumur dalam piringan 96-selama 24 jam. Setelah itu, ekstrak ditambahkan ke dalam sel pada konsentrasi 50, 100 dan 200 g/mL dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 48 jam. Kemudian, larutan MTT ditambahkan ke setiap sumur (500 g/mL) dan plate diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37 C. Media di setiap sumur dibuang dan ditambahkan 100 L DMSO. Setelah dikocok selama 30 menit, absorbansi diukur pada 540 nm dengan pembaca lempeng mikro. Semua tes dilakukan dalam rangkap tiga.

2.9. Pengukuran Kandungan Melanin Seluler

Kandungan melanin intraseluler diukur menggunakan versi metode yang sedikit dimodifikasi yang dijelaskan sebelumnya [27]. Sel melanoma B16F10 diunggulkan dalam 6-pelat sumur dengan kepadatan 8 × 104 sel/sumur dan diinkubasi selama 24 jam. Sel-sel terkena ekstrak (WC dan WH-130, 100 g/mL), asam kojic (100 g/mL) atau ISL (10 M, Millipore Sigma, Burlington, MA, Amerika Serikat) selama 48 jam dalam adanya 100 M 3-isobutil-1-metilxantin (IBMX). Setelah perawatan, sel-sel dicuci dengan fosfat-buffered saline (DPBS) Dulbecco dan dilarutkan dalam 200 L NaOH 1 N selama 2 jam pada 90 C. Absorbansi pada 405 nm diukur menggunakan pembaca lempeng mikro.

2.10. Uji Aktivitas Tirosinase Seluler

Aktivitas TYR intraseluler diukur menggunakan versi yang sedikit dimodifikasi dari metode yang dijelaskan sebelumnya [27]. Sel melanoma B16F10 (8 × 104 sel/sumur) diperlakukan dengan ekstrak (100 g/mL) atau asam kojic (100 g/mL) dengan adanya 100 M IBMX selama 48 jam, dikumpulkan dan dicuci dengan DPBS. Sampel protein dilisiskan dalam 1 persen TrionX-100 (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) dengan buffer natrium fosfat (pH 6,8) dan kemudian disentrifugasi pada 15,000 rpm selama 10 menit. Fraksi supernatan dikumpulkan dan konsentrasi protein ditentukan dengan menggunakan kit uji asam bicinchoninic (BCA) (Waltham, MA, USA). Campuran reaksi yang terdiri dari 30 g protein (disesuaikan dengan 100 L dengan 1 persen Trion X-100) dan 100 L 10 mM L-DOPA ditambahkan ke setiap sumur dari 96-pelat sumur. Setelah inkubasi pada 37 C selama 1 jam, dopakrom dipantau dengan mengukur absorbansi pada 490 nm menggunakan pembaca lempeng mikro. Aktivitas TYR dihitung dengan rumus sebagai berikut:

Aktivitas tirosinase ( persen )=(OD405 sampel/OD405 kontrol) × 100

2.11. Reaksi Berantai Polimerase Waktu Nyata (RT-PCR)

Tingkat ekspresi mRNA dari gen terkait melanogenesis termasuk MITF, TYR, TRP-1 dan TRP-2 ditentukan menggunakan uji RT-PCR yang dimodifikasi [28]. Secara singkat, sel B16F10 diunggulkan di 6-piring sumur dengan kepadatan 8 × 104 sel per sumur dan dikultur selama 24 jam. Kemudian, sel diperlakukan dengan ekstrak (100 g/mL), asam kojic (100 g/mL) atau ISL (10 M) selama 48 jam. Total RNA diisolasi dari sel menggunakan reagen TRIzol (Ambion, Austin, TX, USA) dan kemudian konsentrasi RNA diukur menggunakan microplatereader. Setelah preparasi cDNA (2 g) menggunakan Reverse Transcriptase Premix Kit (ElpisBiotech, Daejeon, Korea) sesuai dengan protokol pabrikan, PCR real-time dilakukan menggunakan MITF, TYR, TRP-1, TRP-2 dan -aktin primer (Tabel 1, Bioneer, Daejeon, Korea) dengan kit SYBR Green (ProGEN, Heidelberg, Jerman) dalam instrumen PCR Waktu Nyata CFX96 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Semua data dinormalisasi ke tingkat -actinmRNA sebagai gen rumah tangga referensi.

2.12. Persiapan Lysates Sel dan Analisis Western Blot

Sel B16F10 diunggulkan di 6-piring sumur dengan kepadatan 8 × 104 sel per sumur, diinkubasi selama 24 jam dan kemudian diekstraksi (100 g/mL), asam kojic (100 g/mL ) atau ISL(10 M) selama 48 jam. Setelah dicuci dengan DPBS, sel dipanen dan dilisiskan dalam buffer Triton X-100(MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) yang mengandung 1 persen protease dan koktail penghambat fosfatase. Konsentrasi protein lisat seluruh sel diukur menggunakan kit uji aBCA (Waltham, MA, USA). Jumlah protein yang sama (20 g) dimasukkan ke dalam 10 persen gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida, yang dijalankan selama 4 jam pada 70 V. Kemudian, protein dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida (PVDF). Membran dicuci tiga kali dengan tris-buffered saline [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl] yang mengandung 0,1 persen Tween 20 (TBST) dan diblokir dengan 2 persen albumin serum sapi (GenDEPOT) selama 1 jam. Selanjutnya, membran diinkubasi semalaman pada suhu 4 C dengan antibodi primer (pengenceran 1:1000) selama 4 jam pada suhu kamar. MITF, TYR, TRP-1, TPR-2 dan -actin dideteksi dengan antibodi anti-MITF poliklonal kelinci (Abcam, Cambridge, UK); antibodi anti-TYR poliklonal kambing (Santa Cruz, Dallas, TX, USA); dan antibodi monoklonal antiTRP-1, anti-TRP-2 dan anti- -aktin tikus (Santa Cruz, Dallas, TX, USA). Setelah itu, membran dicuci beberapa kali dengan TBST dan diinkubasi dengan antibodi sekunder (pengenceran 1:2000) selama 1 jam, yaitu IgG anti-tikus kelinci, IgG anti-kambing mencit dan IgG anti-tikus kambing (Santa Cruz, Dallas, TX, USA), dilanjutkan dengan beberapa kali pencucian dengan TBST. Protein target dideteksi menggunakan reagen chemiluminescence (ECL) yang ditingkatkan (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) dengan Sistem Pencitraan ChemiDoc (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Kuantifikasi pita protein dilakukan menggunakan perangkat lunak ImageJ (versi 1.52a untuk Windows; NIH, Rockville, MD, USA) [28].

2.13. Analisis Statistik Data dianalisis menggunakan Microsoft Excel 2016 dan semua hasil eksperimen disajikan sebagai mean ± standar deviasi (SD) dari tiga pengukuran independen. Uji-t dua sampel siswa digunakan untuk menilai perbedaan antara kontrol dan sampel. Analisis varians satu arah (ANOVA) dan uji Duncan dilakukan dengan menggunakan Rsoftware (Versi 3.6.3) untuk menentukan signifikansi setiap perbandingan pada tingkat p < 0.05="" (*),="" p="">< 0,01="" (**)="" dan="" p="">< 0,001="" (***).="" analisis="" korelasi="" dilakukan="" dengan="" menggunakan="" prism5.02="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">

3. Hasil

3.1. Indeks Browning Ekstrak Licorice

Derajat kecoklatanakar manisekstrak ditunjukkan pada Gambar 1a. Hasil ini menegaskan bahwa ekstrak yang diberi perlakuan panas (WH-130, 0.965 ± 0.025 AU [unit absorbansi]) memiliki nilai indeks pencoklatan yang jauh lebih tinggi daripada yang tidak dipanaskan. ekstrak (WC, 0,758 ± 0,005 SA). Kami berharap bahwa pemrosesan termal meningkatkan pembentukan melanoidin di WH-130 dan bahwa perubahan ini mungkin terkait dengan berbagai aktivitas biologis.

3.2. Kandungan Fenolik Total (TPC) dari Ekstrak Licorice

Gambar 1b menunjukkan TPC dariakar manisekstrak. Kami menemukan perbedaan TPC antara WC dan WH{{0}}, karena WC memiliki TPC 12.093 ± 0,061 mg ekstrak GAE/g, sedangkan WH-130memiliki TPC sebesar 14.098 ± 0.781 mg GAE/g ekstrak. Perlakuan panas meningkatkan TPC ekstrak licorice.

3.3. Aktivitas Pemulung Radikal Ekstrak Licorice

Ituantioksidanaktivitas dariakar manisekstrak disajikan pada Gambar 1c,d. Kapasitas ABTS plus radikal-scavenging lebih tinggi untuk ekstrak WH-130 (6.086 ± 0.304 mg TEAC/gextract) daripada ekstrak WC (3,542 ± 0.093 mg TEAC/g ekstrak). Dalam uji DPPH, kecenderungan serupa diamati. Ekstrak WH-130 (7.442 ± 0.292 mg TEAC/g ekstrak) menunjukkan aktivitas penangkap radikal DPPH yang lebih besar daripada ekstrak WC (4.033 ± 0.160 mg TEAC/gextract). Hasil ini menunjukkan bahwa pemanasan dapat meningkatkan aktivitas antioksidan ekstrak.

3.4. Kandungan Isoliquiritigenin dari Ekstrak Licorice

Hasil penelitian menunjukkan bahwa kandungan ISL WC meningkat tajam setelah perlakuan panas (Tabel 2, Gambar 2), menunjukkan bahwa pemrosesan termal dapat mempengaruhi kandungan iniantioksidandananti-melanogenikmenggabungkan.

cistanche tubolosa

3.5. Viabilitas Sel

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3,akar manisekstrak tidak mempengaruhi viabilitas sel pada 50 atau 100 g/mL relatif terhadap kontrol yang diberi perlakuan IBMX. Dalam perlakuan 50 dan 100 g/mL dari semua ekstrak, viabilitas sel tetap lebih besar dari 100 persen . Oleh karena itu, percobaan lebih lanjut dilakukan dengan menggunakan ekstrak licorice konsentrasi hingga 100 g/mL.

3.6. Efek Ekstrak Licorice pada Produksi Melanin di Sel Melanoma B16F10

Pigmentasi dan kandungan melanin sel B16F10 ditunjukkan pada Gambar 4a,b. Kandungan melanin sel B16F10 meningkat hingga 3,4-kali lipat dengan pengobatan IBMX dibandingkan dengan kontrol yang tidak diobati. WC dan WH-130 menunjukkan penurunan pigmentasi dan kandungan melanin yang signifikan dibandingkan dengan kelompok yang diobati dengan IBMX (Gambar 4a,b). Baik WC dan WH{{10}} menunjukkan kandungan melanin yang lebih rendah daripada sel yang diobati dengan KA. Efek penghambatan sintesis melanin dalam sel B16F10 yang diobati dengan WH-130 lebih besar daripada WC. Jumlah melanin yang ada setelah pengobatan dengan 100 g/mL WC dan WH-130 berkurang menjadi kira-kira 0,59-kali lipat dan 0,51-kali lipat, masing-masing, dari tingkat yang diobati dengan IBMX group.ISL (10 M) dan KA (100 g/mL) menekan produksi melanin hingga 0,59-kali lipat dan 0,67-kali lipat, masing-masing dari tingkat dalam sel yang diobati dengan IBMX.

Hasil ini menunjukkan bahwa perlakuan panasakar manisekstrak (WH-130) dapat menghambat produksi melanin lebih efisien daripada ekstrak tanpa pemanasan (WC). Selain itu, kami mengamati bahwa pengobatan dengan ekstrak WH-130 pada 25, 50 dan 100 g/mL (Gambar 4c) menghasilkan penurunan kandungan melanin sel melanoma B16F10 yang bergantung pada konsentrasi. Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa pemanasan meningkatkananti-melanogenikaktivitas ekstrak licorice.

3.7. Efek Ekstrak Licorice pada Aktivitas Tirosinase

3.7.1. Aktivitas Tirosinase Jamur

Efek dariakar manisekstrak pada aktivitas TYR jamur ditunjukkan pada Gambar 5a. Kami mengkonfirmasi bahwa efek ekstrak (WC dan WH-130) pada oksidasi substrat oleh TYR jamur terjadi dalam kondisi bebas sel. Pada 50 g/mL, ekstrak WC menghambat aktivitas enzim hingga 81,33 persen , sedangkan WH-130 menekan aktivitas TYR hingga 65,95 persen tingkat EC. Sementara itu, asam kojic (KA), penghambat TYR, menyebabkan penghambatan aktivitas enzim hingga 47,09 persen tingkat EC. Penghambatan aktivitas TYR lebih besar pada licorice (WH-130) yang diberi perlakuan panas dibandingkan dengan licorice (WC) yang tidak dipanaskan.

3.7.2. Aktivitas Tirosinase Seluler

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5b, aktivitas TYR dari sel yang diobati dengan IBMX meningkat menjadi 233 persen relatif terhadap kontrol yang tidak diobati (100 persen). WC menurunkan aktivitas TYR menjadi 82,17 persen dibandingkan dengan kelompok yang diobati dengan IBMX. Ekstrak WH-130 menghambat aktivitas TYR seluler hingga 59,88 persen dibandingkan dengan sel yang diobati dengan IBMX. KA mengurangi aktivitas TYR seluler menjadi 74,07 persen dari level dalam sel yang dirawat dengan IBMX. Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa ekstrak licorice (WC dan WH-130)menekan aktivitas TYR dan bahwa WH-130 memiliki aktivitas penghambatan TYR yang lebih kuat daripada WC dan KA.

Selanjutnya, kami menyelidiki korelasi antara TPC, konten ISL,antioksidanaktivitas dan aktivitas anti-melanogenik (Tabel 3). TPC berkorelasi positif dengan konten ISL (0.827), serta dengan aktivitas penangkal radikal ABTS plus dan DPPH (masing-masing 0.886 dan 0.896), sedangkan TPC berkorelasi terbalik dengan kandungan melanin (–0.859). Konten ISL berkorelasi positif dengan ABTS plus dan aktivitas penangkal radikal DPPH (0.977 dan 0.985, masing-masing), sedangkan konten ISL berkorelasi terbalik dengan aktivitas TYR (–0. 834) dan kandungan melanin (–0.995). Aktivitas antioksidan (ABTS plus dan DPPH) berkorelasi terbalik dengan aktivitas TYR (–{{20}}.879 dan –0.856, masing-masing) dan kandungan melanin (–0. 974 dan -0,984, masing-masing). Hasil ini menunjukkan bahwa senyawa fenolik seperti ISL dalam licorice terkait erat dengan antioksidan dananti-melanogenikkegiatan ekstrak licorice.

3.8. Efek Ekstrak Licorice pada Ekspresi mRNA dari Gen Terkait Melanogenesis

Kami memeriksa ekspresi gen terkait melanogenesis dalam sel B16F10 untuk menjelaskan efek ekstrak licorice pada melanogenesis. Baik WC dan WH-130 menekan ekspresi mRNA dari MITF, TYR, TRP-1 dan TRP-2 (Gambar 6). WC menghambat ekspresi mRNA MITF, TYR, TRP-1 dan TRP-2 ke level 0.{{10}}lipat, 0.{ {12}}lipat, 0.71-lipat dan 0.65-kali lipat, masing-masing, dari sel yang dirawat dengan IBMX. WH-130 menghambat ekspresi mRNA MITF, TYR, TRP-1 dan TRP{{20}} menjadi 0.43-fold, {{33 }}.60-lipat, 0.62-lipat dan 0.49-kali lipat, masing-masing, dari tingkat grup yang diperlakukan dengan IBMX. Ekstrak WH{{30}} memiliki efek penghambatan yang lebih kuat pada ekspresi mRNA daripada ekstrak WC. ISL juga menekan ekspresi MITF, TYR, TRP-1 dan TRP-2 (0.42-fold, 0.59-fold, 0.68-fold dan 0.44-kali lipat, masing-masing, relatif terhadap sel yang dirawat dengan IBMX). Pada kelompok yang diobati dengan WH -130-, tingkat penurunan ekspresi mRNA dari gen terkait melanogenesis lebih besar daripada pada kelompok yang diobati dengan WC, menunjukkan bahwaakar manisekstrak menghambat melanogenesis melalui penekanan transkripsi gen terkait melanogenesis dan perlakuan panas meningkatkananti-melanogenikaktivitas ekstrak licorice.

3.9. Efek Ekstrak Licorice pada Ekspresi Protein Gen Terkait Melanogenesis

Seperti ditunjukkan pada Gambar 7b, pengobatan dengan WC dan WH-130 secara signifikan mengurangi tingkat ekspresi protein MITF, TYR, TRP-1 dan TRP-2. Tingkat ekspresi MITF, TYR,TRP-1 dan TRP-2 ditekan dalam sel yang diobati dengan WC (0.79-fold, 0.{{9 }}lipat, {{10}}.89-lipat dan 0.67-lipat, masing-masing, relatif terhadap sel yang dirawat dengan IBMX). WH-130 menunjukkan penurunan tingkat ekspresi protein MITF, TYR, TRP-1 dan TRP-2 ({{20}}.74-kali lipat, {{24 }}.73-fold, 0.80-fold dan {{30}}.48-fold, masing-masing, relatif terhadap sel yang dirawat dengan IBMX) . ISL menurunkan tingkat ekspresi protein MITF, TYR dan TRP-2 (0.76-kali lipat, 0,83-kali lipat dan 0.41-kali lipat, relatif terhadap perlakuan IBMX sel). WH-130 menekan ekspresi protein gen terkait melanogenesis lebih kuat daripada WC, menunjukkan bahwaakar manisekstrak menghambat melanogenesis melalui penekanan translasi gen terkait melanogenesis dan perlakuan panas meningkatkananti-melanogenikaktivitas ekstrak licorice.

bubuk cistanche pemutih kulit

4. Diskusi

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa perlakuan panas dariakar manismempengaruhi TPC, aktivitas antioksidan, dananti-melanogenikaktivitas. WH-130 memiliki indeks pencoklatan dan nilai TPC yang lebih tinggi daripada WC. Kondisi pemrosesan, termasuk suhu dan tekanan, mempengaruhi konstituen sampel. [29]. Pemanasan dapat meningkatkan reaksi Maillard, yang terkait dengan produksi melanoidin [23]. Melanoidin memiliki beberapa efek biologis, termasuk:antioksidan, antitumor, dan aktivitas antihipertensi, serta modulasi gula darah [30]. Senyawa ini merupakan makromolekul berwarna coklat polimer yang terbentuk melalui reaksi Maillard dari interaksi antara gula dan asam amino pada suhu tinggi [21]. Dengan demikian, semakin banyak melanoidin dalam ekstrak yang dipanaskan, semakin tinggi indeks pencoklatannya. Warna ekstrak licorice non-heated (WC) menunjukkan warna coklat muda, tetapi warnanya berangsur-angsur lebih gelap dengan suhu tinggi (130 derajat). Proses pemanasan juga dapat menyebabkan beberapa perubahan struktur kimia senyawa fenolik dan menyebabkan rusaknya dinding sel tanaman, melepaskan senyawa fenolik, yang mengarah pada aktivitas antioksidan [31]. Dengan demikian, kandungan fenolik ekstrak licorice dapat meningkat dengan perlakuan panas [21]. Laporan sebelumnya menunjukkan bahwa perlakuan panas madu meningkatkan pembentukan melanoidin, dan tingkat pencoklatan bertepatan dengan peningkatan aktivitas antioksidan [24]. Oleh karena itu, WH-130 menunjukkan kapasitas antioksidan yang lebih tinggi daripada WC di ABTS plus dan DPPH radikal-assay, yang telah banyak digunakan untuk menentukan aktivitas antiradikal sampel berdasarkan kapasitas untuk mentransfer elektron atau atom hidrogen [32].

Alami yang paling umumantioksidandan senyawa anti-melanogenik adalah fenolat. Tricin dan asam 9-hydroxyoctadecadienoic diidentifikasi sebagai fenolik utama dalam bicolor Sorgum. Selain itu, komponen ini menunjukkan efek antioksidan dan anti melanogenik dengan menghambat aktivitas tirosinase [19]. Selain itu, asam p-coumaric, senyawa aktif Sasa quelpaertensis Nakai, telah terbukti bahwa senyawa ini sangat menghambat aktivitas tirosinase dan mengurangi produksi melanin pada sel melanoma [27]. Menurut penelitian sebelumnya, ISL, senyawa flavonoid yang terkenal dalam produk hidrolisis akar licorice [6-8], menunjukkan aktivitas antioksidan dan anti-melanogenik dengan menghambat aktivitas TYR, transportasi melanosom dan induksi degradasi melanin [10,31] .Jadi, kami fokus pada konten ISL dari ekstrak dan aksi ISL dalam mekanisme terkait melanogenesis. ISL diterapkan sebagai agen terapeutik untuk banyak penyakit karena berbagai aktivitas biologisnya, termasuk anti-inflamasi, anti-mikroba, antioksidan, anti-kanker, imunoregulasi, efek hepatoprotektif dan kardioprotektif [33]. Dalam studi ini, konten ISL yang lebih tinggi diukur di WH-130 daripada di WC. Hiperpigmentasi kulit berhubungan dengan stres oksidatif. Pemulung radikal bebas telah dilaporkan memainkan peran penting dalam menekan hiperpigmentasi [17,34]. Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa perlakuan panas pada licorice dapat meningkatkan aktivitas pembersihan radikal dananti-melanogenikaktivitas melalui peningkatan kadar senyawa fenolik antioksidan seperti ISL. Menurut literatur sebelumnya, ada glabrene, glabridin, glabrol, liquiritigenin dalam licorice (Glycyrrhiza uralensis, G. glabra), menunjukkan penghambatan tirosinase. Jadi, senyawa ini juga dapat berdampak pada aktivitas anti-melanogenik [10,11,15,35]. Studi lebih lanjut tentang mereka penting untuk menjelaskan efek anti-melanogenik dari licorice.

Sintesis melanin diatur oleh TYR, TRP-1, TRP-2 (dopachrome tautomerase) dan MITF (Gambar 8). TYR, glikoprotein yang mengandung tembaga, bertindak sebagai enzim pembatas laju dan memainkan peran penting dalam produksi melanin. TYR mengkatalisis hidroksilasi tirosin menjadi 3,4-dihidroksifenilalanin (DOPA). TYR juga mengkatalisis oksidasi DOPA menjadi dopaquinone dan konversi dopaquinone menjadi dopachrome. Kemudian, dopachrome diubah menjadi dihydro-indolizine (DHI) atau indole 5,6-quinone-2-carboxylicacid (DHICA) [36-38]. Pada jalur ini, TRP-2 mengkatalisis konversi dopakrom menjadi DHICA, yang dioksidasi oleh TRP-1 untuk membentuk eumelanin. MITF adalah faktor transkripsi spesifik yang memainkan peran penting dalam melanogenesis sebagai pengatur utama ekspresi TYR, TRP-1 dan TRP-2 (Gambar 8) [28,37]. Penginduksi kimiawi melanogenesis adalah3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX), yang meningkatkan aktivitas TYR melalui jalur cAMPsignaling [13]. IBMX meningkatkan konsentrasi cAMP intraseluler dengan menghambat fosfodiesterase cAMP. Peningkatan kadar cAMP mengaktifkan protein kinase A (PKA) dan mengaktifkan PKA meningkatkan aktivitas dan ekspresi protein pengikat terkait cAMP (CREB) [39]. CREB berikatan dengan promotor MITF, yang mengarah pada peningkatan regulasi ekspresi gen MITF. Aktivasi MITF mempromosikan ekspresi TYR dan TRPs [13,19]. Oleh karena itu, downregulasi MITF menghasilkan hipopigmentasi.

Ekstrak licorice yang dipanaskan (WH-130) menghambat aktivitas TYR jamur dan TYR seluler lebih efektif daripada ekstrak licorice (WC) yang tidak dipanaskan. Penghambatan aktivitas TYR seluler dalam ekstrak licorice mungkin disebabkan oleh penurunan regulasi TYR. Hasil ini terkait dengan kandungan melanin sel melanoma B16F10. Dalam sel B16F10, perawatan WH-130 menekan produksi melanin yang diinduksi IBMX lebih baik daripada perawatan WC. Selain itu, WH 130 menurunkan regulasi transkripsi dan terjemahan penanda terkait melanogenesis (MITF, TYR, TRP-1, TRP-2) dalam sel B16F10 ke tingkat yang lebih besar daripada WC. Penanda-penanda ini mungkin secara kolektif berkontribusi pada keseluruhananti-melanogenikaktivitas [40].

Pemanasan dariakar manisekstrak meningkatkan kelimpahan senyawa fenolik antioksidan seperti ISL, dan peningkatan ini dikaitkan dengan peningkatanantioksidankegiatan (ABTS plus dan DPPH). Ekstrak licorice yang dipanaskan (WH-130) juga menunjukkan peningkatan aktivitas penghambatan TYR dan penurunan sintesis melanin. Ada tren baru dalam pengembangan bahan alami karena potensi keamanannya. Licorice telah digunakan dalam krim kosmetik untuk hiperpigmentasi [41]. Kami menunjukkan potensi Wongam sebagai yang barupemutih kulitagen untuk digunakan dalam kosmetik dan diverifikasi bahwa perlakuan panas dapat meningkatkan potensinya.

Glycyrrhiza uralensis Fischer (licorice) memiliki aktivitas antioksidan dan fotoprotektif UV pada fibroblas dermal manusia [22]. Namun, studi perbandingan antara Wongam (licorice) dan spesies asli lainnya perlu dilakukan setelahnya. Selain itu, studi lebih lanjut tentang komponen yang tidak teridentifikasi, seperti glabrene, glabridin, dari Wongam yang terkait dengan efek anti-melanogeniknya harus dilakukan dengan menggunakan metode yang sesuai. Hal ini diperlukan untuk menyelidiki efek sinergis atau antagonis antara senyawa fenolik setelah analisis konstituen dalam ekstrak licorice [40]. Untuk memeriksa bagaimana zat ini bekerja padaantioksidandan mekanisme anti-melanogenik, transfer atom hidrogen atau sistem transfer elektron tunggal dan jalur pensinyalan protein kinase yang diaktifkan mitogen harus dievaluasi [32,37].

5. Kesimpulan

Dalam penelitian ini, kami menyelidiki potensi ekstrak Wongam, kultivar baruakar manis, sebagaipemutihagen untuk aplikasi dalam kosmetik dan efek perlakuan panas pada bioaktivitasnya. Ekstrak Wongam (WC dan WH-130) menunjukkan aktivitas penangkapan radikal yang tinggi dan menghambat sintesis melanin dalam melanosit yang diinduksi IBMX dengan menekan aktivitas TYR. Perlakuan panas meningkatkanantioksidandan aktivitas anti-melanogenik Wongam. Hasilnya, WH-130 menunjukkan antioksidan dananti-melanogenikkegiatan dari WC. Hasil kami menunjukkan bahwa ekstrak Wongam yang diberi perlakuan panas (WH-130) adalah zat pereduksi pigmen yang kuat dengan kemungkinan aplikasi dalam berbagai gangguan hiperpigmentasi dermatologis, termasuk bintik-bintik coklat, bintik-bintik dan melasma, dan menunjukkan bahwa pemrosesan termal dapat digunakan untuk meningkatkan aktivitas anti-melanogenik licorice.

manfaat cistanche tubolosa: memutihkan kulit