Hubungan Efek Sidik Jari HPLC Dan Spektrum-antitumor Untuk Diskriminasi Antara Mylabris Phalerata Pallas Dan Mylabris Cichorii Linnaeus

Kontak: emily.li@wecistanche.com

Jian-Yong Zhang, Qi-Hong Chen, Xian Pei1, Rong Yan, Can-Can Duan, Yun Liu4, Xiao-Fei Li

1 Sekolah Farmasi, Universitas Kedokteran Zunyi, Zunyi, Cina,

2 Laboratorium Utama Farmakologi Dasar Kementerian Pendidikan dan Laboratorium Riset Internasional Bersama Etnomedis Kementerian Pendidikan, Universitas Kedokteran Zunyi, Zunyi, Guizhou, Cina.

3 School of Basic Medical Sciences, Zunyi Medical University, Zunyi, China, Laboratorium Kunci berbasis Perguruan Tinggi Provinsi 4Guizhou untuk Pencegahan dan Pengobatan Tumor dengan Obat Khas, Universitas Kedokteran Zunyi, Zunyi, China.

Klik di sini untuk mendapatkan informasi lebih lanjut tentang Cistanche anti-tumor

Highlight

Studi ini memberikan metode HPLC yang dapat diterapkan, kredibel, dan lebih efisien untuk membedakan dua spesies Mylabris. Dan, sidik jari HPLC dan spektrum-efek antitumorterintegrasi dan tiga penanda diferensial penting ditemukan untuk penanda baru Mylabris.

Abstrak

Tujuan: Evaluasi diskriminasi antara dua Spesies Mylabris berdasarkan sidik jari HPLC dan spektrum-efek antitumorhubungan. Metode: Dalam penelitian ini, metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) sederhana dan efisien yang terintegrasi dengan analisis kemometrik dan spektrum-efek antitumorhubungan dikembangkan untuk diskriminasi antara dua spesies Mylabris: Mylabris phalerata Pallas (MP) dan Mylabris cichorii Linnaeus (MC). Hasil: Dalam analisis sidik jari, 14 puncak karakteristik dipilih untuk menilai perbedaan antara MP dan MC menggunakan analisis kesamaan dan pengenalan pola menggunakan PCA dan OPLS-DA. Kromatogram HPLC sampel dari 10 wilayah Cina menunjukkan perbedaan antara MP dan MC, dan 7 penanda kimia karakteristik ditemukan. Dalam spektrum-efek antitumoranalisis hubungan, 4 penanda aktivitas memainkan peran penting dalam menurunkan IC50 dan mungkin menjadi komponen antitumor Mylabris dengan analisis relasional abu-abu dan analisis regresi linier multivariat. Analisis kemometrik dalam kombinasi dengan hasil hubungan spektrum-efek menunjukkan bahwa puncak 2 (sitosin), 4 (tidak diketahui), dan 14 (tidak diketahui) merupakan penanda diferensial yang penting untuk membedakan kedua spesies Mylabris.

Kesimpulan: Metode ini dapat diterapkan, kredibel, dan lebih efisien untuk membedakan MP dan MC, dan akan menawarkan cara baru untuk memfasilitasi kontrol kualitas obat serangga.

Kata kunci: HPLC, Sidik Jari, Spektrum-efek antitumor, Mylabris, Diskriminasi

Latar belakang

Mylabris, disebut ban mao di Cina, telah digunakan sebagai pengobatan tradisional Cina (TCM) untuk mengobati furunkel, borok yang mengakar, massa perut, dan merupakanantitumoragen. Selain itu, banyak digunakan di Eropa sebagai obat tradisional [1]. Konstituen aktif utama Mylabris adalah cantharidin, yang efektifanti tumorsenyawa [2]. Studi farmakologi modern telah menunjukkan bahwa Mylabris memiliki banyak aktivitas, dan sangat dihargai untuk pengobatan tumor karena fungsi gandanya.anti kankerkhasiat dan kemampuan meningkatkan jumlah leukosit [3-4]. Saat ini, Mylabris telah banyak digunakan dalam beberapa resep klinis anti-karsinoma TCM di Cina, seperti injeksi Aidi dan kapsul Compound ban mao.

Menurut Farmakope Republik Rakyat Tiongkok (versi 2015), Mylabris didefinisikan sebagai tubuh kering Mylabris phalerata Pallas (MP) dan Mylabris cichorii Linnaeus (MC), yang berbeda dalam karakteristik botani, dinamika populasi, dan ekologinya. 5-6]. Mylabris juga merupakan obat yang sangat beracun. Karena obat-obatan yang tersedia di Cina biasanya merupakan campuran MP dan MC, maka perlu untuk mengidentifikasi perbedaan kimia dan aktivitas antara kedua spesies.

Karena TCM mengandung banyak bahan yang diketahui dan tidak diketahui, analisis profil kuantitatif dari konstituen kimianya menimbulkan tantangan yang signifikan. Sidik jari kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) memainkan peran penting dalam kontrol kualitas (QC) TCM karena karakteristik profil keseluruhan dari sebagian besar senyawa dalam sistem yang kompleks. Selanjutnya, analisis sidik jari TCM memiliki reproduktifitas dan stabilitas yang baik untuk otentikasi spesies dan evaluasi kualitas, dan diterima oleh Organisasi Kesehatan Dunia, Badan Pengawas Obat dan Makanan Negara China (SFDA), dan Badan Evaluasi Obat Eropa (EMEA). Baru-baru ini, analisis kemometrik yang menggabungkan sidik jari HPLC telah dikembangkan untuk QC dan membedakan sumber alami kompleks yang berbeda [7]. Namun, tidak efektif untuk membedakan perbedaan TCM karena tidak dapat mencerminkan perbedaan konstituen aktif, yang lebih penting untuk penggunaan klinis. Selama ini spektrum-antitumor memengaruhipendekatan hubungan telah digunakan untuk berhasil mengidentifikasi konstituen bioaktif TCMs [8]. Sidik jari HPLC yang dikombinasikan dengan analisis kemometrik dan hubungan efek spektrum-antitumor akan lebih menjelaskan perbedaan berbagai sumber TCM.

Baru-baru ini beberapa metode telah dilaporkan untuk menentukan kandungan cantharidin, yang dapat digunakan untuk menentukan kualitas Mylabris [9]. Beberapa sidik jari kromatografi juga diterapkan untuk QC [10-11]. Hanya satu penelitian yang menggunakan metode yang melibatkan elusi gradien senyawa larut air Mylabris berdasarkan HPLC. Sedangkan sampel yang digunakan hanya sepuluh sampel dan tidak ada sampel MC [12]. Sejauh pengetahuan kami, pembedaan MP dan MC berdasarkan komposisi kimia dan aktivitasnya belum pernah dipelajari sebelumnya.

Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan metode sederhana dan efisien untuk membedakan dua spesies Mylabris menggunakan sidik jari HPLC yang dikombinasikan dengan analisis kemometrik dan analisis spektrum.antitumormemengaruhihubungan, yang akan memberikan dasar untuk QC Mylabris. Metode ini juga dapat diterapkan untuk mengidentifikasi penanda QC dari TCM lain.

Bahan dan metode

Secara total, 20 batch Mylabris phalerata Pallas (MP) dan Mylabris cichorii Linnaeus (MC) dikumpulkan dari berbagai provinsi di China (Tabel 1) dan diidentifikasi oleh prof Xiao-Fei Li kami. Spesimen voucher disimpan di laboratorium kami.

Standar referensi sitosin, uridin, guanosin, dan adenosin dibeli dari ChengduPush Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, China). HPLC kelas asetonitril dan metanol dibeli dari Thermofisher Scientific (Fairlawn, NJ, USA). Air murni Watson digunakan selama penelitian. Bahan kimia dan pelarut lainnya memiliki tingkat analitis dan diperoleh dari Reagen Aladdin (Shanghai, China), Reagen Chengdu Kelong (Chengdu, China) dan Reagen Kimia Sinopharm (Beijing, China)

Aparat dan kondisi kromatografi

Analisis HPLC dilakukan menggunakan sistem Agilent 1260 Infinity HPLC pada derajat 30 pada Phenomenex Synergy Polar-RP80 (4,6 mm × 250 mm, 5 m) untuk sidik jari. Elusi gradien linier dengan eluen A (air/asam asetat glasial, 100:1, v/v) dan B (metanol) digunakan untuk pemisahan. Program gradien dikembangkan sebagai berikut: 0-1 min, 3.0-4.6 persen B; 1-9 menit, 4.6-6,8 persen B; 9-25 menit, 6,8-51,0 persen B; 25-30 menit, 51.0-100 persen . Laju aliran fase gerak adalah 1,0 mL/menit. Kromatogram dipantau pada 254 nm. Setelah periode ekuilibrasi 15 menit, 10 L sampel digunakan untuk injeksi.

Persiapan sampel

Sampel kering dihancurkan menjadi bubuk, dan 2,5 g setiap sampel bubuk diekstraksi dua kali dengan 50 mL etanol 75 persen dengan refluks selama 1,5 jam setiap kali. Sampel yang diekstraksi dicampur dan dipekatkan di bawah tekanan tereduksi hingga 20 mL. Campuran kemudian diendapkan dengan 80 mL air selama 24 jam pada suhu 4 derajat . Selanjutnya, ekstrak disentrifugasi pada 3000 g min-1 selama 10 menit untuk memisahkan supernatan. Supernatan dipekatkan di bawah tekanan tereduksi menjadi 25 mL. Akhirnya, supernatan disaring melalui film Millipore 0,22 m sebelum analisis HPLC.

Validasi metodologi

Metode HPLC divalidasi untuk presisi, reproduktifitas, dan stabilitas (0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h) . Validasi diperkirakan berdasarkan waktu retensi (RT) dan luas puncak (PA). Akhirnya, sidik jari kimia dari 20 batch Mylabris didirikan untuk mengidentifikasi karakteristik kimia terintegrasi dari beberapa senyawa. Beberapa teknik kemometrik diperkenalkan pada sidik jari kimia untuk analisis.

Analisis pengenalan pola

Perbedaan antara dua spesies daerah puncak dievaluasi untuk signifikansi statistik menggunakan uji-t Student tidak berpasangan. Nilai p kurang dari 0.05 dianggap signifikan secara statistik. Sebagai metode klasik tanpa pengawasan, analisis komponen utama (PCA) diterapkan secara luas untuk analisis data statistik. Alih-alih menggunakan banyak variabel, PCA mengambil sejumlah kecil PC tanpa kehilangan banyak informasi, dan plot skor kemudian divisualisasikan untuk pemisahan pengamatan yang bebas. Dalam penelitian ini, PCA dilakukan pada area puncak yang dinormalisasi dari setiap komponen dalam sidik jari HPLC menggunakan perangkat lunak SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics, Umea, Swedia) untuk menemukan diskriminasi antara dua spesies Mylabris.

Untuk diskriminasi yang lebih disukai antara dua spesies Mylabris, metode yang diawasi dari analisis diskriminan kuadrat terkecil ortogonal (OPLS-DA) diterapkan untuk menganalisis perbedaan dalam area puncak yang dinormalisasi dari setiap komponen dalam sidik jari HPLC. Nilai VIP adalah jumlah bobot kuadrat dari bobot OPLS, yang mencerminkan kontribusi relatif dari setiap variabel X terhadap model. Variabel dengan VIP > 1, bersama dengan S-plot dianggap berpengaruh untuk pemisahan sampel dalam plot skor yang dihasilkan dari analisis OPLS-DA. Kemudian, penanda kimia karakteristik untuk diskriminasi diperoleh.

Analisis hubungan efek spektrum-antitumor

Untuk menjelajahianti tumordaerah puncak efek untuk sampel Mylabris terintegrasi dengan data sidik jari, dan membandingkan perbedaan antara kedua spesies, korelasi antara puncak sidik jari dananti-tumorefek dipelajari. Dua metode yang menggabungkan analisis relasional abu-abu dan analisis regresi linier multivariat (MLRA) diterapkan oleh SPSS19.0 (IBM, USA) dan GM6.0 soft (Grey Systems Theory Institution, NUAA, China). Ituanti-tumoruji dilakukan dengan metode yang kami terbitkan [12], sel HepG2 garis sel karsinoma hepatoseluler manusia dipertahankan dalam media RPMI1640 yang dilengkapi dengan 10 persen serum janin sapi. Sel-sel ditumbuhkan dalam atmosfer yang dilembabkan yang mengandung 5 persen CO2 pada 37 C. Metode BPRS digunakan untuk menilai proliferasi untukanti-tumorkegiatan, kemudian IC50 sel HepG2 dihitung, akhirnya, IC50 dan area puncak yang dinormalisasi digunakan untuk analisis kemometrik. Kemudian didapatkan penanda aktivitas karakteristik Mylabris.

Hasil dan Diskusi

Optimalisasi kondisi ekstrak

Untuk ekstraksi senyawa terlarut air yang cukup dari Mylabris, sistem ekstraksi dioptimalkan. Ultrasonik dan refluks menunjukkan bahwa senyawa ini dapat diekstraksi secara optimal dengan refluks.

Optimasi metode HPLC

Untuk mendapatkan puncak kromatografi maksimal untuk menggambarkan fitur keseluruhan ramuan, komposisi kolom kromatografi, fase gerak, dan panjang gelombang deteksi (200, 254, 265, dan 278 nm) diselidiki. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Phenimenex Synergy Polar-RP80 kolom, air (mengandung 1 persen asam asetat glasial) dan metanol, dan 254 nm adalah kondisi terbaik untuk analisis HPLC Mylabris (Gambar 1), struktur 4 zat standar ditunjukkan pada Gambar 2 .

Validasi metode

Dalam penelitian ini, 14 puncak dipisahkan dengan baik dan digunakan sebagai "puncak umum". Presisi, pengulangan, dan stabilitas didasarkan pada waktu retensi (RT) dan area puncak (PA). Nilai RSD RT dan PA untuk presisi (n=6) masing-masing tidak melebihi 0.2 dan 4 persen ; Nilai RSD RA dan PA untuk pengulangan (n=6) masing-masing di bawah 0.2 dan 4 persen , dan nilai RSD untuk stabilitas (0-24 h) kurang dari { {10}}.4 dan 5 persen, masing-masing, yang menunjukkan bahwa sampel stabil dalam 24 jam. Hasil ini menggambarkan bahwa kualitas sampel yang diteliti dan metode HPLC stabil dan terkontrol dengan baik.

Evaluasi kesamaan sidik jari

The fingerprint similarity analysis was used to evaluate the similarity of HPLC peaks. The similarities of MP and MC were calculated by the reference HPLC fingerprint, respectively. As shown in Table 1, except for two MP samples (from Guizhou2 and Guizhou5) with lower similarities (0.880 and 0.920, respectively), other samples of MP were >0.930. The similarities of MC samples were >{{0}}.921 kecuali untuk sampel MC (dari Guizhou2 dan Guizhou4), yang kesamaannya masing-masing adalah 0.888 dan 0.887. Data ini menunjukkan bahwa kualitas Mylabris dalam satu spesies stabil. Namun, kesamaan dari hanya tiga sampel MP dibandingkan dengan sidik jari HPLC referensi adalah > 0.930; dan kesamaan hanya dua sampel MC dibandingkan dengan sidik jari HPLC referensi adalah > 0,921. Hasil ini menunjukkan bahwa kedua spesies Mylabris memiliki variasi yang cukup besar di beberapa daerah puncak.

Diskriminasi MP dan MC dengan analisis pengenalan pola

For global analysis of the difference, PCA was used to find the quality variation of the samples from the two species of Mylabris. Figure 3 shows that the two-dimensional PCA model was constructed by the first two PCs, which included approximately 61.8% of the original data. The score plot showed that the MP and MC samples could not be separated by PCA. To understand the differences between MP and MC, an OPLS-DA model was established. As shown in Figure 4, the Mylabris samples could be classified into two groups with R2X=0.502, R2Y=0.492, and Q2=0.0769 as compared to the PCA model. These results showed that the OPLS-DA model was more suitable than the PCA model for distinct separation of the test samples based on their different components. From the S-plot of OPLS-DA, peak markers including peaks 1, 2, 4, 7, 9, 12, and 14 between MP and MC could be found (Figure 5). Based on VIP>1, puncak 1, 2, 4, 7, 9, 12, dan 14 mungkin merupakan variabel yang paling signifikan dalam membedakan antara dua spesies (Gambar 6). Kelompok puncak (1, 2, 4, 7, 9, 12, dan 14) mungkin memainkan peran penting dalam membedakan antara MP dan MC sebagai penanda kimia karakteristik.

Hubungan spektrum-efek dengan analisis relasional abu-abu

To further evaluate the relationship between the variations of normalized peak area and IC50, grey relational analysis (GRA) was performed. The influence rank by normalized peak area was P13>P14>P3>P2>P12>P4>P9>P1>P10>P7>P6>P8>P5> P11 as shown in Table 2. The results indicated that the top-6 peak including peaks 13, 14, 12, 2, 3, and 4 were the main influencing factors for the antitumor effect based on the standard of Relative Grey correlative degree (RGCE) >0.75.

Hubungan spektrum-efek oleh MLRA

Model MLRA adalah metode pemodelan yang paling umum untuk menyimpulkan kompleksitas hubungan antara dua variabel atau lebih dan respons yang dibangun dengan rumus berikut

Dimana Y adalah nilai estimasi dan mewakili respon; Xn adalah variabel bebas, b{{0}} adalah intersep, dan bn adalah koefisien regresi untuk Xn. Dalam penelitian ini, MLRA diterapkan untuk menetapkan hubungan kemanjuran sidik jari antara nilai area puncak pada sidik jari HPLC dan IC50 anti-HepG2, dan kemudian menemukan komponen antitumor yang mungkin. Kolineasi data ditemukan oleh model MLRA umum, yang tidak cocok untuk mengeksplorasi korelasi antara Y (IC50) dan X (PA). Model PCA MLRA digunakan untuk mempelajari hubungan efek sidik jari, dan enam PC pertama dengan tingkat kontribusi varians kumulatif: 91,068 persen dipilih untuk analisis. Akhirnya, persamaan berikut dibuat sesuai dengan output SPSS dan PC: IC50=1.115864 plus 1.87268PA1- 699.722PA2 plus 25.7138PA3 - 24.1528PA4 plus 7.22878PA{{ 23}}.2114PA6 ditambah 2.95283PA7- 15.5305PA8 ditambah 13.0297PA9 ditambah 22.5683PA10 - 10.3462PA11 ditambah 123.762PA12 ditambah 31.0428PA13 - 10.702PA14) ×10-6. (R adalah 0,682, P <>

Mengintegrasikan Analisis Dua Spesies Mylabris

Percobaan menunjukkan bahwa sidik jari HPLC dapat digunakan untuk mencerminkan karakteristik kimia Mylabris. Algoritma kesamaan, PCA, dan OPLS-DA diterapkan untuk menemukan perbedaan antara MC dan MP. Kelompok puncak (1, 2, 4, 7, 9, 12, dan 14) didefinisikan sebagai penanda kimia yang khas.

Selain itu, baik GRA dan MLRA terbukti menjadi metode yang memuaskan untuk diskriminasi lebih lanjut. Mengintegrasikan hasil analisis GRA dan MLRA, puncak 2, 4, dan 14 sebagai penanda aktivitas Mylabris harus bertanggung jawab atas efek anti-tumor, yang mungkin menjadi bahan dasar farmakodinamik Mylabris.

Penanda diferensial penting ditentukan untuk puncak dengan sifat kimia dan penanda aktivitas yang khas. Jadi, antara MC dan MP pada sidik jari HPLC setelah analisis hubungan spektrum-efek, puncak 2 (sitosin), 4 (tidak diketahui), dan 14 (tidak diketahui) adalah penanda diferensial penting untuk perbedaan antara MP dan MC seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7.

Kesimpulan

Secara meyakinkan, dalam penelitian ini, metode HPLC diusulkan untuk sidik jari kimia MP dan MC. Dengan menggabungkan sidik jari HPLC, PCA, dan analisis hubungan spektrum-efek seperti GAS dan MLRA, sifat kimia dan farmakologis dari dua spesies dekat Mylabris dapat dibedakan. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa dari puncak 2 (sitosin), 4 (tidak diketahui), dan 14 (tidak diketahui) sebagai penanda diferensial penting memainkan peran dominan dalam membedakan antara MP dan MC. Struktur puncak 4 dan 14 harus diidentifikasi dengan teknologi lain. Metode sidik jari HPLC yang dikombinasikan dengan statistik, analisis kemometrik, dan analisis hubungan spektrum-efek terbukti efisien dalam menemukan komponen penanda atau untuk mempromosikan QC dariobat-obatan herbal.

Referensi

1 Wang GS. Penggunaan medis Mylabris di Tiongkok kuno dan penelitian terbaru. J Ethnopharmacol 1989, 26(2): 147-162.

2. Lin YS, Lia YH, Peng ZP, dkk. Penentuan konten Cantharidin dan efek penghambatannya pada sel HepG2 hepatoma manusia. Biomed Res-India 2016, 27(2): 533-536.

3. Xu MZ, Lee WS, Kim MJ, dkk. Asil-KoA: aktivitas penghambatan kolesterol asiltransferase dari amida asam lemak yang diisolasi dari Mylabris phalerate Pallas. Bioorg Med Chem Lett 2004, 14(16): 4277-4280.

4. Hari RM, Harbord M, Forbes A, dkk. Lepuh Cantharidin: teknik untuk menyelidiki perdagangan leukosit dan produksi sitokin di tempat peradangan pada manusia. J Metode Imunol 2001, 257(1-2): 213-220.

5. Mo RY, Sun NX, Peng R. Studi tentang makanan yang disukai Mylabris phalerata dewasa di populasi geografis yang berbeda. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 2014, 39(22): 4293-4296.

6. Wang XM, Cheng XS, Li XF. Karakteristik Biologi Meloidae dan Makanan Buatannya. Ilmu Pertanian Guizhou (Chin) 2007, 35(2): 140-142.

7. Yang Y, Zhang J, Jin H, dkk. Analisis Kuantitatif Dikombinasikan dengan Teknologi Sidik Jari dan Analisis Kemometrik yang Diterapkan untuk Mengevaluasi Enam Spesies Wild Paris Menggunakan UHPLC-UV-MS. J Metode Anal Chem 2016: e3182796.

8. Liu Y, Liu Z, Sun G, dkk. Pemantauan dan evaluasi konsistensi mutu tablet Compound Bismuth Aluminate dengan metode simple quantified ratio fingerprint dikombinasikan dengan penentuan lima senyawa secara simultan dan berkorelasi dengan aktivitas antioksidan. Plos Satu 2015; 10: e0118223.

9. Mehdinia A, Asiabi M, Jabbari A, dkk. Analisis cantharidin pada kumbang lepuh palsu (Coleoptera: Oedemeridae) dengan mikroekstraksi fase padat headspace dan spektrometri massa kromatografi gas. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2011, 879(27): 2897-2901.

10. Li XM, Xiao JS. Studi sidik jari GC Mylabris phalerata. China Journal of Hospital Pharmacy (Chin) 2010; 30(2): 116-119.

11. Luo CX, Sun, GX, dan Shi XF. Sidik jari digital Mylabris oleh HPCE. Apotek Selatan Tengah (Chin) 2008; 6(2): 230-235.

12. Sun GX, Luo CX, dan Wang, Z. Mempelajari sidik jari HPLC Digital Mylabris. Jurnal Analisis Farmasi Cina (Dagu) 2008;28(7): 1031-1036.

13. Guo K, Li XF, Yan R, dkk. Karsinoma hepatoseluler anti-manusia Aktivitas sel HepG 2 cantharidin berasal dari Provinsi Guizhou dan sekitarnya. Jurnal Kedokteran & Kesehatan Modern (Dagu) 2016; 32(5): 648-650.