Efek Apoptosis Polisakarida Cistanche Pada Leukemia

Pengarang:

LI Yan,ZHANG Jin,ZHANG Jing-Nan,dkk.

Mongolia Dalam, Cina

Untuk menyelidiki efek apoptosis dariPolisakarida Cistanche( CDP) pada manusialeukemia akutgaris sel sel Jurkat．MetodeUji MTT diterapkan untuk mendeteksi efek CDP pada proliferasi sel, Western blotting digunakan untuk mendeteksi aktivasi caspase-9 dan caspase-3, dan molekul sinyal apoptosis juga diuji．hasilProliferasi sel T dihambat oleh 1 mg /ml dan 2 mg /ml CDP, Apoptosis sel T diinduksi oleh 5 mg/ml CDP, danekspresi pro-caspase-9 dan pro-caspase-3 berkurang secara signifikan． Ekspresi reseptor permukaan sel CD45 dan CD71 secara signifikan dihambat oleh 5 mg / ml CDP, Fosforilasi EＲK diinduksi, dan fosforilasi JNK dihambat．

Kesimpulan

Kata kunci】Polisakarida Cistanche; Apoptosis; reseptor; huruf besar-9; caspase-3

Leukemia limfoblastik akut (LLA) adalah penyakit klonal ganas pada sistem limfatik dengan derajat heterogenitas imunofenotipe yang tinggi. , mudah kambuh, dan sebagainya. Saat ini, metode pengobatan yang umum digunakan termasuk transplantasi sumsum tulang, terapi induksi, imunoterapi, kemoterapi kombinasi, dll. Karena keterbatasan kemampuan sebagian besar obat kemoterapi untuk menargetkan dan membunuh tumor, mereka dapat menyebabkan kerusakan serius pada sistem pencernaan, sistem darah, kardiovaskular dan serebrovaskular, dll. Saat menerima perawatan, sering disertai dengan reaksi merugikan utama, beberapa di antaranya bahkan berakibat fatal. Saat kemoterapi berlangsung, tubuh cenderung mengembangkan toleransi terhadap obat kemoterapi, meningkatkan risiko kekambuhan penyakit.

Oleh karena itu, pencarian terapi leukemia atau terapi adjuvant yang sangat efektif, rendah toksisitas, dan sangat bertarget telah menjadi fokus perhatian saat ini.Bentengdisebut Chagangaoya dalam bahasa Mongolia. Itu milik keluarga Ledangaceae dan genus Cistanche. Ini parasit pada akar pohon gurun dan memiliki reputasi "ginseng gurun".

Bahan aktif utama Cistanche termasuk glikosida fenilethanoid, lignan, betaine, sterol, asam amino, dan polisakarida. Anti-inflamasi, antivirus, antioksidan, regulasi kekebalan dan efek lainnya.

Studi telah menemukan bahwaPolisakarida Cistanche (CDP),sebagai salah satu komponen aktif utamanya,memiliki efek anti tumor dan imunomodulator.Para peneliti menemukan bahwa CDP memiliki efek membunuh yang signifikan pada sel leukemia K562 dan THP-1, dan menyarankan bahwa CDP memiliki peran tertentu dalampencegahan atau pengobatan leukemia. Selain itu, dalam senyawa pengobatan tradisional Tiongkok, cistanche, untuk pengobatan akutleukemia, Bentengjuga berperan sebagai salah satu komponen penting. Namun, mekanisme kerja spesifik dariBentengTidak diketahui. Dalam makalah ini, isolasi dan pemurnianCDP Kotadipelajari, dan efek pembunuhan dan mekanisme terkait CDP pada garis sel leukemia akut manusia Jurkat diselidiki.

1.1 Reagen dan instrumen utama

Bubuk Cistanche dibeli dari Sichuan wecistancheGroup Co, Ltd., lini sel leukemia akut manusia Jurkat dibeli dari bank sel Institut Biologi Sel Shanghai, thiazole blue (MTT) dan sodium dodecyl sulfate (SDS) dibeli dari Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd., serum janin sapi (FBS) dibeli dari Hangzhou Sijiqing Bioengineering Materials Co., Ltd., caspase yang mengandung sistein-3, caspase-9, CD71, CD45, Phosphorylated c-Jun amino-terminal kinase (hal -JNK) dan antibodi kinase yang diatur sinyal ekstraseluler terfosforilasi (p-ERK) dibeli dari Cell Signaling Technology, AS, dan antibodi aktin dibeli dari Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. Elektrokimia Substrat luminescence (ECL) dibeli dari Thermo Perusahaan Ilmiah Amerika Serikat, dan reagen lainnya adalah kelas analitis domestik. Gel-View 6000 plus stasiun kerja gambar cerdas (produk Guangzhou Boluteng Biotechnology Co., Ltd.), mikroskop fluoresensi Revolve FL terbalik (produk dari Echo Laboratories, AS), pembaca pelat mikro EPOCH (produk dari Beijing Bo Teng Instrument Co., Ltd.).

1.2 Pemisahan dan pemurnian CDP Ambil 500 gBubuk ekstrak cistanche, rendam dalam etanol 95 persen semalaman, saring dengan kain kasa, kumpulkan residu filter, rebus dengan air panas pada suhu 60 derajat selama 2 jam / waktu, sebanyak 3 kali. Setelah akhir, filtrat digabungkan tiga kali, dipekatkan di bawah tekanan yang dikurangi hingga 2/3 dari volume asli, ditambahkan 3 kali volume etanol 95 persen, dan didiamkan pada 4 derajat semalam. Keesokan harinya, sentrifus dengan kecepatan 4 000 r/min selama 10 menit, kumpulkan endapan, singkirkan protein dengan metode Sevag, endapan dengan etanol absolut, keringkan beku untuk mendapatkan CDP.

1.3 Kultur sel Garis sel leukemia akut manusia disimpan dalam nitrogen cair di laboratorium Jurkat. Ketika digunakan, sel-sel dengan cepat dipulihkan dalam penangas air 37 derajat dan dikultur dalam media RPMI1640 (mengandung 100 U/ml penisilin dan 100 U/ml streptomisin) dengan 10 persen FBS. Sel-sel dikultur dalam inkubator sel CO2 37 derajat , 5 persen, dilewatkan setiap 2 hingga 3 hari, dan percobaan dilakukan ketika sel memasuki fase pertumbuhan logaritmik.

1.4 Percobaan MTT Sel jurkat dalam fase pertumbuhan logaritmik diambil, disentrifugasi untuk mendapatkan pelet sel, dan dihitung pada 5x105 sel/ml. Ambil 96-pelat kultur sel sumur, inokulasikan 100 ul sel di setiap sumur, lalu tambahkan 100 ul media lengkap RP-MI1640 sebagai kelompok kontrol; kelompok eksperimen dibagi menjadi 3 kelompok, pertama menggunakan media RPMI1640 untuk menyiapkan konsentrasi CDP yang berbeda, dan kemudian menambahkan 100 ul media RP-MI1640 ke setiap sumur. Sel ul Jurkat dan 100 ul larutan CDP digunakan untuk membuat konsentrasi akhir CDP masing-masing pada 1, 2, dan 5 mg/ml. Setiap kelompok dibuat dengan 5 sumur duplikat dan diinkubasi dalam inkubator sel 37 derajat selama 48 jam. Setelah inkubasi, tambahkan 20 ul MTT (konsentrasi larutan stok 5 mg/ml) ke dalam masing-masing sumur, masukkan kembali ke dalam inkubator sel, dan lanjutkan inkubasi selama 4 jam, dan terakhir tambahkan 100 ul 20 persen SDS untuk melarutkan formazan pada suhu 37 derajat semalam, dan menggunakannya pada hari berikutnya. Absorbansi pada 570 nm masing-masing kelompok dideteksi oleh pembaca lempeng mikro, dan tingkat penghambatan konsentrasi CDP yang berbeda pada proliferasi sel Jurkat dihitung dengan rumus.

1.5 Sel-sel Jurkat Western blotting dalam fase pertumbuhan logaritmik diambil dan diunggulkan dalam pelat sumur 6-pada kepadatan 2 × 105 sel/ml, 500 ul/sumur, dan media lengkap RPMI1640 500 ul ditambahkan ke kontrol kelompok. Siapkan 3 kelompok eksperimen, kelompok perlakuan polisakarida 1, 2, dan 5 mg/ml, CDP

Dilarutkan dalam media lengkap RPMI1640 terlebih dahulu, 500 ul sel dan 500 ul larutan CDP dengan konsentrasi berbeda ditambahkan ke pelat 6-well dan diinkubasi pada 37 derajat selama 48 jam. Setelah kultur, suspensi sel masing-masing kelompok dikumpulkan, disentrifugasi pada 1 500 r/min selama 5 menit untuk mendapatkan pelet sel, dan dicuci dua kali dengan phosphate-buffered saline (PBS) yang telah didinginkan sebelumnya. Setelah dicuci, 20 ul buffer lisis sel ditambahkan ke masing-masing kelompok, dan sel-sel dilisiskan di atas es selama 30 menit. Protein total diekstraksi dan konsentrasi sel diatur menggunakan metode Bradford. 20 ug protein diambil dari masing-masing kelompok untuk elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (PAGE), dan protein dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida (PVDF) dengan elektroporasi. Diblokir dengan susu bubuk tanpa lemak pada suhu kamar selama 1 jam, ditambahkan antibodi kelinci anti-manusia-3 dan caspase-9 pada rasio pengenceran 1:1 000, diinkubasi pada suhu kamar selama 1 h, dibilas 3 kali dengan shaker phosphate Tween buffer (PBST) (10 menit/waktu), tambahkan antibodi sekunder berlabel horseradish peroxidase (HRP) (1:1 000), inkubasi selama 1 jam pada suhu kamar, bilas 3 kali dengan PBST, bilas 1 kali dengan PBS, tambahkan substrat ECL, dan gunakan Intelligent image workstation digunakan untuk pencitraan, dan perubahan pita setiap kelompok dibandingkan untuk mempelajari apoptosis sel Jurkat yang diinduksi oleh CDP. Untuk mendeteksi protein terkait jalur apoptosis, kultur sel dan kondisi perawatan CDP sama seperti di atas. Setelah reaksi, sel-sel dilisiskan untuk kuantifikasi protein. Protein dipindahkan ke membran PVDF dengan SDS-PAGE dan elektroporasi. Setelah diblokir dengan susu bubuk skim selama 1 jam, antibodi anti-CD71, CD45, p-JNK dan p-ERK (1:1 000) ditambahkan, dan diinkubasi pada suhu kamar selama 1 jam. Antibodi sekunder berlabel HRP (1:1 000) diinkubasi selama 1 jam, dan akhirnya, stasiun kerja pencitraan cerdas digunakan untuk pencitraan guna mempelajari molekul pensinyalan terkait dari apoptosis sel Jurkat yang diinduksi CDP. Pita eksperimental yang dihasilkan diskalakan abu-abu dengan Gambar J (1.8.0).

Klik di sini untuk mengetahui efek Cistanche pada efek anti-tumor dan Anti-kanker

1.6 Analisis statistik SPSS21. Perangkat lunak 0 digunakan untuk uji-t dan analisis varians

2 hasil fungsi Cistanche aktifleukemia

2.1 Tingkat proliferasi sel

CDP berhasil diisolasi, dengan kandungan gula lebih dari 9{{20}} persen dan kandungan protein kurang dari 5 persen. Laju penghambatan proliferasi sel pada kelompok CDP 1 mg/ml adalah ( 19, 1 ± 2 ) persen , sedangkan pada kelompok CDP 2 mg/ml dan 5 mg/ml adalah ( 44. 2 ± 5. 2 ). ) ) persen dan ( 47. 8 ± 4. 4) persen , menunjukkan bahwa CDP dapat secara signifikan menghambat proliferasi sel Jurkat dengan cara yang bergantung pada dosis. 2.2 Dibandingkan dengan kelompok kontrol (0.62±0.04, 0.56±{{40}}.{{49 }}7), tingkat apoptosis sel Jurkat yang diberi perlakuan CDP 5 mg/ml menghasilkan enzim caspase-9 dan caspase{{30}}. Pro-form pro-caspase-9 ( 0. 09 ± 0. 02) dan pro-caspase-3 ( {{ 63}}.12 ± 0.01) berkurang secara signifikan, dan kelompok CDP 1 mg/ml dan 2 mg/ml secara signifikan kurang efektif untuk pro-caspase-3 dalam sel. Kandungan caspase-9 (0,58±0,04, 0,51±0,01) dan pro-caspase-3 (0,48±0,04, 0,44±0,05) tidak berpengaruh nyata yaitu rendah Konsentrasi CDP tidak menginduksi apoptosis sel Jurkat, tetapi terutama menghambat proliferasi sel, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1.

1-4: grup referensi,

1 mg/ml kelompok CDP, 2 mg/ml kelompok CDP, 5 mg/ml kelompok CDP; sama seperti gambar berikut

Gambar 1 Pengaruh CDP pada caspase-9 dan caspase-3 di sel Jurkat

Pengaruh polisakarida Cistanche Efek pada leukemia

2.3 Tingkat ekspresi relatif CD71 dan CD45 pada kelompok kontrol reseptor apoptosis adalah 1.00±0.04, {{1{0}}.54± 0.{{20}}2. Kelompok CDP 5 mg/ml dapat secara signifikan menghambat CD71 (0.05±0.02). 01) dan CD45 ( 0. 13 ± {{40}}. 03); Kelompok CDP 1 mg/ml dan 2 mg/ml dapat menghambat ekspresi CD71 (0. 52 ± 0. 06, 0.43 ± 0. 07) sampai batas tertentu Tidak ada pengaruh yang signifikan terhadap ekspresi CD45 (0,51 ±0,01, 0,48±0,02). Lihat Gambar 2.

Gambar 2 Pengaruh CDP pada ekspresi reseptor pada permukaan membran sel

2.4 Jalur terkait Apoptosis

Tingkat ekspresi relatif p-JNK dan p-ERK dalam kelompok referensi adalah 1,20±0.08 dan 0.21±0 .03, masing-masing. Kelompok CDP 5 mg/ml menginduksi apoptosis dan secara signifikan mengurangi tingkat fosforilasi JNK. ( 0. 32 ± 0. 04) , secara signifikan meningkatkan tingkat fosforilasi ERK ( 1. 13 ± 0. 05); 1 mg/ml, 2 mg/ml CDP meningkatkan tingkat fosforilasi JNK ( 1. 12 ± 0. 06 , 1. 06 ± 0. 06) tidak berpengaruh signifikan, tetapi masih meningkatkan tingkat fosforilasi ERK (0. 54 ± 0. 04, 0. 63 ± 0. 02). Lihat Gambar 3.

Gambar 3 Pengaruh CDP pada fosforilasi JNK dan ERK

3 Diskusi

Dalam beberapa tahun terakhir, penelitian telah menemukan bahwa CDP memiliki efek penghambatan tertentu pada garis sel leukemia, tetapi mekanisme aksi spesifiknya belum diketahui.

Dalam proses apoptosis, caspase-9 adalah salah satu molekul pensinyalan hulu dalam proses apoptosis yang bergantung pada caspase. Setelah stimulasi sinyal, pro-caspase-9 dihidrolisis secara besar-besaran untuk menghasilkan bentuk aktif dari cleaved-caspase-9, yang terus mengirimkan sinyal apoptosis ke bawah untuk mendorong proses apoptosis. Caspase-3 adalah molekul caspase tipe efektor dan merupakan molekul pensinyalan kunci dalam proses apoptosis yang bergantung pada caspase seluler. Itu juga ada dalam bentuk pro-enzim (pro-caspase-3) dalam kondisi normal. Setelah diaktifkan oleh hidrolisis, sejumlah besar caspase terbelah diproduksi. -3, itu akan melisiskan berbagai molekul protein kunci dalam sel dan akhirnya menginduksi apoptosis. CDP termasuk dalam polisakarida aktif makromolekul biologis dan tidak dapat dengan bebas memasuki sel melalui membran sel. Oleh karena itu, CDP menginduksi apoptosis dengan mempengaruhi ekspresi dan distribusi reseptor pada permukaan membran sel Jurkat, sehingga mentransmisikan sinyal ke bagian dalam sel, dan akhirnya mengaktifkan keluarga caspase. protein, yang menyebabkan apoptosis sel. Studi ini menunjukkan bahwa konsentrasi rendah CDP tidak menginduksi apoptosis sel Jurkat, tetapi terutama menghambat proliferasi sel. CD71, juga dikenal sebagai reseptor transferin, adalah reseptor glikoprotein transmembran tipe II yang terlibat dalam penyerapan zat besi dan regulasi pertumbuhan dan perkembangan sel. CD71 sangat diekspresikan pada pasien dengan leukemia akut dan dikaitkan dengan resistensi obat primer, yaitu ekspresi CD71. Semakin tinggi nilainya, semakin buruk efek kemoterapi pertama. Oleh karena itu, CD71 adalah salah satu penanda untuk diagnosis tambahan. CD45 diekspresikan pada permukaan semua jenis leukosit, juga dikenal sebagai antigen umum leukosit. Itu milik glikoprotein transmembran tipe I dan terkait erat dengan pengembangan dan diferensiasi sel T. CD45 memiliki tingkat ekspresi dan tipe alosterik yang berbeda pada tipe leukemia yang berbeda, sehingga dapat digunakan sebagai salah satu penanda untuk diagnosis banding dan imunofenotipe leukemia. Antibodi monoklonal CD45 telah banyak digunakan dalam pengobatan leukemia, terutama leukemia yang resistan terhadap obat. Frisen dkk. menemukan bahwa radionuklida

CD45 mAb yang ditandai dapat menginduksi apoptosis pada garis sel leukemia yang resistan terhadap obat dengan mengaktifkan protein keluarga caspase (termasuk caspase-3, caspase-8, dan caspase-9). CDP menginduksi apoptosis sel Jurkat, pertama dengan bekerja pada reseptor permukaan membran sel CD45 dan CD71, mempengaruhi ekspresi dan distribusi keduanya, mentransmisikan sinyal apoptosis ke dalam sel, dan akhirnya mengaktifkan caspase-9 dan caspase{{8 }}, memicu apoptosis. Namun, baik caspase-9 dan caspase-3 terletak di hilir jalur apoptosis, dan molekul pensinyalan hulu perlu dieksplorasi lebih lanjut. Dalam penelitian ini, CDP pada konsentrasi 5 mg/ml menginduksi apoptosis sel Jurkat sambil menghambat ekspresi CD45, yang serupa dengan antibodi monoklonal CD45 yang dijelaskan di atas. Oleh karena itu, dari perspektif reseptor terkait apoptosis CD45 dan CD71,Bentengmemiliki potensi tertentu untuk pengobatan atau pengobatan adjuvant leukemia.Sistem protein kinase teraktivasi mitogen (MAPKs) diekspresikan di semua sel eukariotik.

Cistanche Tablet untuk Meningkatkan Sistem Kekebalan Pengobatan Leukemia

Ini adalah jalur transmisi informasi yang sangat penting yang melakukan transduksi sinyal stimulasi ekstraseluler ke intraseluler dan terdiri dari serin/treonin protein kinase, termasuk ERK, JNK, dan p38MAPK. Fosforilasi dan defosforilasinya adalah sakelar aktivitas kehidupan sel dan terlibat dalam Dan mengatur proses pertumbuhan sel, proliferasi, diferensiasi, aktivasi, dan apoptosis. Studi ini menunjukkan bahwa defosforilasi JNK terlibat dalam apoptosis sel T yang diinduksi CDP, sementara fosforilasi ERK terlibat dalam dua proses di mana CDP menghambat proliferasi sel dan menginduksi apoptosis.

Kesimpulannya,CDP Kotamemiliki efek sitotoksik pada sel T-limfositik leukemia Jurkat, menunjukkan bahwa konsentrasi rendah (di bawah 2 mg/ml) menghambat proliferasi sel, sedangkan konsentrasi tinggi (5 mg/ml) menginduksi apoptosis.CDP Kotamenginduksi apoptosis pada sel Jurkat terutama dengan mempengaruhi dan mengubah sel.

Ekspresi reseptor terkait apoptosis CD71 dan CD45 pada permukaan membran mentransmisikan sinyal ke bagian dalam sel, selanjutnya menyebabkan fosforilasi ERK dan defosforilasi JNK, dan akhirnya aktivasi caspase-9, yang pada gilirannya mengaktifkan caspase{{4} } untuk menginduksi apoptosis.