Penyebab penyakit ginjal kronis (CKD) - Anemia
Mar 15, 2022
Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}
BAGIAN : Penyakit ginjal kronis proteinurik dikaitkan dengan perubahan umur sel darah merah, deformabilitas dan metabolisme
Rosi Bissinger, Travis Nemkov & dkk.
Pengembangan darianemiamerupakan komplikasi khas dari stadium lanjutpenyakit ginjal kronis(CKD) dan berhubungan dengan gangguan kualitas hidup1dan peningkatan risiko kejadian kardiovaskular2dan rawat inap,3serta penurunan kognitif.4Tingkat keparahananemiatelah dipandang sebagai prediktor independen kematian pada CKD yang bergantung pada dialisis dan nondialisis (penyakit ginjal kronis) pasien.5Patofisiologi penyakit ginjal-terkaitanemiakompleks dan melibatkan defisiensi besi dan eritropoietin (EPO) dalam pengaturan peradangan tingkat rendah, yang, pada gilirannya, mengganggu eritropoiesis normal pada CKD.penyakit ginjal kronis) pasien.6Pada CKD lanjut (penyakit ginjal kronis), respons EPO tidak cukup rendah dalam kaitannya dengan tingkatanemia.7,8 Tingginya prevalensi defisiensi besi bersamaan pada CKD (penyakit ginjal kronis) merupakan akibat dari gangguan homeostasis besi.9 Mekanisme kehilangan zat besi yang diabaikan pada CKD (penyakit ginjal kronis) adalah proteinuria, yang dapat menyebabkan hilangnya zat besi yang terikat transferin melalui urin (sampai {1}}.3 mg/hari) bila proteinuria mencapai kisaran nefrotik.10Faktor lain yang dianggap berkontribusi terhadapanemiadi CKD (penyakit ginjal kronis) patients is the shortened lifespan of red blood cells (RBCs), first described >60 tahun yang lalu.6,11,12
Manfaat Cistanche: mengobati penyakit ginjal dan meningkatkan fungsi ginjal
Sebuah studi baru-baru ini menggunakan tes napas karbon monoksida menunjukkan bahwa umur sel darah merah semakin menurun dari 120 hari pada pasien dengan stadium 1 CKD (penyakit ginjal kronis) sampai 60 hari pada pasien dengan stadium 5 CKD (penyakit ginjal kronis).13 Khususnya, transfusi sel darah merah alogenik dari donor sehat ke CKD (penyakit ginjal kronis) pasien diikuti dengan pembersihan cepat sel darah merah yang ditransfusikan tanpa bukti hemolisis.12Mekanisme yang masuk akal untuk pengamatan ini mungkin adalah stimulasi kematian sel seperti apoptosis pada sel darah merah berinti, yang menunjukkan pola cedera di mana integritas membran sel tidak terganggu dan konten sitoplasma tetap utuh.14Sel darah merah yang mengalami kematian sel menunjukkan berbagai perubahan morfologi akibat kerusakan sitoskeletal, seperti pembentukan bleb permukaan, hilangnya elastisitas membran, dan/atau dehidrasi seluler.15Pada tingkat molekuler, kematian sel darah merah dikaitkan dengan akumulasi Ca2þ intraseluler, perubahan status energi seluler, dan pemecahan asimetri fosfolipid, yang pada akhirnya mengarah pada eksternalisasi fosfatidilserin (PS) pada membran plasma luar.15,16Akibatnya, makrofag dan sel dendritik khusus dengan cepat mengenali sel darah merah yang dieksternalisasi PS, yang mengarah ke fagositosis eritrosa dan katabolismenya di limpa dan hati.17Karena patofisiologi yang membingungkan daripenyakit ginjal–terkaitanemiapada manusia, penelitian pada hewan diperlukan untuk menunjukkan mekanisme yang berkontribusi. Nefropati yang diinduksi doksorubisin (DIN) pada tikus 129S1/SvImJ18dan tikus dengan defisiensi podocin yang dapat diinduksi (Nphs2Dipod)19adalah 2 model yang ditandai dengan induksi proteinuria kisaran nefrotik dalam beberapa hari, perkembangan menjadi gagal ginjal setelah 3 minggu, dan kematian dalam 6 hingga 7 minggu.19–21Kedua model tikus secara efektif merekapitulasi semua tahap CKD manusia (penyakit ginjal kronis). Dalam penelitian ini, kami menguji apakah gagal ginjal progresif pada tikus ini dengan proteinuricpenyakit ginjalmempengaruhi umur sel darah merah dan berkontribusi padaanemia. Secara paralel, kami memeriksa fenotipe RBC dalam darah yang diambil dari CKD (penyakit ginjal kronis) pasien dengan proteinuria kisaran nefrotik.
CKD (penyakit ginjal kronis) dananemia: CISTACHE
METODE
Informasi rinci tentang bahan dan metode disediakan dalam Bahan dan Metode Tambahan.
Studi tikus
Eksperimen dilakukan pada tikus 129S1/SvImJ tipe liar berumur 8-minggu dari kedua jenis kelamin (Charles River). DIN diinduksi dengan injeksi tunggal doxorubicin (14,5 mg/g berat badan), seperti yang dijelaskan sebelumnya.18,22Untuk mengontrol efek myelotoxic dari doxorubicin yang tidak terkait dengan perkembangan nefropati, tikus C57BL/6 yang resisten terhadap doxorubicin juga dikenai protokol pengobatan yang sama.23 Selain itu, eksperimen serupa dilakukan pada 8-tikus berumur seminggu dengan penghapusan podocin (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G] 8Jhm*Tg[tetO] yang dapat diinduksi yang dapat diinduksi -cre]1Jaw) atau tikus Nphs2Dipod, yang diobati dengan doksisiklin selama 14 hari.19Semua percobaan hewan dilakukan sesuai dengan National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals dan German Law for the Welfare of Animals, dengan persetujuan dari otoritas setempat (Regierungspräsidium Tübingen, nomor persetujuan M12/17 dan M17/19G ). Desain eksperimental studi tikus diuraikan dalam Gambar Tambahan S1.
pasien
Studi pasien dilakukan sesuai dengan Deklarasi Helsinki dan disetujui oleh komite etik lokal Rumah Sakit Universitas Tübingen (556/2018BO2). Sampel darah dan urin lithium-heparin diperoleh dari pasien dengan proteinuria kisaran nefrotik dan laju filtrasi glomerulus (GFR; stadium 1-2; n 10) dan pasien dengan penurunan GFR (CKDpenyakit ginjal kronis) tahap 3-5; n 15) di Rumah Sakit Universitas Tübingen. Sebagai kelompok kontrol, darah dari sukarelawan sehat yang sesuai dengan usia dan jenis kelamin (n 25) disediakan oleh bank darah Rumah Sakit Universitas Tübingen. Semua sampel manusia dikumpulkan setelah persetujuan. Karakteristik klinis pasien dinyatakan dalamTabel 1.
Tabel 1|Karakteristik pasien CKD (penyakit ginjal kronis) dan donor darah yang sehat
Analisis aliran cytometry
Parameter yang berbeda dari kematian sel sel darah merah ditentukan oleh sesama sitometri.14 Untuk menentukan umur sel darah merah in vivo, 25 ml pewarna 5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester [5(6)-CFDA, SE] disuntikkan pada konsentrasi 9,96 mM (dilarutkan dalam dimetilsulfoksida) ke dalam orbital retro pleksus tikus liar tipe 129S1/SvImJ dan doxorubicin yang disuntikkan, seperti yang dijelaskan sebelumnya.24 Pada titik waktu yang ditunjukkan, darah diambil dari pleksus retro-orbital tikus, dan persentase 5(6)-CFDA, SEþ sel terdeteksi oleh sesama analisis cytometry. Terakhir, data dianalisis menggunakan perangkat lunak FlowJo (FlowJo LLC).
Deformabilitas sel darah merah dan ektasitometri gradien osmotik
Deformabilitas RBC diukur menggunakan Penganalisis Sel Rotasi Optik Berbantuan Laser (LORCA Max Sis; RR Mechatronics), yang telah dijelaskan secara rinci di tempat lain.25Analisis ektacytometry gradien osmotik (cosmos can) juga dilakukan menggunakan LORCA Max Sis dan mengukur deformabilitas dalam berbagai kondisi osmotik.26
Pemeriksaan histologi
Untuk pewarnaan hematoxylin dan eosin, limpa dan femur diwarnai dengan hematoxylin dan eosin. Semua slide diwarnai dengan antibodi primer Ter119 (BD Pharmingen; pengenceran 1:500). Untuk pewarnaan asam–Schiff berkala, irisan setebal 2.5-mmginjaldiwarnai dengan reagen asam-Schiff periodik (Carl Roth) dan hematoxylin (Abcam). Pewarnaan May-Grünwald-Giemsa (metode Pappenheim) dilakukan untuk menentukan perubahan bentuk RBC, seperti yang dijelaskan sebelumnya.27 Isolasi glomeruli dilakukan dengan menggunakan pendekatan biotinilasi dan pemilahan sel.19Untuk deteksi protein podocin, antibodi dari Sigma diterapkan (P0372).19Roti-Mount Fluor Care 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Carl Roth) digunakan untuk mewarnai inti.
Metabolomik spektrometri massa kromatografi cair kinerja sangat tinggi dari sel darah merah tikus
Analisis dilakukan seperti yang diterbitkan sebelumnya.28Secara singkat, platform analitik menggunakan sistem kromatografi cair kinerja ultra-tinggi Vanquish (Thermo Fisher Scientific) yang digabungkan secara online ke spektrometer massa Q Exactive (Thermo Fisher Scientific).
Cistanche mengobati penyakit ginjal yang disebabkan oleh anemia
Analisis statistik
Data disediakan sebagai sarana aritmatika SEM atau sebagai median dengan rentang interkuartil (persentil 25-75) dengan n mewakili jumlah hewan yang digunakan atau pasien yang disertakan, masing-masing. Data diuji normalitasnya dengan uji Kolmogorov-Smirnov, uji D'Agostino, dan uji Shapiro-Wilk. Varians dianalisis dengan uji Bartlett untuk varians yang sama. Tukey atau Dunn multiple-comparison posttest, unpaired Student t-test, atau Mann-Whitney U test dilakukan oleh GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). P < 0.05="" dengan="" pengujian="" ekor="" 2-="" dianggap="" signifikan="" secara="" statistik.="" grafik="" tambahan="" diplot="" melalui="" graphpad="" prism="">
HASIL
Penyakit ginjal proteinurik eksperimental menginduksianemiapada tikus Setelah induksi, tikus 129S1 / SvImJ dengan tikus DIN dan Nphs2Dipod mengembangkan proteinuria kisaran nefrotik (Gambar 1a dan Gambar Tambahan S2C) dan gagal ginjal progresif yang ditandai dengan kadar urea plasma yang tinggi sejak hari ke 20 dan seterusnya (Gambar 1b dan Gambar Tambahan S2D). Selama 10 hari pertama, tikus mengalami kenaikan berat badan dengan asites (Gambar 1c dan Gambar Tambahan S2E), yang mencerminkan retensi natrium yang disebabkan oleh ekskresi protease serin atau proteinuria.18Setelah pembalikan spontan retensi natrium, tikus ini terus kehilangan berat badan. Pada tikus dengan DIN dan pada tikus Nphs2Dipod, gambar mikroskop cahaya, ditangkap setelah 10 hari, mengungkapkan perubahan histomorfologi khas yang konsisten dengan sklerosis glomerulus segmental fokal (Gambar 1d dan Gambar Tambahan S2B). Ini tidak ada pada tikus C57BL / 6 yang disuntikkan doxorubicin (Gambar 1d). Pengobatan doksorubisin menginduksi penurunan yang kuat dalam hemoglobin, jumlah RBC, dan hematokrit (Gambar 1e-g) dari hari ke 10 pada tikus 129S1/SvImJ dan C57BL/6, yang kemudian dinormalisasi pada hari ke 20 dan 30. Sebaliknya, pada hari ke-20 dan ke-30. hari ke 20 dan 30, 129S1 / SvImJ yang disuntikkan doxorubicin dan tikus yang kekurangan podocin berkembang progresifanemia, ditandai dengan pengurangan volume sel darah rata-rata (Gambar 1h) dan penurunan hemoglobin (Gambar Tambahan S2F), menunjukkan bahwaanemiadikaitkan dengan gagal ginjal progresif dan tidak dengan pengobatan doxorubicin per lihat.
Gambar 1|Fungsi ginjal dan anemia nyata pada tikus 129S1 / SvImJ yang disuntikkan doksorubisin.( a – d ) tikus 129S1 / SvImJ yang disuntikkan doxorubicin mengembangkan (a) proteinuria tinggi, (b) peningkatan progresif konsentrasi urea plasma, (c) peningkatan berat badan sementara, dan (d) perubahan histomorfologi khas yang menunjukkan sklerosis glomerulus segmental fokal pada hari ke 10 (pewarnaan asam-Schiff periodik; batang 10 mm). (e–h) Selain itu, tikus-tikus ini berkembanganemiadicerminkan oleh (e) penurunan kadar hemoglobin, (f) jumlah sel darah merah (RBC) yang lebih rendah, (g) penurunan kadar hematokrit, dan (h) penurunan rata-rata volume sel darah. ( a – d ) Tikus C57BL / 6 yang disuntikkan doksorubisin tidak menunjukkan tanda-tanda cedera ginjal, dan (misalnya)anemiapada hari 10 dinormalisasi pada hari 20 dan 30. Aritmatika berarti SEM ditampilkan. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="">< 0.001,and="" ****p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" #p=""><0.05, ##p="" <="" 0.01,="" ###p="" <="" 0.001,="" and="" ####p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" to="" the="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="" <="" 0.05,="" §§p="" <="" 0.01,="" §§§p="" <="" 0.001,="" and="" §§§§p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="">
Anemia pada penyakit ginjal proteinurik eksperimental tidak disebabkan oleh gangguan eritropoiesis
Kedua model tikus yang anemia menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam persentase retikulosit yang bersirkulasi (Gambar 2a dan Gambar Tambahan S3C). Konsentrasi EPO plasma meningkat secara dramatis pada hari ke 10 pada 129S1/SvImJ dengan DIN dan tikus C57BL/6 yang sehat tetapi dinormalisasi lagi pada hari ke 20 dan 30 (Gambar 2b). Pada tikus yang kekurangan podocin, konsentrasi EPO plasma melonjak pada hari ke 10 dan tetap meningkat pada hari ke 20 dan 30 (Gambar Tambahan S2H). Dalam analisis histologis dari sumsum tulang dan limpa, jumlah sel prekursor eritroid dibandingkan dengan prekursor myeloid meningkat pada hari ke 30 (Gambar 2d-g), menunjukkan eritropoiesis terstimulasi pada tikus 129S1/SvImJ anemia dengan DIN.
Gambar 2|Eritropoiesis dirangsang pada tikus 129S1/SvImJ yang disuntikkan doksorubisin dengan anemia. (a) Anemiapada tikus 129S1/SvImJ yang disuntik doxorubicin terjadi meskipun jumlah retikulosit meningkat pada hari ke-2{{30}} dan 30. (b) Konsentrasi eritropoietin plasma sangat meningkat pada hari 10 pada tikus 129S1/SvImJ dan C57BL/6 yang disuntikkan doksorubisin tetapi dinormalisasi kembali pada hari ke-20 dan 30. (c–e) Kuantifikasi jumlah absolut (c) sel myeloid dan (d) eritroid di sumsum tulang. (e) rasio sel myeloid-ke-eritroid pada tikus 129S1/SvImJ yang sehat dan yang disuntikkan doksorubisin dalam sumsum tulang menunjukkan jumlah sel prekursor eritroid yang lebih tinggi pada tikus 129S1/SvImJ yang disuntikkan doksorubisin pada hari ke 3{{5{{52 }}}}. (f,g) Histologi (f) limpa dan (g) sumsum tulang menunjukkan peningkatan sel prekursor eritroid, diamati bahkan pada perbesaran yang lebih rendah, pada tikus 129S1/SvImJ yang disuntikkan doksorubisin (panel kanan) dibandingkan dengan tikus sehat (panel kiri). ) pada hari ke 30. (f,g) Imunohistokimia ter119 (panel bawah) mendukung temuan hematoxylin dan eosin (H&E). Ter119 positif pada prekursor eritroid (sel berinti) dan dalam sel darah merah (sel tak berinti). Batang 100 mm; sisipan 25 mm. Aritmatika berarti SEM ditampilkan. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" dan="" ***p="">< 0,001="" menunjukkan="" perbedaan="" yang="" signifikan="" antara="" tikus="" sehat="" 129s1/svimj="" dan="" 129s1/svimj="" yang="" disuntik="" doksorubisin;="" ##p="">< 0,01="" dan="" ####p="">< 0,0001="" menunjukkan="" perbedaan="" yang="" signifikan="" terhadap="" baseline="" tikus="" 129s1/svimj="" yang="" disuntik="" doksorubisin;="" dan="" p="">< 0,05,="" p="">< 0,01,="" dan="" p="">< 0,0001="" menunjukkan="" perbedaan="" yang="" signifikan="" antara="" tikus="" c57bl/6="" injeksi="" doksorubisin="" dan="" c57bl/6="" injeksi="">
Keuntungan dariCistanche: mengobati penyakit ginjal dan meningkatkan fungsi ginjal
Berkurangnya umur sel darah merah adalah penyebab utama anemia pada penyakit ginjal proteinurik eksperimental
Eksternalisasi PS pada selebaran luar membran plasma sel darah merah merupakan indikator kematian sel dan promotor fagositosis eritrosit.14Kematian sel RBC dikuantifikasi menggunakan analisis penyortiran sel yang diaktifkan fluoresensi dari PS permukaan fluorescent annexin V-bound.14 In freshly drawn blood, the percentage of PS-exposing cells was >{{0}}kali lipat lebih tinggi pada hari ke-20 pada tikus dengan DIN (4,16 persen & 0.86 persen ) dibandingkan dengan tikus sehat (1,{{7 }} persen & 0.11 persen ) (Gambar 3a). Demikian pula, tikus Nphs2Dipod menunjukkan perkiraan 2-peningkatan paparan PS (1,27 persen & 0,20 persen) dibandingkan dengan tikus sehat (0,58 persen & 0,05 persen) pada hari ke 30 (Gambar Tambahan S3A). Diketahui bahwa sel darah merah dihilangkan dari sirkulasi oleh makrofag yang berada di limpa.17 Oleh karena itu, pengamatan ini dapat menjelaskan rasio limpa/berat badan tikus Nphs2Dipod yang lebih tinggi (Gambar Tambahan S2G), di mana sel darah merah terdegradasi dua kali lebih banyak dibandingkan dengan tikus sehat. C57BL/6 tikus. Karena proteinuria kisaran nefrotik menyebabkan disproteinemia, kami menyelidiki lebih lanjut apakah peningkatan kematian sel RBC dapat dirangsang oleh komponen dalam plasma tikus dengan DIN. Seperti yang digambarkan pada Gambar 3b, paparan PS pada hari 10 dan 20 dua kali lebih tinggi setelah inkubasi (30 menit pada 37OC) sel darah merah sehat dalam plasma tikus 129S1 / SvImJ yang disuntikkan doxorubicin dibandingkan dengan inkubasi dalam plasma tikus sehat. Masuknya Ca2þ ke dalam sel darah merah, dimediasi oleh saluran kation nonselektif tegangan-gated dan independen,30,31adalah salah satu pengatur utama kematian sel RBC. Dalam sel darah merah yang dikumpulkan pada hari ke 20 dan 30 dari tikus 129S1/SvImJ dengan DIN, konsentrasi Ca2þ intraseluler meningkat (Gambar 3c); fenomena ini direkapitulasi pada tikus Nphs2Dipod pada hari ke 20 (Gambar Tambahan S3B). Pada kedua model tikus, ada korelasi negatif yang signifikan dari persentase sel darah merah PS-positif, dengan tingkat keparahananemiadicerminkan oleh kadar hemoglobin (Gambar 3d dan Gambar Tambahan S3D). Selain itu, ada korelasi yang signifikan dengan kerusakan ginjal yang dicerminkan oleh konsentrasi urea plasma (Gambar 3e dan Gambar Tambahan S3E) dan pada tingkat yang lebih rendah dengan proteinuria (Gambar 3f dan Gambar Tambahan S3F). Untuk mengkompensasi kehilangan sel darah merah dalamanemia, pembentukan sel darah merah baru dirangsang pada kedua tikus, seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan persentase retikulosit yang bersirkulasi, dan secara signifikan berkorelasi dengan besarnya sel darah merah yang terpapar PS (Gambar 3g dan Gambar Tambahan S3G).
Gambar 3|Tikus dengan nefropati yang diinduksi doksorubisin mengembangkan peningkatan kematian sel darah merah (RBC) yang dimediasi oleh peningkatan kadar kalsium intraseluler.(a) Eksternalisasi fosfatidilserin (PS), yang mencerminkan kematian sel darah merah, meningkat pada hari ke-20 dan 30 setelah induksi nefropati yang diinduksi doksorubisin. (b) Inkubasi sel darah merah sehat dalam plasma yang diambil pada hari 10 dan 20 dari tikus ini menyebabkan eksternalisasi PS. (c) Eksternalisasi PS disertai dengan peningkatan kadar kalsium intraseluler sel darah merah yang diambil pada hari ke-20 dan 3{{30}} setelah induksi. (d-g) Persentase (d) sel darah merah yang terpapar PS berkorelasi dengan kadar hemoglobin, kerusakan ginjal yang ditunjukkan oleh (e) konsentrasi urea plasma dan (f) proteinuria, serta dengan (g) pembentukan retikulosit. (d–g) Data mencakup setiap titik waktu (0, 10, 20, dan 30 hari) dari setiap tikus sehat 129S1/SvImJ dan 129S1/SvImJ dengan nefropati yang diinduksi doksorubisin. Aritmatika berarti SEM ditampilkan. **P < 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" dan="" ****p="">< 0,0001="" menunjukkan="" perbedaan="" yang="" signifikan="" antara="" tikus="" 129s1/svimj="" sehat="" dan="" yang="" disuntik="" doksorubisin="" (in.)="" 129s1/svimj;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" dan="" ####p="">< 0,0001="" menunjukkan="" perbedaan="" yang="" signifikan="" terhadap="" baseline="" tikus="" 129s1/svimj="" yang="" disuntik="" doksorubisin;="" dan="" p="">< 0,0001="" menunjukkan="" perbedaan="" yang="" signifikan="" antara="" tikus="" 129s1/svimj="" yang="" disuntik="" doksorubisin="" dan="" c57bl/6="" yang="" disuntik="" doksorubisin.="" krea,="" kreatinin;="" lkm,="" intensitas="" fluoresensi="">
Keuntungan dariCistanche: mengobati penyakit ginjal dan meningkatkan fungsi ginjal
