Evaluasi Pengaruh Imunitas Mukosa Vaksin Subunit Bovine Viral Diare Virus E2Fc Dan E2Ft

Abstrak:

Diklasifikasikan sebagai penyakit menular kelas B oleh Organisasi Kesehatan Hewan Dunia (OIE), diare virus sapi/penyakit mukosa adalah penyakit akut dan sangat menular yang disebabkan oleh virus diare virus sapi (BVDV). Endemik BVDV yang bersifat sporadis seringkali menimbulkan kerugian ekonomi yang besar bagi industri susu dan daging sapi. Untuk menjelaskan pencegahan dan pengendalian BVDV, kami mengembangkan dua vaksin subunit baru dengan mengekspresikan protein rekombinan fusi virus diare sapi E2 (E2Fc dan E2Ft) melalui sel HEK293 yang tersuspensi. Kami juga mengevaluasi efek kekebalan dari vaksin tersebut. Hasilnya menunjukkan bahwa kedua vaksin subunit menginduksi respon imun mukosa yang kuat pada anak sapi. Secara mekanis, E2Fc berikatan dengan reseptor Fc (Fc RI) pada sel penyaji antigen (APC) dan meningkatkan sekresi IgA, sehingga menghasilkan respons imun sel T yang lebih kuat (tipe Th1). Titer antibodi penetralisir yang distimulasi oleh vaksin subunit E2Fc yang diimunisasi mukosa mencapai 1:64, lebih tinggi dibandingkan dengan vaksin subunit E2Ft dan vaksin inaktif intramuskular. Dua vaksin subunit baru untuk imunitas mukosa yang dikembangkan dalam penelitian ini, E2Fc dan E2Ft, selanjutnya dapat digunakan sebagai strategi baru untuk mengendalikan BVDV dengan meningkatkan imunitas seluler dan humoral.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Kata Kunci: BVDV; vaksin subunit; vaksinasi mukosa; bahan pembantu molekuler; reseptor Fc; feritin

1. Perkenalan

Virus diare virus sapi (BVDV), bersama dengan virus penyakit perbatasan (BDV) dan virus demam babi (CSFV), termasuk dalam genus Pestivirus dari keluarga Flaviviridae [1]. Kombinasi infeksi persisten (PI) dan infeksi sitopatik pada anak sapi sering menyebabkan penyakit mukosa yang parah, dengan angka kematian hingga 100% [2]. BVDV tersebar luas di dunia, dengan tingkat antibodi positif yang relatif tinggi. Di Cina, tipe yang umum adalah 1B, 1M, dan 1Q dari tipe-1 BVDV [3–5]. Analisis filogenetik mengungkapkan bahwa virus diare virus sapi tipe 1 diimpor ke Tiongkok pada tahun 1960an dan setidaknya ada delapan genotipe BVDV-1 yang beredar di Tiongkok. Diantaranya, 1B dan 1m merupakan genotipe utama [6]. Hal ini konsisten dengan penyelidikan epidemiologi kami terhadap BVDV di Tibet. Virion bola BVDV berdiameter sekitar 40-60 nm dan diselimuti oleh kapsul. Genom RNA virus beruntai tunggal BVDV memiliki panjang sekitar 12,5 KB. Poliprotein virus kemudian dibelah oleh kombinasi protease inang dan virus menjadi empat protein struktural (C, E0, E1, E2) dan delapan protein nonstruktural (Npro, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) [7, 8]. BVDV-E2 memiliki imunogenisitas yang kuat, dan bukti menunjukkan bahwa antibodi penetralisir (NAbs) yang diinduksi pada hewan yang terinfeksi terutama menargetkan E2 [9]. Sementara itu, vaksin subunit E2 multivalen yang menargetkan strain BVDV utama yang bersirkulasi dapat memberikan perlindungan parsial terhadap strain homolog. Vaksin virus herpes rekombinan yang dibuat dengan protein BVDV E2 dan protein bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) D menginduksi respons imun spesifik terhadap kedua virus di inang setelah nebulisasi intranasal [10]. Oleh karena itu, mungkin merupakan strategi yang baik untuk mengendalikan BVDV dengan menggunakan protein BVDV E2 yang imundominan sebagai vaksin subunit. Rongga hidung kaya akan limfosit dan sel penyaji antigen, menyediakan lingkungan mikro yang cocok untuk imunisasi mukosa, dan melindungi vaksin protein agar tidak distabilkan oleh asam dan basa. Selain itu, imunoglobulin A (IgA) yang diinduksi vaksin intranasal dan limfosit B dan T memori yang menetap di saluran pernapasan bagian atas mampu secara efektif memblokir replikasi virus [11]. Imunisasi melalui rongga hidung tidak hanya menginduksi imunitas mukosa tetapi juga merangsang respon imun sistematis, yang memberikan efek perlindungan imun. Penelitian sebelumnya telah menemukan bahwa antigen dapat dimasukkan sepenuhnya ke dalam epitel mukosa dengan menargetkan vaksin subunit ke reseptor Fc neonatal (FcRn) sel M pada epitel mukosa, sehingga secara efektif merangsang respon imun spesifik [12-14]. Efek imunisasi dari semprotan hidung ditingkatkan secara signifikan dengan menggunakan vaksin rekombinan terlarut yang dibentuk oleh fusi bahan pembantu molekuler dan antigen imun [15]. IgGFc berinteraksi dengan FcRn pada permukaan sel imun untuk berpartisipasi dalam pengangkutan IgG melalui permukaan mukosa, meningkatkan imunogenisitas protein yang menyatu dengan Fc pada mamalia [16]. Protein fusi IgGFc dilaporkan membentuk dimer yang stabil melalui ikatan disulfida di daerah engsel Fc untuk meningkatkan waktu paruh dan stabilitas protein rekombinan, sehingga meningkatkan respon imun seluler, mukosa, dan humoral [17,18]. Vaksin baru yang dimediasi oleh IgGFc telah berhasil diterapkan pada virus influenza A (HA-HuFc) [19] dan virus demam babi (CSFV-E2Fc) [20].

Manfaat cistanche tubulosa-memperkuat sistem kekebalan tubuh

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Meningkatkan Imunitas

【Minta lebih lanjut】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikasi WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Modifikasi permukaan yang tepat memungkinkan nanopartikel berada secara stabil dalam sistem peredaran darah [21]. Ditandai dengan luas permukaan yang besar dan struktur bola berongga, Ferritin (Ft) dilaporkan membentuk nanopartikel dari 24 polipeptida identik melalui perakitan sendiri dengan berbagai protein fusi yang diekspresikan, yang mendorong pengenalan dan penyerapan antigen oleh sel penyaji antigen, sehingga menginduksi respon imun yang kuat [22,23]. Ferritin banyak digunakan dalam pengembangan vaksin. Integrasi kovalen antigen domain pengikat reseptor (RBD) dari protein lonjakan SARS-CoV-2 dan Helicobacter pylori non-heme ferritin yang dirakit sendiri menghasilkan produksi antibodi penetral yang kuat. Nanopartikel protein feritin juga memiliki kemampuan yang kuat untuk meningkatkan stabilitas antigen, mengatasi hambatan biologis, dan mencapai pengiriman yang ditargetkan. Karena vaksin nano dapat ditangkap secara efisien oleh sel dendritik dan makrofag [24], nanopartikel feritin adalah platform baru dan menjanjikan untuk pengiriman antigen. Saat ini, vaksin utama yang tersedia untuk BVDV adalah vaksin inaktif dan vaksin subunit, yang keduanya memerlukan vaksinasi yang memakan waktu dan padat karya melalui suntikan intramuskular. Sementara itu, vaksin inaktif yang diproduksi melalui sel MDBK rentan menyebabkan bovine neonatal pancytopenia (BNP) [25]. Namun, vaksin subunit telah menunjukkan profil keamanan yang unggul [26]. Imunisasi intranasal telah terbukti menargetkan antigen pada reseptor Fc R, menyebabkan respon imun mukosa dan sistemik [15,16]. Namun, efek kekebalan dari imunisasi intranasal dengan vaksin BVDV dan efektivitas BVDV-E2 yang dikombinasikan dengan bahan pembantu molekuler (IgGFc dan Ft) masih kurang diteliti. Oleh karena itu, pengembangan vaksin mukosa dengan protein BVDV-E2 untuk meningkatkan kemanjuran kekebalan tubuh merupakan prioritas utama dalam bidang ini. Dalam penelitian saat ini, vaksin subunit Fc atau Ft yang menyatu dengan protein E2 dihasilkan dalam sel HEK293. Temuan menunjukkan bahwa vaksinasi hidung dengan vaksin subunit BVDV E2Fc lebih efektif dibandingkan vaksinasi hidung dengan vaksin subunit E2Ft, sehingga semakin mendukung indikasi bahwa protein fusi E2Fc adalah pilihan vaksin subunit yang lebih manjur.

manfaat cistanche untuk pria-memperkuat sistem kekebalan tubuh

2. Hasil

2.1. Ekspresi Protein Rekombinan dalam Sel HEK293 yang Ditangguhkan

Diagram struktur E2, E2Ft, dan E2Fc ditunjukkan pada Gambar 1A. Uji imunofluoresensi tidak langsung pertama kali dilakukan menggunakan antibodi monoklonal yang diawetkan (mAb) BVDVE2 untuk memverifikasi ekspresi imun dari protein fusi rekombinan. Sel yang ditransfeksi dengan plasmid yang mengandung gen E2, E2Ft, atau E2Fc memancarkan sinyal fluoresen, sedangkan sel yang diberi perlakuan tiruan tidak menunjukkan sinyal fluoresen (Gambar 1B). Ini menunjukkan ekspresi E2, E2Ft, dan E2Fc yang kuat dalam sel HEK293. Untuk menentukan apakah protein ini diekspresikan secara sekretori, supernatan sel HEK293 yang ditransfeksi dengan plasmid yang mengandung gen E2, E2Ft, atau E2Fc dikumpulkan setelah 6 hari. Tingkat ekspresi imuno masing-masing protein dianalisis dengan Western blot dengan antibodi BVDV-E2. Hasilnya menunjukkan bahwa sel yang ditransfeksi dengan plasmid yang mengandung gen E2, E2Ft, dan E2Fc mengekspresikan protein yang sesuai dengan massa molekul masing-masing 45 kDa, 60 kDa, dan 80 kDa (Gambar 1C). Hasil pewarnaan SDS-PAGE dan Coomassie blue menunjukkan bahwa pita masing-masing sampel konsisten dengan hasil blotting (Gambar 1D). Untuk memastikan spesifisitas dan akurasi dalam mendeteksi ekspresi imun protein, uji pra-absorpsi mAb BVDV-E2 pertama kali dilakukan dan diikuti dengan uji replikasi virus dan Western blot untuk membuktikan spesifisitas mAb BVDV E2. Hasilnya menunjukkan bahwa antibodi hanya dapat bereaksi terhadap protein BVDV-E2 (Gambar S1). Secara keseluruhan, bukti menunjukkan bahwa protein rekombinan E2, E2Fc, dan E2Ft diekspresikan secara melimpah dalam sel HEK293.

Gambar 1. Ekspresi imun dan identifikasi protein E2, E2Ft, dan E2Fc dalam sel HEK293. (A) Diagram konstruksi BVDV-E2, BVDV-E2Ft, dan BVDV-E2Fc. (B) Deteksi ekspresi imuno protein rekombinan oleh IFA; 48 jam setelah ditransfeksi dengan E2, E2Fc, atau E2Ft, sel HEK293 diperbaiki untuk IFA. Antibodi monoklonal BVDV E2 dan IgG anti-tikus kambing FITC masing-masing diterapkan sebagai antibodi primer dan sekunder. Inti diwarnai dengan DAPI (biru). Bilah skala mewakili 20 µm. (C) Deteksi protein rekombinan yang dimurnikan dengan Western blot. (D) Identifikasi protein rekombinan yang dimurnikan oleh SDS-PAGE.

2.2. Aktivasi APC-Fc RI oleh BVDV-E2Fc

Pengenalan antigen BVDV-E2Fc (E2, E2Ft) oleh makrofag berperan penting dalam aktivasi respon imun. Untuk mendeteksi efek aktivasi protein fusi pada sistem kekebalan, fungsi pengenalan dan aktivitas fagositosis protein fusi oleh makrofag alveolar sapi (BAM) diverifikasi secara in vitro. Hasilnya menunjukkan bahwa CD64 (Fc RI), yang terdeteksi oleh penanda antibodi IgG anti-kelinci kambing (merah) berlabel Cy3-, terlokalisasi di sitoplasma dan membran sel makrofag sapi. E2Fc dideteksi menggunakan IgG anti-tikus kambing (fluoresensi hijau). Gambar digabungkan untuk analisis ko-lokalisasi CD64 (Fc RI) dan E2Fc pada makrofag alveolar sapi (warna kuning; Gambar 2A). Sebaliknya, CD64 tidak melakukan co-localize dengan E2 atau E2Ft. Hasil penelitian menunjukkan bahwa translokasi protein fusi E2Fc melintasi penghalang mukosa dimediasi oleh Fc RI.

Gambar 2. Aktivasi APC-Fc RI oleh BVDV-E2Fc. (A) Analisis ko-lokalisasi CD64 (Fc RI) dengan protein E2Fc pada BAM dideteksi dengan mikroskop confocal. CD64 (Fc RI) pada BAM diwarnai dengan IgG anti-CD64 kelinci dan IgG anti-kelinci berlabel Cy3-masing-masing sebagai antibodi primer dan sekunder.

Fagositosis, pengambilan partikel oleh makrofag, diukur sebagai laju fagositosis. Tingkat fagositosis mikrosfer terkonjugasi FITC, protein E2, E2Ft, dan E2Fc oleh makrofag alveolar sapi masing-masing adalah 28,9%, 55,6%, 57,1%, dan 65,6%. Dengan kata lain, laju fagositosis E2Fc lebih tinggi dibandingkan E2Ft, yang selanjutnya membuktikan bahwa penangkapan antigen oleh monosit diselesaikan dengan pengikatan reseptor spesifik pada permukaannya dengan ligan yang sesuai. Namun, makrofag alveolar sapi tidak memiliki reseptor untuk protein E2 dan E2Ft, dan mereka hanya mengeluarkan benda asing melalui fagositosis, yang merupakan metode pertahanan tubuh paling dasar (Gambar 2B).

2.3. Respon Kekebalan Mukosa dan Humoral yang Kuat Dipicu oleh E2Fc Di Vivo

Prosedur imunisasi pedet digambarkan pada Gambar 3A. Kadar IgA dan SIgA yang dihasilkan anak sapi yang diimunisasi dengan protein fusi dideteksi dengan ELISA tidak langsung. Sampel serum, feses, dan mukosa hidung dikumpulkan dan dideteksi dengan kit ELISA komersial. Kelompok yang diimunisasi E2Fc menunjukkan tingkat IgA dan SIgA tertinggi dalam serum dan mukosa, baik pada hewan yang diimunisasi secara intramuskular dan mukosa (p <0.01) (Gambar 3B, C). Tidak ada perbedaan signifikan pada kadar IgA yang diamati antara kelompok yang diimunisasi E2- E2-dan kelompok yang diimunisasi E2Ft, namun terdapat perbedaan pada kadar SIgA (p <0,05). Kesimpulannya, protein fusi E2Fc mampu menginduksi respon imun mukosa dan humoral yang lebih kuat dibandingkan protein lainnya.

2.4. E2Fc Dapat Menginduksi Respon Kekebalan Sel T yang Lebih Kuat (Tipe Th1) terhadap BVDV Dibandingkan dengan E2Ft Di Vivo

Sitokin tipe Th{0}}IFN- yang diekspresikan oleh sel T dan sel NK memediasi imunitas seluler, yang penting untuk pembersihan virus. Untuk mendeteksi distribusi sel T CD4+ dan CD8+ pengekspres IFN pada anak sapi, limfosit diisolasi dari PBMC anak sapi 35 hari pasca imunisasi. Limfosit distimulasi dengan BVDV yang dinonaktifkan, dan flow cytometry kemudian diterapkan untuk mengidentifikasi sel T IFN- -yang mensekresi CD4+ dan CD8+. Kelompok yang diimunisasi mukosa dengan E2Fc dan E2Ft menunjukkan proporsi sel T IFN- -yang mensekresi CD4+ dan CD8+ T yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok E2. Kelompok yang diimunisasi mukosa dengan E2Fc memiliki tingkat sel T IFN- -yang mensekresi CD3+ turunan CD8+ yang lebih tinggi dibandingkan kelompok yang diimunisasi dengan BVDV yang dilemahkan (p <0,05) (Gambar 4). Namun, tidak ada perbedaan signifikan pada sel T CD4+ yang mensekresi CD3+ turunan IFN4+ yang diamati antara kelompok dengan E2Fc yang diimunisasi mukosa dan dengan BVDV yang tidak aktif. Singkatnya, injeksi intramuskular dan imunisasi mukosa dengan E2Fc menginduksi respon imun sel T yang lebih kuat (tipe Th1) terhadap BVDV dibandingkan dengan E2Ft.

Gambar 3. Diagram alur percobaan imunisasi anak sapi dan respon imun mukosa dan humoral yang diinduksi oleh E2Fc in vivo. (A) Bagan alur percobaan pembuatan vaksin subunit BVDV dan imunisasi anak sapi. (B, C) Pengukuran kadar (B) IgA dan (C) sekretori IgA pada sampel usap hidung, feses, dan serum yang dikumpulkan pada hari ke 14 setelah imunisasi sekunder dengan ELISA. n=5, * p < 0.05, dan ** p < 0,01

Gambar 4. Respon imun sel T terhadap BVDV in vivo. Persentase (A) sel T CD4+ IFN- + dan (B) sel T CD8+ IFN- + setelah stimulasi pada sel mononuklear darah tepi sapi. n=5, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, dan ** ** p < 0,0001.

2.5. Imunisasi dengan Vaksin Subunit Rekombinan Meningkatkan Kandungan Sitokin Tipe Th

Untuk memverifikasi efek vaksin subunit rekombinan terhadap respon imun seluler, kami menganalisis tingkat proliferasi limfosit dan sitokin dalam darah tepi anak sapi yang diimunisasi. Pertama, antikoagulan dikumpulkan dari anak sapi 49 hari setelah imunisasi. Limfosit distimulasi oleh BVDV yang diinaktivasi ultraviolet setelah pemisahan, dan indeks berkorelasi diukur. Dibandingkan dengan kelompok PBS, indeks stimulasi limfosit (SI) dari kelompok yang diimunisasi dengan vaksin subunit (E2, E2Fc, dan E2Ft) semuanya meningkat ke derajat yang berbeda, dengan indeks stimulasi limfosit tertinggi (p <0. 001) pada kelompok yang diimunisasi E2Fc dan kelompok vaksin yang tidak aktif (Gambar 5A). Selain itu, kit ELISA sandwich antibodi ganda komersial terhadap IFN-, IL-2, dan IL-4 sapi diterapkan untuk mendeteksi tingkat sitokin tipe Th1- dan Th2-dalam darah. darah tepi anak sapi yang diimunisasi. Dibandingkan dengan pedet yang diberi PBS, kadar IFN- dan IL-2 yang diekspresikan pada pedet yang diimunisasi secara signifikan lebih tinggi dibandingkan IL-4 pada 49 hari pasca imunisasi. Kadar IFN- lebih tinggi pada kelompok IN-E2Fc dibandingkan kelompok vaksin inaktif (p <0,05), namun tidak terdapat perbedaan IL-2 dan IL-4 antara IM-E2Fc dan kelompok vaksin yang dilemahkan (Gambar 5B–D). Hasil ini menunjukkan bahwa vaksin subunit IN-E2Fc secara signifikan meningkatkan respons imun seluler tipe Th1-pada anak sapi.

Gambar 5. Peningkatan kandungan sitokin tipe Th setelah imunisasi dengan vaksin subunit rekombinan. (A) Proliferasi sel limfosit darah tepi anak sapi setelah imunisasi 49 hari terdeteksi dengan alat uji proliferasi limfosit. (B – D) Sitokin Th1 dan Th2 dalam supernatan limfosit dideteksi oleh kit ELISA sandwich antibodi ganda IFN-, IL-2, IL-4 sapi. n=5, * p < {{10}}.05, ** p < 0,01, dan *** p < 0.00

2.6. Antibodi Spesifik BVDV Dapat Diinduksi Kuat oleh Vaksin Subunit Rekombinan E2Ft dan E2Fc Di Vivo

Antibodi spesifik BVDV dideteksi oleh ELISA untuk mengeksplorasi respon imun humoral yang disebabkan oleh vaksin subunit E2, E2Ft, dan E2Fc. Antibodi spesifik BVDV tidak dapat dideteksi pada semua anak sapi sebelum imunisasi. Tingkat antibodi yang diinduksi oleh vaksin subunit E2Ft dan E2Fc secara signifikan lebih tinggi dibandingkan kelompok E2 21 hari setelah inisiasi (dosis pertama) imunisasi (p < 0.00 1). Tingkat antibodi imunitas mukosa pada hari ke 35 (14 hari setelah dosis kedua) dan 49 hari (14 hari setelah dosis ketiga) berbeda secara signifikan antara kelompok E2Ft dan E2 (p <0,05). Selain itu, E2Fc secara signifikan lebih tinggi dari E2 (p <0,001). Tingkat antibodi kelompok imunisasi mukosa (kelompok IN-E2Ft dan IN-E2Fc) lebih tinggi dibandingkan kelompok injeksi intramuskular (kelompok IM-E2Ft dan IM-E2Fc), dan tingkat antibodi pada kelompok vaksin inaktif tidak signifikan. berbeda dari kelompok IN-E2Fc (Gambar 6). Secara keseluruhan, vaksin subunit rekombinan E2Ft dan E2Fc mampu menginduksi respon imun humoral yang kuat, dan imunitas mukosa lebih unggul dibandingkan dengan injeksi intramuskular, yang menunjukkan bahwa vaksin subunit rekombinan E2Fc dan E2Ft sangat antigenik.

Gambar 6. Deteksi antibodi pada sampel serum pedet yang diimunisasi dengan ELISA pada hari 0, 21, 35, dan 49 setelah imunisasi. n=5, * p < 0.05 dan *** p < 0,001

2.7. Menetralkan Antibodi Terhadap BVDV yang Diinduksi oleh Vaksin Subunit Rekombinan Di Vivo

Sampel darah diambil dari vena jugularis anak sapi pada hari 0, 21, 35, dan 49 hari setelah imunisasi pertama. Sampel serum dipisahkan secara aseptik dan diinaktivasi dalam penangas air pada suhu 56 ◦C selama 30 menit. Tes netralisasi dilakukan untuk menentukan tingkat antibodi dalam serum yang dipisahkan. Antibodi penetralisir terhadap BVDV terdeteksi pada kelompok yang diimunisasi mukosa dengan vaksin subunit rekombinan, dengan titer antibodi penetralisir E2Fc hingga 1:64. Hal ini sebanding dengan vaksin yang dilemahkan dan lebih baik daripada vaksin subunit rekombinan E2Ft dan E2Fc yang disuntikkan secara intramuskular (Gambar 7).

Gambar 7. Deteksi antibodi penetralisir pada sampel serum pedet yang diimunisasi pada hari 0, 21, 35, dan 49 setelah imunisasi. Sampel serum yang tidak aktif diencerkan dengan rasio dan diinkubasi sebelumnya dengan 200 TCID50 BVDV XZ02 selama 1 jam. Sampel serum kemudian ditambahkan ke sel di 96-well plate dan diinkubasi selama 72 jam. Antibodi anti-E2 kelinci dan IgG anti-kelinci terkonjugasi FITC digunakan sebagai antibodi primer dan sekunder. n=5, * p < 0,05, dan ** p < 0,01

3. Diskusi

Telah dilaporkan bahwa protein E2 yang diekspresikan dalam sel mamalia lebih efektif dalam menetralisir perlindungan terhadap BVDV dibandingkan protein E2 yang diperoleh dari sistem ekspresi serangga baculovirus (brE2) [27]. Kultur suspensi sel mamalia ditandai dengan proses yang lebih sederhana dan hasil yang lebih tinggi [28]. Sel HEK293 yang tersuspensi mampu tumbuh dalam kondisi bebas serum, dan jumlah selnya beberapa kali lebih besar dibandingkan dengan kultur yang melekat, yang dapat digunakan untuk produksi antibodi skala besar [29]. Efisiensi ekspresi pcDNA3.1 dikombinasikan dengan sistem ekspresi transien sel suspensi eukariotik yang diterapkan dalam penelitian ini relatif tinggi, dan protein rekombinan dapat dikumpulkan enam hari pasca transfeksi, dengan konsentrasi hingga 30 mg·L −1, yang mana sudah cukup untuk aplikasi hewan berikutnya.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Virus diare virus sapi terutama menyerang saluran pernapasan bagian atas dan saluran pencernaan, yang menyebabkan rinorea, batuk, sesak napas, peningkatan suhu tubuh, dan leukopenia, dan diikuti oleh viremia setelah virus memasuki darah. Oleh karena itu, vaksinasi intranasal inhalasi dapat memberikan perlindungan yang lebih efektif dibandingkan vaksin yang diberikan langsung ke tempat infeksi virus. Baru-baru ini, telah ditunjukkan bahwa imunisasi intranasal dapat menghadirkan antigen ke reseptor Fc R dan menimbulkan respon imun mukosa dan sistematik [16]. Selain itu, IgG1Fc sapi mampu berikatan dengan Fc R sapi, sebuah reseptor afinitas tinggi untuk IgG [30]. Hasil kami memberikan bukti bahwa Fc dari IgG1 sapi dapat berikatan dengan Fc RI pada makrofag alveolar sapi (BAM) untuk mencapai transportasi transmukosa. Hal ini dapat memperpanjang umur protein fusi dalam tubuh dan meningkatkan produksi antibodi spesifik. Hasil kami menunjukkan bahwa tingkat SIgA yang diinduksi oleh E2Fc yang diimunisasi mukosa secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan E2 yang diimunisasi mukosa (p <0.{{30}}1). Namun, hanya perbedaan kecil yang diamati antara kelompok E2Fc yang disuntikkan intramuskular dan kelompok E2 yang diimunisasi mukosa. Hal ini mungkin disebabkan oleh fakta bahwa mukosa usus kecil dan kelenjar getah bening mesenterika akan melepaskan sejumlah kecil SIgA sebagai respons terhadap injeksi intramuskular dengan E2Fc yang ditambah dengan 1313VG. Tingkat IFN- yang ditimbulkan oleh imunisasi mukosa dengan E2Fc secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan imunisasi mukosa dengan E2 (p <0,01), imunisasi intramuskular dengan E2Fc, dan imunisasi mukosa dengan E2Ft. Tingkat IL-2 yang dihasilkan oleh imunisasi mukosa dengan E2Fc secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan imunisasi mukosa dengan E2, dan imunisasi intramuskular dengan E2Ft (p <0,01). Pada langkah berikutnya, tingkat antibodi secara keseluruhan terdeteksi setelah imunisasi ketiga. Hasilnya menunjukkan bahwa imunisasi mukosa dengan E2Fc menginduksi tingkat antibodi keseluruhan yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan imunisasi mukosa dengan E2 (p <0,001), sedangkan tingkat antibodi yang diinduksi oleh E2Fc yang disuntikkan secara intramuskular dan E2 yang diimunisasi mukosa sebanding dengan E2Ft yang disuntikkan secara intramuskular. kelompok. Efek kekebalan keseluruhan dari imunisasi mukosa vaksin subunit E2Fc lebih unggul dibandingkan imunisasi intramuskular. Imunisasi mukosa E2Fc tidak hanya menginduksi sekresi SIgA tetapi juga menimbulkan respons imun seluler tipe Th1-spesifik dan respons imun humoral.

Dilaporkan bahwa glikoprotein CSFV E2 yang ditampilkan pada permukaan nanocages feritin menginduksi ekspresi kuat sitokin imun bawaan IL-4 dan IFN- pada kelinci [31]. Vaksin nanopartikel yang dikembangkan dengan mengikat feritin yang dirakit sendiri secara kovalen ke domain pengikat reseptor (RBD) SARS-CoV-2 juga terbukti menghasilkan respons imun humoral dan seluler yang kuat [24]. Rongga hidung kaya akan jaringan limfoid terkait mukosa, dan kami menunjukkan bahwa kadar SIgA yang diinduksi oleh E2Ft yang diimunisasi mukosa lebih tinggi dibandingkan dengan E2 (p <0.05). Sel T CD4+ dan CD8+ secara signifikan lebih tinggi pada kelompok E2Ft yang diimunisasi mukosa dibandingkan pada kelompok E2 (p <0,01). Sel T CD4+ dan CD8+ memainkan peran penting dalam pertahanan terhadap infeksi virus [32]. Hasil uji netralisasi dan uji antibodi juga menunjukkan bahwa imunisasi mukosa dengan E2Ft lebih efektif dibandingkan imunisasi dengan E2Ft dan E2 intramuskular. Hal ini mungkin karena pengenalan antigen dan sistem presentasi organisme secara efektif memfagosit feritin (E2Ft) dengan 24 polimer subunit, menghasilkan respons antibodi yang sensitif dan efektif secara in vivo. Antibodi disekresi oleh sel plasma, dan tingkat antibodi penetral merupakan indikator penting untuk mendeteksi efek kekebalan. Ketika potensi antibodi penetralisir vaksin BVDV lebih besar dari 1:24, hal ini menunjukkan bahwa vaksin tersebut imunogenik [33].

Dalam penelitian ini, uji netralisasi dilakukan untuk mengevaluasi tingkat antibodi penetralisir yang diinduksi oleh protein rekombinan E2. Oleh karena itu, darah vena jugularis anak sapi yang diimunisasi dikumpulkan untuk mendeteksi kadar antibodi IgG dalam serum. Hasil penelitian menunjukkan bahwa seluruh pedet yang diimunisasi menghasilkan antibodi penetralisir yang berbeda-beda pada 14 hari pasca imunisasi kedua. Tingkat antibodi penetralisir pada anak sapi kelompok E2Fc yang diimunisasi mukosa dan kelompok vaksin yang tidak aktif meningkat secara signifikan dan tetap pada 1:64 pada 14 hari setelah imunisasi ketiga (titer antibodi penetral terdeteksi hingga minggu keenam). Namun, perlu dicatat bahwa tingkat antibodi penetralisir kelompok E2 dan E2Ft yang diimunisasi mukosa serta kelompok E2Fc dan E2Ft yang diimunisasi intramuskular dipertahankan antara 1:8 dan 1:16. Kami menyimpulkan bahwa antigen vaksin rekombinan E2Fc dilepaskan secara perlahan oleh reseptor Fc, sehingga menyebabkan respons imun humoral dan seluler yang berkepanjangan. Sebaliknya, empat vaksin subunit lainnya tinggal dalam waktu singkat di dalam tubuh karena kurangnya reseptor yang sesuai. Oleh karena itu, vaksinasi booster atau penggantian bahan pembantu mungkin diperlukan untuk mencapai efek kekebalan yang diharapkan.

manfaat cistanche untuk pria-memperkuat sistem kekebalan tubuh

4. Bahan dan Metode

4.1. Virus dan Sel

Strain tipe 1b BVDV XZ02 (nomor akses GenBank: MF278652) diisolasi dari Tibet dan dikultur menggunakan sel ginjal sapi Madin-Darby (MDBK). Virus diare epidemik babi (PEDV) disimpan di laboratorium kami. Sel MDBK dibeli dari ATCC (ATCC-CCL-22) dan dipelihara di DMEM (Cat NO. SH302403.01, HyClone, Shanghai, China), dan sel makrofag alveolar sapi (BAM) dipelihara di RPMI{ {8}} (Kucing NO. SH30027, Cytiva, Shanghai, Cina); semua media mengandung 10% serum kuda yang dilemahkan dengan panas (Cat NO. 16050122, Gibco, Carlsbad, CA, USA,) dan diinkubasi pada suhu 37 ◦C dalam inkubator yang dilembabkan dengan 5% CO2. Sel HEK293 yang ditangguhkan dibeli dari ATCC (ATCC CRL-1573) dan dikultur dalam media KOP293 bebas serum (Cat NO. M21201121A, KAIRUI -biotech, Zhuhai, China).

4.2. Antibodi dan Alat Uji

Antibodi dan alat tes berikut digunakan dalam penelitian ini: antibodi anti-BVDV E2 (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK); Antibodi anti-tikus kambing HRP (Cat NO. ab205719, Abcam, Cambridge, UK); Cy3-antibodi anti-tikus kambing (Cat NO. AS008, ABclonal, Boston, MA, USA); Antibodi anti-tikus kambing FITC (Cat NO. ab150117, Abcam, Cambridge, UK); Antibodi CD64 (Fc RI) (Cat NO. abs135850, Absin, Shanghai, Cina); Antibodi IgG anti-tikus kambing Alexa Fluor® 488 (Cat NO. ab150113, Abcam, Cambridge, UK); Cy3-antibodi IgG anti-kelinci kambing (Cat NO. ab6939, Abcam, Cambridge, UK); Mikrosfer terkonjugasi FITC (Cat NO. 17155, Polysciences, Warrington, PA, USA); Antibodi FITC-CD4 (Kucing NO. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, CA, USA); Antibodi PE-CD8 (Kucing NO. MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, USA); IFN- antibodi (Kucing NO. MCA1783A, BIORAD, Hercules, CA, USA); Antibodi IgG anti-kelinci FITC-kambing (Kucing NO. AS011, ABclonal, Boston, MA, USA). Kit dan Reagen termasuk Kit deteksi antibodi BVDV-E2 (Cat NO. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., LTD, Shanghai, Cina); Kit deteksi IgA (Cat NO. 177090b, CAMILO, Nanjing, Cina); Kit deteksi SIgA (Cat NO.177053b, CAMILO, Nanjing, Cina); Kit deteksi IFN (Cat NO. 177020b, CAMILO, Nanjing, Cina); Kit deteksi IL-2 (Cat NO. 177028b, CAMILO, Nanjing, Cina); Kit deteksi IL-4 (Cat NO. 1770131b, CAMILO, Nanjing, Cina); Reagen transfeksi TA-293 (Cat NO. R21203107A, bioteknologi KAIRUI, Zhuhai, Cina); Media pemisahan limfosit (Cat NO. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, USA).

4.3. Konstruksi Plasmid

E2 terpotong (selanjutnya dilambangkan sebagai E2) dihasilkan dengan menghilangkan wilayah transmembran E2 (nomor akses urutan gen: MF278652) menggunakan alat web TMHMM (//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ diakses pada 12 Januari 2023) dan menambahkan tag histidin ke terminal-C (Gambar 1A). Urutan gen ditunjukkan pada Bahan Tambahan S1. Plasmid E2Fc dibuat dengan menambahkan fragmen Fc yang berisi daerah engsel IgG1 sapi (nomor tambahan: x62916.1) ke terminal C E2 dengan posisi ordinal daerah engsel peptida fleksibel sintetik E2- -CH2-Domain CH3-6 × Nya [20]. Urutan gen ditunjukkan pada Bahan Tambahan S2. Plasmid E2Ft dibuat dengan menghubungkan E2 ke Helicobacter pylori ferritin (residu 5–167) melalui linker (Gly)3Ser [34]. Urutan gen ditunjukkan pada Bahan Tambahan S3. Peptida sinyal IL-2 ditambahkan ke terminal-N E2, E2Fc, dan E2Ft untuk memfasilitasi ekspresi sekretori [35]. Gen target (E2, E2Ft, dan E2Fc) masing-masing diklon ke pcDNA3.1 dengan BamHI dan XhoI.

4.4. Ekspresi dan Pemurnian Protein

Sekitar 10{{30}} mL sel HEK293 tersuspensi pada tahap eksponensial (kira-kira 2~4 × 106 sel/mL) ditransfeksi dengan plasmid yang sesuai. Secara singkat, 5ml KPM (buffer transfeksi) dan 100 µg DNA plasmid steril ditambahkan ke tabung sentrifugasi steril, dan 5 mL KPM dan 500 µL TA-293 (Kat NO. R21203107A, bioteknologi KAIRUI, Zhuhai, Cina ) reagen transfeksi ditambahkan ke tabung centrifuge steril lainnya. Kemudian, reagen transfeksi encer ditambahkan ke plasmid encer dan diaduk rata. Setelah inkubasi selama 10 menit pada suhu kamar, kompleks reagen transfeksi DNA ditambahkan ke sel, disertai dengan pengocokan. Sel diinkubasi dalam inkubator yang dilembabkan pada suhu 37 ◦C dengan 5% CO2 dengan kecepatan pengocokan 140 rpm/menit. Sel dipanen enam hari pasca transfeksi dengan sentrifugasi selama 30 menit pada 12,000 rpm/menit dan disaring dengan filter 0,22 mm untuk menghilangkan sisa sisa sel. Kolom kromatografi afinitas nikel (Cat NO. 17531801, GE, Boston, MA, USA) digunakan untuk pemurnian afinitas histidin (His) yang diberi tag pada protein E2, E2Ft, dan E2Fc [36]. Secara singkat, 100 mL sampel ditambahkan ke kolom afinitas dengan kecepatan 1 mL/menit. Kolom kemudian dicuci dengan lima volume kolom (CV) buffer A (0,1 M PBS, 300 mM NaCl, 5 mM) dengan kecepatan 1 mL/menit. Akhirnya, gradien konsentrasi imidazol (dari 0 hingga 500 mM) dibiarkan mengalir melalui kolom dengan kecepatan 1 mL/menit untuk mengumpulkan cairan yang sesuai dengan puncak utama. Konsentrasi protein diukur dengan alat deteksi protein BCA. Protein yang dikumpulkan selanjutnya digunakan untuk analisis Western blot.

tanaman cistanche meningkatkan sistem kekebalan tubuh

4.5. noda barat

Protein dipisahkan menggunakan SDS-PAGE. Setelah dipindahkan ke membran filter NC, protein diblokir dengan 2% susu bubuk skim semalaman pada suhu 4 ◦C dan kemudian diinkubasi dengan antibodi anti-BVDV E2 (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK) selama 2 jam pada suhu kamar . Setelah dicuci tiga kali dengan TBS-T, membran diinkubasi dengan antibodi anti-tikus HRP-kambing (Cat NO. ab205719, Abcam, Cambridge, UK) selama 1 jam pada suhu kamar. Setelah dicuci tiga kali dengan TBS-T, sistem chemiluminescence ECL digunakan untuk mendeteksi ekspresi imuno protein.

4.6. Imunofluoresensi tidak langsung

Untuk deteksi imunofluoresensi dari ekspresi imuno protein rekombinan, sel HEK293 ditransfeksi dengan plasmid yang mengekspresikan E2, E2Ft, dan E2Fc; 48 jam setelah transfeksi, sel difiksasi dengan paraformaldehyde selama 15 menit. Setelah dicuci tiga kali dengan PBS, sel diresapi dengan 0.5% Trition-X100 selama 15 menit. Setelah pencucian intensif dengan PBS, sel kemudian diblokir dengan BSA 2% dan diinkubasi dengan antibodi monoklonal BVDV E2 encer 1:500 (disiapkan di laboratorium kami) pada suhu 37 ◦C selama 2 jam. Cy3 (Cat NO. AS008, ABclonal, Boston, MA, USA) atau antibodi anti-tikus kambing terkonjugasi FITC (Cat NO. ab150117, Abcam, Cambridge, UK) diaplikasikan sebagai antibodi sekunder. Inti diwarnai dengan DAPI selama 10 menit pada suhu kamar. Protein divisualisasikan dengan mikroskop confocal (LSM 510, Zeiss, Oberkochen, Jerman) (37).

4.7. Penargetan APC dari Protein Fusi Rekombinan E2Fc

Analisis kolokalisasi imunofluoresensi dilakukan untuk mengkonfirmasi pengikatan protein fusi BVDV-E2Fc ke Fc RI pada makrofag alveolar sapi (BAM). Secara singkat, 3 μg E2, E2Ft, atau E2Fc yang dimurnikan ditambahkan ke makrofag alveolar sapi. Setelah inkubasi selama 12 jam pada suhu 37 ◦C, sel dicuci dengan 0.1% BSA dalam larutan buffer fosfat (PBS) dan difiksasi dengan metanol/aseton (1:1) pada suhu 20 ◦ C. Sel kemudian diresapi dengan 0,5% Trition-X100 selama 15 menit dan diblokir dengan 2% BSA pada suhu 37 ◦C selama 2 jam. Kemudian, sel-sel dicuci tiga kali dengan PBS dan diinkubasi dengan antibodi monoklonal BVDV E2 (sumber tikus; disiapkan di laboratorium kami) dan antibodi poliklonal sapi CD64 (Fc RI) (Cat NO. abs135850, Absin, Shanghai, China) selama 2 H. Sel-sel dicuci tiga kali dengan PBS dan ditutup dengan IgG anti-tikus kambing Alexa Fluor® 488 (Cat NO. ab150113, Abcam, Cambridge, UK) dan antibodi IgG anti-kelinci kambing berlabel Cy3-(Cat NO. ab6939, Abcam, Cambridge, UK) selama 1 jam pada suhu kamar. Inti diwarnai dengan DAPI. Gambar difoto menggunakan kolokalisasi imunofluoresensi (LSM 880, Zeiss, Oberkochen, Jerman).

4.8. Penentuan Laju Fagositosis Makrofag Alveolar Sapi

Untuk mengetahui efek protein rekombinan E2, E2Ft, dan E2Fc terhadap fagositosis makrofag alveolar sapi (BAM), makrofag alveolar sapi pada konsentrasi 1 × 106 sel/mL diinkubasi terlebih dahulu dengan protein rekombinan E2, E2Ft, atau E2Fc (semua konsentrasi disesuaikan hingga 350 ng/mL) selama 4 jam. Setelah dicuci tiga kali dengan PBS, 10 µL mikrosfer terkonjugasi FITC (Cat NO. 17155, Polysciences, Warrington, PA, USA) dan 990 µL media RPMI-1640 ditambahkan ke setiap sumur . Setelah 2 jam inkubasi, sel dicuci dengan PBS untuk menghilangkan mikrosfer terkonjugasi FITC ekstraseluler. Makrofag yang melekat dicerna dengan trypsin (Gibco) yang mengandung 0,05% EDTA, dan pencernaan dihentikan dengan media lengkap 1640 setelah pencernaan penuh. Sel kemudian ditambahkan ke lapisan atas 10 mL PBS dengan 0,45 g glukosa dan 0,3 g BSA, diikuti dengan sentrifugasi gradien pada 400x g selama 10 menit. Sel-sel yang terpisah dicuci dua kali dengan PBS dan diresuspensi dengan 800 μL PBS. Intensitas fluoresensi pada 488 nm ditentukan oleh sitometer aliran Beckman (MoFloAstrios EQ, BECKMAN, Pasadena, CA, USA).

4.9. Persiapan Vaksin dan Prosedur Imunisasi

HEK{{0}}yang menyatakan E2, E2Ft, dan E2Fc diemulsi dengan bahan pembantu IMS 1313VG (Seppic, Prancis) dalam proporsi yang sama dengan konsentrasi protein akhir 200 µg/mL, dan disimpan pada suhu 4 ◦C setelah pengecekan kualitas. Antibodi BVDV-E0 dan BVDV-E2 negatif (Cat NO. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) 3-anak sapi berumur satu bulan (n=35) adalah dibagi menjadi tujuh kelompok sama besar. Anak sapi dalam empat kelompok diimunisasi mukosa hidung (dalam) masing-masing dengan PBS, E2, E2Ft, dan E2Fc. Pedet pada tiga kelompok sisanya disuntik secara intramuskular (im) dengan vaksin inaktif E2Ft, E2Fc, dan BVDV sebagai kontrol positif (Cat NO. 202002003, Huaweit, Jiangsu, China). Pedet divaksin pada hari ke 1, 21, dan 35 percobaan, dan setiap pedet diinokulasi dengan 1 mL vaksin dengan konsentrasi protein 200 µg/mL. Darah dikumpulkan dari anak sapi pada hari ke 1, 21, 35, dan 49 percobaan untuk indeks lainnya (Gambar 3A). Semua protokol eksperimental telah disetujui oleh Komite Etika Penelitian dari Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Pertanian Huazhong, Hubei, Tiongkok (No. HZAUCA-2022-0011).

4.10. Produksi IgA dalam Feses dan Serum

Sampel usap hidung, feses, dan serum pedet dikumpulkan pada hari ke 14 setelah imunisasi sekunder. Kotoran sapi segar diencerkan menjadi suspensi tinja 15% dengan PBS, suspensi disentrifugasi pada suhu 18,000× g pada suhu 4 ◦C selama 30 menit, dan supernatan dikumpulkan untuk digunakan nanti. Usap hidung dikumpulkan dengan memutar kapas steril jauh ke dalam rongga hidung sapi selama 6-8 putaran. Swab dimasukkan ke dalam tabung PBS yang mengandung 1% penisilin-streptomisin dan dicampur secara ekstensif. Sampel disentrifugasi pada suhu 18,000× g pada suhu 4 ◦C selama 10 menit, dan supernatan dikumpulkan untuk digunakan nanti. Sampel darah sapi dikumpulkan dengan asam etilendiamintetraasetat (EDTA)--yang mengandung tabung antikoagulan, dan sampel serum diperoleh dengan menyentrifugasi sampel darah pada suhu 4 ◦C dan 400 g selama 5 menit. IgA (Cat NO. 177090b, CAMILO, Nanjing, China) dan SIgA dideteksi dengan kit ELISA (Cat NO.177053b CAMILO, Nanjing, China) sesuai dengan instruksi pabrik.

4.11. Analisis Aliran Sitometri

Frekuensi IFN- -yang memproduksi sel T CD3+ CD4+ dan CD3+ CD8+ di antara limfosit CD3+ dalam darah adalah dianalisis menggunakan flow cytometry. Sampel dikumpulkan 14 hari setelah imunisasi booster [36]. Sel mononuklear darah tepi (PBMC) diresuspensi dan diencerkan menjadi 1 × 106 sel/mL dengan media RPMI-1640 lengkap, distimulasi dengan BVDV XZ02 yang dilemahkan UV (MOI=0.1), dan diinkubasi pada suhu 37 ◦C dengan 5% CO2 selama 72 jam. Concanavalin A (Con A) (5 µg/mL; Sigma) digunakan sebagai kontrol positif. Inhibitor transpor protein brefeldin A (BFA, 3 µg/mL, eBioscience) ditambahkan ke semua sampel 12 jam sebelum pengambilan sel untuk memblokir sekresi IFN-. Sejumlah 200 μL sel dipindahkan ke tabung FCM dan diwarnai dengan antibodi CD4 berlabel FITC (Cat NO. MCA1653, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) selama 30 menit pada suhu 4 ◦C dalam gelap. Setelah dicuci tiga kali dengan PBS, sel diinkubasi dengan antibodi CD8 berlabel R-PE (Cat NO. MCA837, BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Setelah dicuci tiga kali, sel diinkubasi dengan antibodi IFN-anti-bovine tikus (Cat NO. MCA1783A, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) selama 20 menit dalam gelap untuk pewarnaan sitokin intraseluler. Setelah dicuci, sel diresuspensi dalam PBS yang mengandung 1% FBS. Flow cytometry dilakukan dengan flow cytometer FACS Calibre (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), dan data dikumpulkan dan dianalisis seperti yang dijelaskan sebelumnya (38).

4.12. Proliferasi Limfosit dan Deteksi Sitokin

Sel mononuklear darah tepi antikoagulan (PBMC) dari setiap anak sapi diisolasi menggunakan media pemisahan limfosit (Cat NO. RNBJ9540, SIGMA, Saint Louis, MO, USA) pada hari ke 49 setelah imunisasi. Limfosit darah tepi sapi diencerkan dengan media 10% FBS 1640 menjadi 1 × 106 sel/mL. Kemudian, 100 μL sel yang diencerkan ditambahkan ke masing-masing sumur pada pelat sumur 96-dan distimulasi masing-masing dengan BVDV yang dilemahkan UV, concanavalin (kontrol positif), atau media kultur (kontrol negatif). Setelah 72 jam inkubasi pada suhu 37 ◦C dengan 5% CO2, 30 µL MTS ditambahkan ke setiap sumur, dan sel terus dikultur pada suhu 37 ◦C selama 1 jam sesuai dengan instruksi pabrik. Absorbansi pada 492 nm diukur dengan penganalisis pelat mikro otomatis. Titer proliferasi limfosit setiap sampel ditentukan dengan indeks stimulasi (SI). SI yang dihitung=(OD sampel-OD kontrol kosong)/(OD sampel-OD negatif kontrol kosong) [39]. Interferon (IFN)- , interleukin (IL)-2, dan interleukin (IL)-4 dideteksi menggunakan kit ELISA. Secara singkat, PBMC diisolasi dan diencerkan hingga 4 × 106 sel/mL dengan media RPMI 1640 yang mengandung 10% FBS dan ditempatkan di 24-piring kultur jaringan sumur. Sel distimulasi dengan BVDV XZ02 (MOI=1) yang dinonaktifkan selama 48 jam pada suhu 37 ◦C, dan supernatan kemudian dikumpulkan. IFN- (Cat NO. 177020b, CAMILO, Nanjing, China), IL-2 (Cat NO. 177028b, CAMILO, Nanjing, China), dan IL-4 (Cat NO. 1770131b, CAMILO, Tingkat Nanjing, Tiongkok) dideteksi menggunakan kit ELISA yang sesuai sesuai dengan instruksi pabrik. Kandungan IFN-, IL-2, dan IL-4 dalam sampel dihitung menggunakan kurva standar.

4.13. Tes Serologis

Untuk mendeteksi antibodi E2/E0, sampel darah dikumpulkan dari setiap anak sapi pada hari 0, 21, 35, dan 49 setelah imunisasi. Sampel serum dikumpulkan dengan mensentrifugasi sampel darah pada 1000x g selama 20 menit. Sampel serum diproses sesuai dengan persyaratan kit deteksi antibodi BVDV E2 (Cat NO. SU-AN78401, Win-win Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China). Pelat mikro yang dilapisi dengan antigen BVBV E2 diseimbangkan selama 20 menit pada suhu kamar. Kemudian, masing-masing 50 μL kontrol negatif, kontrol positif, dan sampel serum ditambahkan ke dalam lempeng mikro. Sejumlah 50 μL antibodi pendeteksi berlabel horseradish peroxidase (HRP) kemudian ditambahkan ke lempeng mikro dan diinkubasi pada suhu 37 ◦C selama 60 menit. Setelah dicuci sebanyak lima kali dengan buffer pencuci, ditambahkan larutan kromogenik untuk mengukur serapan microplate reader pada 450 nm untuk mengetahui kadar antibodi E2 pada masing-masing kelompok imunisasi. Metode serum pengenceran virus tetap digunakan untuk mendeteksi tingkat antibodi penetral sampel serum. Secara singkat, sampel serum imun yang sepenuhnya tidak aktif diencerkan dengan 2−1 hingga 2−12, dan 50 μL serum pada setiap titer pengenceran ditambahkan ke 96-well plate. Selanjutnya, 50 µL larutan virus encer yang mengandung 200 TCID50- BVDV XZ02 ditambahkan ke setiap sumur. Piring dikocok perlahan dan dicampur. Setelah 1 jam inkubasi pada suhu 37 ◦C, sel MDBK dengan konsentrasi 5 × 105 sel/mL ditambahkan ke pelat sumur dan diinkubasi pada suhu 37 ◦C dalam inkubator yang dilembabkan dengan 5% CO2 selama 72 jam. Untuk mendeteksi efek penetralan sampel serum, sel diberi antibodi spesifik E2-sebagai antibodi primer (Cat NO. orb312169, Biorbyt, Cambridge, UK) dan IgG anti-kelinci kambing terkonjugasi FITC sebagai antibodi sekunder. antibodi, (Kucing NO. AS011, ABclonal, Boston, MA, USA). Sinyal fluoresen hijau yang khas menunjukkan tidak adanya netralisasi. Foto diambil di bawah mikroskop fluoresensi (TE2000, Nikon, Tokyo, Jepang). Titer netralisasi serum dihitung berdasarkan metode Reed-Muench dan pengenceran serum maksimum yang dapat menghambat fluoresensi sepenuhnya ditentukan sebagai titer netralisasi serum.

4.14. Deteksi Spesifisitas Antibodi Monoklonal BVDV E2

Uji pra-penyerapan antibodi monoklonal BVDV E2 pertama kali dilakukan, diikuti dengan uji replikasi virus dan Western blot untuk membuktikan spesifisitas mAb BVDV E2. Untuk uji replikasi virus, 400 TCID50 BVDV dipra-inkubasi dengan PBS dan 100 µg atau 200 µg E2 mAb pada suhu 37 ◦C selama 1 jam. Setelah inkubasi, BVDV yang telah diberi perlakuan sebelumnya diinokulasi ke sel MDBK, dan sel dikultur pada suhu 37 ◦C dalam inkubator yang dilembabkan. Sel dikumpulkan pada 18 atau 24 hpi (jam pasca infeksi) dan RNA diekstraksi dengan reagen TRIZOL. RT-qPCR dilakukan untuk mengetahui ekspresi relatif gen BVDV E2. Untuk uji Western blot, E2 mAb telah diinkubasi sebelumnya dengan Tween20, protein PEDV S, atau protein BVDV E2 dalam TBS-T masing-masing selama 2 jam pada suhu 4 ◦C. E2 mAb yang telah diberi perlakuan sebelumnya dilakukan uji Western blot sebagai antibodi utama untuk mendeteksi reaksi terhadap protein BVDV E2 atau PEDV S.

4.15. Analisis statistik

Program statistik GraphPad Prism digunakan untuk semua analisis. Uji-t dua sisi tidak berpasangan digunakan untuk menganalisis data dan menghasilkan nilai p (*, p < 0.05; **, p < 0.{{ 8}}1; ***, p < 0,001, **** p < 0,0001). Kecuali dinyatakan lain, data ditampilkan sebagai rata-rata ± SD.

5. Kesimpulan

Dalam penelitian kami, tiga protein rekombinan, BVDV-E2, BVDV-E2Ft, dan BVDV-E2Fc, diekspresikan, dan vaksin subunit yang sesuai dihasilkan. Uji in vivo menunjukkan bahwa vaksin subunit E2Fc lebih efektif dibandingkan E2Ft dan E2, baik pada imunisasi mukosa maupun intramuskular. Kami mengkonfirmasi bahwa titer antibodi penetral yang diinduksi oleh E2Fc dan E2Ft yang diimunisasi mukosa masing-masing adalah 1:64 dan 1:16, yang selanjutnya menunjukkan bahwa E2Fc berikatan dengan Fc RI pada makrofag alveolar sapi untuk mencapai transportasi transmukosa. Vaksinasi mukosa dari vaksin subunit E2Fc multivalen dari strain epidemi utama BVDV secara signifikan meningkatkan efek kekebalan tubuh, dan cocok untuk penggunaan praktis. Penelitian kami memberikan solusi terhadap vaksinasi konvensional yang memakan waktu dan tenaga dengan menggunakan vaksin mukosa. Protein BVDV E2 adalah target ideal untuk menetralkan antibodi, dan protein fusi E2Fc dan E2Ft yang dibuat dalam penelitian ini diharapkan dapat diterapkan lebih lanjut sebagai vaksin subunit yang aman dan efektif melawan infeksi BVDV.

Referensi

1. Truyer, IG; Mellor, DJ; Norquay, R.; Gunn, GJ; Ellis, KA Program pemberantasan virus diare bovine di Orkney 2001 hingga 2008. Vet. Rek. 2010, 167, 566–570. [Referensi Silang]

2. Peterhans, E.; Schweizer, M. BVDV: Sebuah pestivirus menginduksi toleransi respon imun bawaan. Biologi 2013, 41, 39–51. [Referensi Silang]

3. Zhong, F.; Li, N.; Huang, X.; Guo, Y.; Chen, H.; Wang, X.; Shi, C.; Zhang, X. Pengetikan genetik dan observasi epidemiologi virus diare virus sapi di Tiongkok Barat. Gen Virus 2011, 42, 204–207. [Referensi Silang]

4. Deng, Y.; Shan, TL; Tong, W.; Zheng, XC; Guo, YY; Zheng, H.; Cao, SJ; Wen, XT; Tong, GZ Karakterisasi genom virus diare sapi 1 isolat dari babi. Lengkungan. virus. 2014, 159, 2513–2517. [Ref Silang] [PubMed]

5. Deng, Y.; Matahari, CQ; Cao, SJ; Lin, T.; Yuan, SS; Zhang, HB; Zhai, SL; Huang, L.; Shan, TL; Zheng, H.; dkk. Prevalensi tinggi virus diare virus sapi 1 pada ternak babi Cina. Dokter hewan. Mikrobiol. 2012, 159, 490–493. [Ref Silang] [PubMed]

6. Wang, L.; Wu, X.; Wang, C.; Lagu, C.; Bao, J.; Du, J. Asal dan penularan virus diare virus sapi tipe 1 di Tiongkok diungkapkan melalui analisis filodinamik. Res. Dokter hewan. Sains. 2020, 128, 162–169. [Ref Silang] [PubMed]

7. Tautz, N.; Tews, BA; Meyers, G. Biologi Molekuler Pestivirus. Adv. Res Virus. 2015, 93, 47–160.

8. Becher, P.; Tautz, N. Rekombinasi RNA pada pestivirus: Urutan RNA seluler dalam genom virus menyoroti peran faktor inang terhadap persistensi virus dan penyakit mematikan. RNA Biologi. 2011, 8, 216–224. [Referensi Silang]

9. Li, Y.; Wang, J.; Kanai, R.; Modis, Y. Struktur kristal glikoprotein E2 dari virus diare virus sapi. Proses. Natal. Akademik. Sains. AS 2013, 110, 6805–6810. [Referensi Silang]

10. Williams, LBA; Goreng, LM; Herndon, DR; Franceschi, V.; Schneider, DA; Donofrio, G.; Knowles, DP Vaksin vektor virus herpes sapi rekombinan-4 yang diberikan melalui nebulisasi intranasal menghasilkan titer antibodi penawar virus pada sapi. PLoS SATU 2019, 14, e0215605. [Referensi Silang]

11. Ainai, A.; van Riet, E.; Ito, R.; Ikeda, K.; Senchi, K.; Suzuki, T.; Tamura, SI; Asanuma, H.; Odagiri, T.; Tashiro, M.; dkk. Respon imun manusia yang ditimbulkan oleh vaksin influenza H5 yang dilemahkan secara intranasal. Mikrobiol. imunol. 2020, 64, 313–325. [Ref Silang] [PubMed]

12. Kang, H.; Yan, M.; Yu, Q.; Yang, Q. Karakteristik jaringan limfoid terkait hidung (NALT) dan kapasitas penyerapan hidung pada ayam. PLoS SATU 2013, 8, e84097. [Ref Silang] [PubMed]

13. Kamu, L.; Zeng, R.; Bai, Y.; Roopenian, DC; Zhu, X. Vaksinasi mukosa yang efisien dimediasi oleh reseptor Fc neonatal. Nat. Bioteknologi. 2011, 29, 158–163. [Ref Silang] [PubMed]

14. Pabst, R. Vaksinasi mukosa dengan jalur intranasal. Jaringan limfoid terkait hidung (NALT) -Struktur, fungsi, dan perbedaan spesies. Vaksin 2015, 33, 4406–4413. [Referensi Silang]

15. Zhang, Y.; Zhou, Z.; Zhu, SL; Zu, X.; Wang, Z.; Zhang, LK; Wang, W.; Xiao, G. Vaksin protein fusi RSV F-Fc yang baru mengurangi cedera paru-paru yang disebabkan oleh infeksi virus pernapasan syncytial. Antivirus. Res. 2019, 165, 11–22. [Referensi Silang]

16. Wiedinger, K.; McCauley, J.; Bitsaktsis, C. Hasil spesifik isotipe dalam penargetan reseptor gamma Fc PspA menggunakan protein fusi sebagai strategi vaksinasi terhadap infeksi Streptococcus pneumoniae. Vaksin 2020, 38, 5634–5646. [Referensi Silang]

17. Czajkowsky, DM; Hu, J.; Shao, Z.; Tolong, protein fusi RJ Fc: Perkembangan baru dan perspektif masa depan. EMBO Mol. medis. 2012, 4, 1015–1028. [Referensi Silang]

18. Chen, X.; Zeng, F.; Huang, T.; Cheng, L.; Liu, H.; Gong, R. Optimasi Fc untuk Peningkatan Stabilitas dan Ketahanan Agregasi. Saat ini. farmasi. Bioteknologi. 2016, 17, 1353–1359. [Referensi Silang]

19. Loureiro, S.; Ren, J.; Phapugrangkul, P.; Colaco, California; Bailey, CR; Shelton, H.; Molesti, E.; Temperton, NJ; Barclay, WS; Jones, IM Imunisasi bebas adjuvan dengan protein fusi hemagglutinin-Fc sebagai pendekatan terhadap vaksin influenza. J.Virol. 2011, 85, 3010–3014. [Referensi Silang]

20. Li, J.; Li, X.; Bu, H.; Ren, X.; Hao, G.; Zhang, H.; Zhao, Z.; Fang, K.; Li, X.; Rong, Z.; dkk. Vaksinasi mukosa yang efisien terhadap virus demam babi klasik baru, protein fusi E2-Fc yang dimediasi oleh reseptor Fc neonatal. Vaksin 2020, 38, 4574–4583. [Referensi Silang]

21.Zhen, Z.; Tang, W.; Todd, T.; Xie, J. Ferritins sebagai platform nano untuk pencitraan dan pemberian obat. Pendapat Ahli. Pengiriman Obat. 2014, 11, 1913–1922. [Ref Silang] [PubMed]

22. Lopez-Sagaseta, J.; Malito, E.; Rappuoli, R.; Bottomley, MJ Merakit sendiri nanopartikel protein dalam desain vaksin. Hitung. Struktur. Bioteknologi. J.2016, 14, 58–68. [Ref Silang] [PubMed]

23. Yakub, SI; Khogeer, B.; Bampos, N.; Sheppard, T.; Schwartz, R.; Lowe, CR Pengembangan dan Penerapan Ligan Afinitas Sintetis untuk Pemurnian Antigen Influenza Berbasis Ferritin. Kimia Biokonjugasi. 2017, 28, 1931–1943. [Ref Silang] [PubMed]

24. Bu, X.; Zou, F.; Yu, F.; Li, R.; Yuan, Y.; Zhang, Y.; Zhang, X.; Deng, J.; Chen, T.; Lagu, Z.; dkk. Vaksin Nanopartikel Berdasarkan Receptor Binding Domain (RBD) dan Heptad Repeat (HR) dari SARS-CoV-2 Menghasilkan Respons Kekebalan Protektif yang Kuat. Imunitas 2020, 53, 1315–1330.e1319. [Ref Silang] [PubMed]

25. Benediktus, L.; Bell, CR Risiko penggunaan lini sel alogenik untuk produksi vaksin: Contoh Bovine Neonatal Pancytopenia. Ahli Rev. Vaksin 2017, 16, 65–71. [Referensi Silang]

26. Pecora, A.; Aguirreburualde, MS; Aguirreburualde, A.; Leunda, Bpk; Odeon, A.; Chiavenna, S.; Bochoeyer, D.; Spitteler, M.; Filipi, JL; Dus Santos, MJ; dkk. Keamanan dan kemanjuran vaksin subunit glikoprotein E2 yang diproduksi di sel mamalia untuk mencegah infeksi eksperimental virus diare virus sapi pada sapi. Dokter hewan. Res. Komunitas. 2012, 36, 157–164. [Referensi Silang]

27. Thomas, C.; Muda, NJ; Heaney, J.; Collins, SAYA; Brownlie, J. Evaluasi kemanjuran mamalia dan baculovirus menyatakan kandidat vaksin subunit E2 terhadap virus diare virus sapi. Vaksin 2009, 27, 2387–2393. [Referensi Silang]

28. Arena, TA; Bahaya, PD; Wong, AW Transfeksi Throughput Tinggi Sel HEK293 untuk Produksi Protein Sementara. Metode Mol. biologi. 2018, 1850, 179–187.

29. Venereo-Sanchez, A.; Gilbert, R.; Simoneau, M.; Caron, A.; Chahal, P.; Chen, W.; Ansorge, S.; Li, X.; Henry, O.; Kamen, A. Hemagglutinin dan neuraminidase yang mengandung partikel mirip virus yang diproduksi dalam kultur suspensi HEK-293: Kandidat vaksin influenza yang efektif. Vaksin 2016, 34, 3371–3380. [Referensi Silang]

30. Yan, Y.; Li, X.; Wang, A.; Zhang, G. Kloning molekul dan identifikasi cDNA full-length yang mengkode reseptor Fc afinitas tinggi untuk bovine IgG (Fc gamma RI). Dokter hewan. imunol. Imunopatol. 2000, 75, 151–159. [Referensi Silang]

31. Zhao, Z.; Chen, X.; Chen, Y.; Li, H.; Fang, K.; Chen, H.; Li, X.; Qian, P. Platform nano Ferritin yang Dirakit Sendiri untuk Merancang Vaksin Demam Babi Klasik: Memunculkan Antibodi Penetral yang Ampuh. Vaksin 2021, 9, 45. [CrossRef] [PubMed]

32.Hsieh, MS; Hsu, CW; Anda, LL; Chai, KM; Yu, LL; Wu, CC; Chen, SAYA; Chiang, CY; Liu, SJ; Liao, CL; dkk. Vaksinasi Intranasal Dengan Protein Fusi Antigen-FLIPr Rekombinan Saja Menginduksi Respons Antibodi Sistemik yang Tahan Lama dan Respons Sel T yang Luas. Depan. imunol. 2021, 12, 751883. [CrossRef] [PubMed]

33. Bellido, D.; Baztarrica, J.; Rocha, L.; Pecora, A.; Acosta, M.; Escribano, JM; Parreno, V.; Wigdorovitz, A. Vaksin subunit BVDV bertarget MHC-II baru menginduksi respons imunologi yang menetralkan pada kelinci percobaan dan sapi. Lintas batas. Muncul. Dis. 2021, 68, 3474–3481. [Ref Silang] [PubMed]

34. Bu, H.; Li, X.; Li, J.; Zhao, Z.; Zhang, H.; Hao, G.; Chen, H.; Qian, P. Imunisasi dengan perpaduan rekombinan virus sindrom reproduksi dan pernapasan babi yang dimodifikasi GP5 dan feritin menghasilkan peningkatan kekebalan protektif pada babi. Virologi 2021, 552, 112–120. [Ref Silang] [PubMed]

35. Nyon, MP; Du, L.; Tseng, CK; Seid, CA; Pollet, J.; Naceanceno, KS; Agrawal, A.; Algaissi, A.; Peng, BH; Tai, W.; dkk. Merekayasa garis sel CHO yang stabil untuk ekspresi antigen vaksin virus corona MERS. Vaksin 2018, 36, 1853–1862. [Referensi Silang]

36. Bellini, M.; Riva, B.; Tinelli, V.; Rizzuto, MA; Salvioni, L.; Kolombo, M.; Mingozzi, F.; Visioli, A.; Marongiu, L.; Frascotti, G.; dkk. Nanopartikel Ferritin yang Direkayasa untuk Pelacakan Bioluminesensi Pengiriman Obat Nano pada Kanker. Kecil 2020, 16, e2001450. [Referensi Silang]

37. Zhang, H.; Li, X.; Peng, G.; Tang, C.; Zhu, S.; Qian, S.; Xu, J.; Qian, P. Glikoprotein E2 dari virus demam babi klasik yang diekspresikan oleh baculovirus menginduksi respon imun protektif pada kelinci. Vaksin 2014, 32, 6607–6613. [Referensi Silang]

38. Yuan, L.; Wen, K.; Azevedo, MS; Gonzalez, SAYA; Zhang, W.; Saif, LJ Respon sel T penghasil IFN-gamma usus spesifik virus yang diinduksi oleh infeksi rotavirus pada manusia dan vaksin berkorelasi dengan perlindungan terhadap diare rotavirus pada babi gnotobiotik. Vaksin 2008, 26, 3322–3331. [Referensi Silang]

39. Wang, YP; Liu, D.; Guo, LJ; Tang, QH; Wei, YW; Wu, HL; Liu, JB; Li, SB; Huang, LP; Liu, CM Peningkatan respon imun protektif terhadap vaksin subunit PCV2 dengan pemberian bersama IFN-gamma babi rekombinan pada tikus. Vaksin 2013, 31, 833–838. [Referensi Silang]