Pengaruh Ekstrak Cistanches Deserticola Terhadap Cedera RTEC Kelinci Oleh H2O2

Abstrak: Sel epitel tubulus ginjal kelinci dikultur secara in vitro untuk mempelajari efek H2O2 pada proliferasi sel dan ekstrak Cistanche deserticola pada sel epitel tubulus yang dilukai oleh H2O2 ． Morfologi sel digunakan untuk mengamati pengaruh H2O2 terhadap proliferasi sel epitel tubulus ginjal kelinci dengan metode MTT dan efek perlindungan 2,20 dan 200 mg·L － 1 C． ekstrak air deserticola dan ekstrak alkohol dipelajari oleh pelepasan LDH. Hasil penelitian menunjukkan bahwa jumlah perubahan morfologi sel secara bertahap semakin meningkat. Jumlah sel yang menempel secara bertahap dikurangi． Laju penghambatan proliferasi sel dan pelepasan LDH meningkat seiring dengan peningkatan konsentrasi H2O2 ． C．dosis tinggi ekstrak deserticola dapat secara signifikan mengurangi efek penghambatan proliferasi ＲTECs oleh H2O2 ( P ＜ 0． 01) ． Ekstraksi air dan ekstrak alkohol C． deserticola dapat secara signifikan menurunkan pelepasan LDH( P ＜ 0． 01) ． H2O2 memiliki beberapa efek pada reaksi proliferasi ＲTEC kelinci, sedangkan C． ekstrak deserticola memiliki efek perlindungan pada cedera ＲTECs oleh H2O2 ．

Kata kunci: Cistanches deserticola; sel epitel tubulus ginjal; kata pengantar kerusakan sel

Cistanche deserticola, juga dikenal sebagai ginseng gurun adalah batang mesofil kering, bersisik, dari Cistanche deserticola YC Ma atau Cistanche tubulosa (Schenk) Wish dalam keluarga Orobaceae. Ini memiliki efek mengencangkan ginjal yang, bermanfaat bagi esensi dan darah, melembabkan usus, dan menghilangkan sembelit. Secara tradisional digunakan untuk defisiensi Yang Ginjal, defisiensi esensi dan darah, impotensi dan infertilitas, nyeri pinggang dan lutut, kelemahan otot dan tulang, dan kekeringan usus dan sembelit, itu adalah obat yang mengencangkan ginjal yang paling sering digunakan dalam sejarah. 

Cistanche deserticola

H2O2, sebagai bentuk spesies oksigen reaktif, memiliki efek yang kuat dalam menginduksi peroksidasi lipid dan dapat bereaksi dengan hampir semua komponen seluler, menyebabkan peroksidasi lipid berantai, dan menyebabkan apoptosis dan disfungsi sel [2,3]. Eksperimen ini terutama menyelidiki efek ekstrak Cistanche deserticola pada penghambatan proliferasi yang diinduksi H2O2-dan cedera sel epitel tubulus ginjal kelinci dan sebelumnya mengeksplorasi efek perlindungannya pada sel epitel tubulus ginjal.

1 Bahan dan Metode

1.1 Obat percobaan

Cistanche deserticola ma dibeli dari Sichuan Chuannan Pharmaceutical Co., Ltd. (nomor batch 151201).

cistanche hidup gurun

1.2 Hewan

Kelinci putih Selandia Baru, jantan, berumur 20 hari, dibeli dari pangkalan percobaan Institut Penelitian Ternak Guizhou, dengan nomor lisensi hewan SCXK (Guizhou) 2012-001.

1.3 Reagen

DMEM/F-12 (1:1), Gbico Corporation; Serum sapi janin, Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd; Dimetil sulfoksida (DMSO), Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd; H2O2, Sichuan Jinshan Pharmaceutical Co., Ltd; Tripsin, Perusahaan Amresco; Biru tiazol (MTT), Genview; Kit pengujian sitotoksisitas nonradioaktif, Promega Corporation; Etanol anhidrat, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.

1.4 Instrumen

Inkubator CO2, Tipe 3111, Thermo Fisher Scientific; Penanda enzim, tipe 1510, Thermo Fisher Scientific; Meja kerja yang sangat bersih, SW-CJ-1FD, Suzhou Purification Equipment Co., Ltd; Mikroskop fluoresensi terbalik, Ningbo Shunyu; Rotating evaporator, RE-52AA, Pabrik Instrumen Biokimia Shanghai Yarong; Pengering beku, LGJ-12, Beijing Songyuan Huaxing Technology Development Co., Ltd.

1.5 Metode

1. 5.1 Pembuatan ekstrak Cistanche deserticola

Ambil ramuan obat Cistanche deserticola kering dan haluskan menjadi potongan-potongan kecil. Timbang secara akurat 100 g setiap bubuk dan tambahkan 10 kali jumlah air suling dan etanol 75 persen ke panas dan refluks untuk ekstraksi 3 kali. Yang pertama adalah 3 jam, dan yang kedua adalah 1 5 jam, yang ketiga selama 1 jam, menggabungkan 3 filtrat, mengurangi tekanan dan berkonsentrasi pada ekstrak, menghitung hasil ekstrak sebagai 22 30 persen , ekstrak etanol 21 70 persen , sisa alkohol yang mudah menguap, mekanisme pengeringan beku untuk mendapatkan ekstrak air dan alkohol dari Cistanche deserticola, disegel, dikeringkan, dan disimpan di tempat gelap untuk penggunaan di masa mendatang.

1. 5. 2 Kultur Sel

Bangun model sel epitel tubulus ginjal menggunakan metode yang dijelaskan oleh Zhao Dan et al. [4], isolasi dan biakan sel epitel tubulus ginjal primer dari 20-kelinci umur sehari, dan tunggu hingga sel tumbuh hingga lebih dari 90 persen cawan biakan, lalu cerna dengan tripsin. Menggunakan media biakan lengkap DMEM/F-12 yang mengandung 1 persen serum janin sapi dengan laju 1 dua × 104 sel diinokulasi pada pelat 96 sumur dan dikultur pada suhu 37 derajat dan 5 persen CO2.

1. 5. 3 Pembentukan model cedera sel epitel tubulus ginjal kelinci yang diinduksi oleh 3 H2O2

Lihat 1 5. 2 Inokulasi sel, dan setelah 48 jam biakan sel stabil, gunakan H2O2 untuk kerusakan. Siapkan kelompok eksperimen dan kelompok kontrol kosong, dengan 4 pengulangan di setiap kelompok, ulangi tiga kali. Kelompok eksperimen: Ganti media kultur lengkap dengan konsentrasi H2O2 yang berbeda, dengan konsentrasi H2O2 masing-masing 550, 500, 450, 400, dan 350 μ Mol · L-1, blanko kelompok kontrol: Ganti media kultur lengkap, terus berkultivasi selama 24 jam pada kondisi 37 derajat dan 5 persen CO2, melakukan pemeriksaan mikroskopis, dan mengumpulkan gambar. Metode MTT [5] digunakan untuk mengukur proliferasi sel setelah aksi H2O2, dan nilai absorbansi (nilai OD) diukur pada 490 nm. Menggunakan kit deteksi sitotoksisitas nonradioaktif untuk menentukan perubahan pelepasan LDH sel setelah pengobatan H2O2, pelepasan LDH ( persen )=jumlah LDH supernatan/(jumlah LDH supernatan ditambah jumlah LDH lisat) × 100 persen . Pewarnaan fluoresensi AO/EB [6]: Ambil masing-masing 100 μ G/mL larutan AO dan 100 μ 100 g/mL larutan EB masing-masing μ L. Campur rata dan tambahkan 10 ke setiap sumur μ L. Segera tempatkan pada kontras fase terbalik mikroskop fluoresensi untuk pengamatan, pertahankan bidang pandang pengamatan tidak berubah dalam 5 menit, dan kumpulkan gambar di bawah cahaya biru masing-masing pada 450 ± 10 nm dan lampu hijau pada 532 ± 10 nm. Gunakan sistem pengumpulan fluoresensi untuk sintesis fluoresensi untuk mendapatkan gambar pewarnaan fluoresensi.

1. 5. 4 Pengaruh 4 bubuk ekstrak Cistanche pada H2O2-kerusakan yang diinduksi pada sel epitel tubulus ginjal kelinci

bubuk cistanche

Klik di sini untuk melihat Cistanche untuk produk penyakit Ginjal

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

Menurut 1 5. 2 Inokulasi sel, dan setelah 24 jam biakan sel stabil, tambahkan 200 ul media biakan lengkap yang mengandung ekstrak Cistanche deserticola ke masing-masing lubang untuk melindungi sel selama 24 jam. Siapkan grup eksperimen, grup model, dan grup kontrol kosong, dengan tiga pengulangan per grup. Kelompok eksperimen dan kelompok model: ganti dengan 400 μ Media biakan lengkap dengan mol · L-1 H2O2; Grup kontrol kosong: media kultur lengkap. Terus berkultivasi selama 24 jam. Proliferasi sel diukur menggunakan metode MTT, dan perubahan pelepasan LDH sel diukur menggunakan kit uji sitotoksisitas nonradioaktif.

1.6 Pemrosesan statistik

Hasil data dinyatakan dalam x ± s menggunakan SPSS 19 0 perangkat lunak statistik digunakan untuk analisis statistik. Analisis varian faktor tunggal digunakan untuk perbandingan antar kelompok, dan metode LSD digunakan untuk perbandingan berganda antar kelompok, dengan P<0 05 indicating statistical significance.

2 Hasil dan Analisis

2.1 Perubahan morfologis sel epitel tubulus ginjal kelinci yang diinduksi oleh H2O2

Setelah sel epitel tubulus ginjal kelinci diperlakukan dengan konsentrasi H2O2 yang berbeda selama 24 jam, morfologi sel epitel tubulus ginjal kelinci diamati di bawah mikroskop, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1. Dengan peningkatan konsentrasi H2O2, jumlah sel dengan perubahan morfologi yang berangsur-angsur meningkat, jumlah sel yang melekat pada sel parietal berangsur-angsur berkurang, beberapa sel menjadi lebih panjang, kilap sel berkurang, dan ukurannya mengecil. Konsentrasi H2O2 mencapai 550 μ Mol · L-1, akson menghilang, membran sel pecah, penyusutan sel, celah sel bertambah, dan muncul celah di antara bercak sel.

Gambar 1 Pengaruh konsentrasi H2O2 terhadap morfologi kelinciRTEC (100 ×)

2.2 Pengaruh 2.2 H2O2 terhadap proliferasi sel epitel tubulus ginjal kelinci

Gunakan masing-masing 350, 400, 450, 500, dan 550 μ Mol · L-1 H2O2 yang diberi perlakuan sel epitel tubulus ginjal kelinci selama 24 jam, dan absorbansi diukur menggunakan metode MTT. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perbedaan konsentrasi H2O2 memiliki efek penghambatan terhadap proliferasi sel epitel tubulus ginjal kelinci, dengan nilai IC50 439 07 µ mol·L － 1, 500 µ Efek penghambatan H2O2 dengan mol · L -1 proliferasi sel dapat mencapai lebih dari 50 persen setelah 24 jam, sehingga konsentrasi ini dipilih untuk penelitian selanjutnya.

2.3 Pengaruh 2,3 H2O2 terhadap pelepasan LDH pada sel epitel tubulus ginjal kelinci

Setelah 24 jam perlakuan H2O2 pada sel epitel tubulus ginjal kelinci, nilai OD reaksi LDH dalam supernatan sel dan lisat sel diukur menggunakan metode deteksi sitotoksisitas nonradioaktif, dan pelepasan LDH dari sel dihitung. Hasilnya ditunjukkan pada Tabel 1. Konsentrasi H2O2 yang berbeda dapat menyebabkan peningkatan pelepasan LDH dari sel epitel tubulus ginjal kelinci, dan semakin tinggi konsentrasi H2O2, semakin besar pelepasan LDH dengan cara yang bergantung pada konsentrasi. H2O2 pada konsentrasi 400 mmol · L-1 menyebabkan pelepasan LDH sel melebihi gugus kosong lebih dari 50 persen , mengakibatkan kerusakan sel yang parah.

Tab. 1 Efek H2O2 pada pelepasan LDH dari RTEC kelinci

Catatan: Dibandingkan dengan grup kontrol kosong, *P<0 05; ＊＊ P ＜ 0. 01

2.4 Hasil pewarnaan fluoresensi AO/EB sel epitel tubulus ginjal kelinci yang diberi perlakuan dengan 2.4 H2O2

Setelah sel epitel tubulus ginjal kelinci diobati dengan H2O2 selama 24 jam, sel-sel diwarnai dengan fluoresensi AO/EB, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2. Awalnya dinilai bahwa mekanisme H2O2 pada sel epitel tubulus ginjal kelinci terutama untuk menyebabkan nekrosis. Konsentrasi H2O2 yang berbeda dapat menyebabkan berbagai tingkat nekrosis pada sel epitel tubulus ginjal kelinci, dengan konsentrasi H2O2 kurang dari 400 μ Pada mol · L-1, kromatin nuklir menyusut menjadi lingkaran dengan warna hijau, yang terutama dinilai sebagai apoptosis awal. Dengan peningkatan konsentrasi H2O2, lebih dari 450 μ Pada mol · L-1, sel menunjukkan bentuk manik tidak bulat berwarna oranye-merah, dan jumlah sel nekrotik meningkat dengan cara yang bergantung pada konsentrasi.

2.5 Efek 2.5 Cistanche deserticola pada H2O2-proliferasi yang diinduksi sel epitel tubulus ginjal kelinci

Studi Eksperimental pada Cistanche deserticola

Tingkat kelangsungan hidup sel epitel tubulus ginjal kelinci di bawah konsentrasi yang berbeda (2, 20, 200 mg! L-1) ekstrak air dan alkohol dari Cistanche deserticola tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dibandingkan dengan sel yang dikultur dalam kondisi normal tanpa intervensi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3, dibandingkan dengan kelompok model, kelompok ekstrak alkohol dan air konsentrasi tinggi dari Cistanche deserticola secara signifikan mengurangi efek penghambatan H2O2 pada proliferasi sel epitel tubular ginjal kelinci (P<0 01).

Gambar 2 Pewarnaan AO/EB pada kelinciRTEC yang diperlakukan dengan konsentrasi H2O2 yang berbeda (100 ×)

Catatan: Dibandingkan dengan grup model, * P<0 05,＊＊P ＜ 0. 01

Gambar 3 Pengaruh C． deserticola pada penghambatan H2O2 － kelinci yang diinduksiRproliferasi TEC

2.6 Efek 2.6 Cistanche deserticola pada kerusakan yang diinduksi H2O2 pada sel epitel tubulus ginjal kelinci

Hasil dampak pelepasan LDH dalam sel ditunjukkan pada Gambar 4. Kelompok ekstrak etanol dan ekstrak air Cistanche deserticola konsentrasi tinggi, sedang, dan rendah menghasilkan pelepasan LDH yang lebih rendah secara signifikan pada sel epitel tubulus ginjal kelinci setelah H2O2 pengobatan daripada di kelompok model (P<0 01), the results are concentration-dependent, with higher concentrations leading to lower cell LDH release.

Catatan: Dibandingkan dengan grup model, * P<0 05,＊＊P ＜ 0. 01

Gambar 4 Pengaruh C． deserticola pada H2O2 － pelepasan LDH yang diinduksi dari kelinciRTEC

3 Diskusi

Cistanche deserticola, yang dikenal sebagai "ginseng gurun", memiliki nilai pengobatan yang sangat tinggi dan merupakan obat tonik Tiongkok yang terkenal. The "Shennong Materia Medica Classic" [7] menjelaskan obat kelas atas sebagai: "Shangyao... terutama memelihara kehidupan untuk menanggapi langit, tidak beracun, dan harus sering diminum tanpa membahayakan orang..." Cistanche deserticola terdaftar sebagai obat kelas atas, dengan rasa manis dan suhu ringan. "Daftar Dokter Terkenal" [8] menunjukkan bahwa Cistanche deserticola adalah "asam, asin, dan tidak beracun". Setelah itu, catatan tentang sifat, rasa, dan meridian Cistanche deserticola di berbagai dinasti jamu Tiongkok konsisten. Sifatnya sedikit hangat, dan rasanya manis, asam, dan asin, yang termasuk meridian ginjal dan usus besar. Secara tradisional digunakan untuk defisiensi Yang ginjal, nyeri pinggang dan lutut, serta kelemahan otot dan tulang, efek dan mekanisme farmakologisnya selalu menjadi fokus penelitian. Studi farmakologi modern telah menunjukkan bahwa Cistanche deserticola dapat melawan penuaan, meningkatkan kemampuan belajar dan memori, dan mengatur fungsi kekebalan tubuh. Ini banyak digunakan dalam resep klinis obat tradisional Tiongkok, obat paten tradisional Tiongkok, dan persiapan sederhana dan produk perawatan kesehatan.

Suplemen cistanche di dekat saya

Stres oksidatif adalah pemicu utama dari beberapa penyakit utama, yang disebabkan oleh ketidakseimbangan antara pembentukan dan eliminasi spesies oksigen reaktif dalam tubuh, yang mengakibatkan kerusakan oksidatif pada histiosit sampai tingkat tertentu. Oleh karena itu, penelitian mendalam tentang mekanisme respons stres dapat menemukan cara yang masuk akal untuk mencegah, memperbaiki, atau bahkan menghilangkan penyakit iritabilitas secara efektif. Stres oksidatif dapat menyebabkan berbagai peroksidasi sel dan protein dalam tubuh [9], dan H2O2 dipilih sebagai salah satu zat eksogen untuk kerusakan dalam penelitian. Ini memiliki efek yang kuat dalam menginduksi peroksidasi lipid, menyebabkan reaksi peroksidasi lipid berantai, dan menyebabkan apoptosis dan disfungsi sel. Saat ini, penelitian tentang nefrotoksisitas zat eksogen ini dan efek antagonisnya terutama bergantung pada pembuatan model hewan, dan relatif sedikit laporan literatur tentang pembuatan model in vitro untuk penelitian terkait. Dibandingkan dengan model nefrotoksisitas hewan, model sel nefrotoksik in vitro memiliki keunggulan seperti target aksi yang jelas, siklus pengobatan yang singkat, dan dosis rendah.

Cistanche ramuan Cina

Pelajari model sel nefrotoksik in vitro yang diinduksi oleh zat eksogen melalui perubahan morfologi sel, efek penghambatan zat eksogen pada proliferasi sel, dan perubahan pelepasan LDH sel. Konsentrasi H2 O2 yang berbeda memiliki dampak yang signifikan terhadap perubahan morfologi sel. Dengan meningkatnya konsentrasi zat eksogen, ditemukan bahwa jumlah deformasi sel meningkat. Uji MTT adalah metode yang umum digunakan untuk mendeteksi jumlah sel hidup. Dalam percobaan di mana konsentrasi Cistanche deserticola yang berbeda melindungi sel epitel tubulus ginjal kelinci dari kerusakan H2O2, konsentrasi Cistanche deserticola yang berbeda secara signifikan mengurangi laju penghambatan H2O2 pada sel epitel tubulus ginjal kelinci, dan itu bergantung pada konsentrasi. Ketika membran sel rusak, LDH intraseluler akan dilepaskan ke media kultur. Kandungan LDH dalam media kultur sel merupakan indikator penting untuk mendeteksi kematian sel. Studi ini menemukan bahwa kadar LDH dalam media kultur sel kelompok model dengan H2O2-kerusakan yang diinduksi pada sel epitel tubulus ginjal kelinci meningkat secara signifikan, sedangkan kadar LDH pada kelompok eksperimen yang diperlakukan dengan konsentrasi Cistanche deserticola berbeda secara signifikan menurun dengan cara yang bergantung pada konsentrasi.Hasil penelitian menunjukkan bahwa membangun model H2O2-menginduksi kerusakan pada sel epitel tubulus ginjal kelinci dan terlebih dahulu mengeksplorasi efek perlindungan ekstrak Cistanche deserticola pada sel epitel tubulus ginjal, tidak hanya meletakkan dasar untuk penelitian tentang kerusakan sel yang disebabkan oleh stres oksidatif tetapi juga menyediakan data dasar untuk pengembangan dan pemanfaatan Cistanche deserticola.

referensi:

［1］ Bab. P( 2015) Vol Ⅰ［S］． 2015: 135.

［2］ Kim JH,Choi W,Lee JH,dkk. Astaxanthin menghambat H2O2 － kematian sel apoptosis yang dimediasi dalam sel progenitor saraf tikus melalui modulasi jalur pensinyalan p38 dan MEK［J］． Mikrobiol Bioteknol,2009,19( 11) : 1355 － 1363.

［3］ Siu PM,Wang Y,Alway SE. Pensinyalan apoptosis diinduksi oleh H2 O2 － dimediasi stres oksidatif dalam tabung myo C2 Cl2 yang dibedakan［J］． Life Sci,2009,84( 13) : 468 － 481. ［4］ Zhao Dan, Zhang Xue, Guan Jing, dll Sebuah studi tentang efek dari beberapa ramuan obat Cina pada proliferasi sel epitel tubulus ginjal primer pada kelinci ［ J ］. Jurnal Biologi Pertanian Gunung, 2017, 36 (4): 76-79

［5］ Chen Lizhen, Feng Tingting, Huang Junfei, dkk Studi tentang efek ipriflavon pada aktivitas osteoklas dan proliferasi dan diferensiasi osteoblas ［ J ］. Jurnal Biologi Pertanian Gunung, 2015, 34 (3): 042-047

［6］ Chen Meng, Li Huatao, Li Xiang, dkk Deteksi paclitaxel menginduksi apoptosis pada sel tumor payudara anjing secara in vitro menggunakan metode pewarnaan ganda AO/EB [J]. Sains dan Teknologi Peternakan dan Kedokteran Hewan Guangdong, 2011, 36 (1): 39-42

［7］ Gu GG,Yang PJ. Shen Nong Ben Cao Jing［M］． Beijing: Xueyuan Press,2013: 73.

［8］ Tao HJ,Shang Z J. Ming Yi Bie Lu［M］． Beijing: Rumah Penerbitan Medis Rakyat, 1986: 51.

［9］ Cash TP,Pan Y,Simon M C. Ｒspesies oksigen reaktif dan penginderaan oksigen seluler［J］． Gratis Ｒadic Biol Med,2007,43( 9) : 1219 － 1225．