Pengaruh Ekstrak Cistanche Tubulosa Terhadap Fungsi Reproduksi Jantan pada Tikus Diabetes yang Diinduksi Streptozotocin–Nicotinamide-Ⅱ

3.2. Dalam Analisis Vivo

3.2.1. Pengaruh CTE Terhadap Berat Badan Dan Asupan Kalori

Setelah 6 minggu percobaan, kelompok diabetes (HFD-DM) menunjukkan berat badan lebih tinggi dibandingkan kelompok kontrol. Kelompok HFD-DME4 menunjukkan berat badan lebih rendah dibandingkan kelompok HFD-DM dan HFD-DMER (Gambar 7a). Asupan kalori pada kelompok kontrol secara signifikan lebih rendah dibandingkan kelompok lainnya. Tidak ada perbedaan yang signifikan antara asupan kalori kelima kelompok lainnya (Gambar 7b).

3.2.2. Tes Toleransi Glukosa Oral (OGTT) Untuk Menentukan Keberhasilan Induksi Diabetes

Tes toleransi glukosa oral (OGTT) digunakan sebagai alat yang menjanjikan untuk mendeteksi diabetes melitus. Peningkatan kadar glukosa dalam darah menandakan kondisi diabetes. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 8a, kadar glukosa plasma lebih rendah pada kelompok CTE dibandingkan pada kelompok DM pada 0, 30, 90, dan 120 menit. Lebih lanjut, area di bawah kurva (AUC) konsentrasi glukosa plasma menunjukkan bahwa pada kelompok CTE dan RSG, laju pengambilan glukosa darah meningkat (Gambar 8b).

3.2.3. Kandungan Glukosa Plasma Total, Kolesterol, Dan Trigliserida

Kadar glukosa darah puasa plasma lebih tinggi pada kelompok DM dan lebih rendah pada kelompok DME2 (kecuali kontrol) dibandingkan kelompok lain. Tidak ada perbedaan yang signifikan pada total kolesterol antar kelompok kecuali pada kelompok DME4. Pada kelompok DME4, kadar kolesterolnya lebih rendah dibandingkan kelompok lainnya. Kadar trigliserida lebih tinggi pada kelompok DM dan lebih rendah pada kelompok DME4 dan kandungan trigliserida menurun seiring dengan peningkatan konsentrasi CTE (Tabel 2). Hasilnya menunjukkan bahwa kadar glukosa plasma, kolesterol, dan trigliserida lebih tinggi pada kelompok DM dan kadarnya menurun secara signifikan pada pengobatan CTE.

3.2.4. Kadar Insulin Plasma, Kadar Leptin Plasma, Dan Nilai Penilaian Model Homeostasis – Resistensi Insulin (HOMA-IR)

Kadar insulin plasma, leptin, dan nilai HOMA-IR ditunjukkan pada Tabel 3. Kelompok DM memiliki kadar insulin plasma dan leptin plasma lebih tinggi dibandingkan kelompok kontrol. Indeks HOMA-IR juga secara signifikan lebih tinggi pada kelompok DM. Nilai insulin plasma, leptin, dan HOMA-IR menurun dengan peningkatan konsentrasi CTE. Leptin plasma berkurang secara signifikan pada kelompok CTE tetapi kelompok obat RSG (DMR) tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan kelompok DM.

3.2.5. Pengaruh CTE Terhadap Kadar LH Dan Testosteron Plasma Pada Tikus Diabetes

Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 4, konsentrasi testosteron pada tikus diabetes (DM) menurun secara signifikankonsentrasi testosteron meningkat secara signifikanpada berbagai dosis CTE. Lebih lanjut, hasil penelitian menunjukkan sedikit penurunan kadar LH pada kelompok DM dibandingkan dengan DMR, DME1, DME2, dan DME4. Produksi LH lebih tinggi pada kelompok DME4.

3.2.6. Pengaruh CTE Terhadap Parameter Sperma Tikus Diabetes

Hasil eksperimen menunjukkan bahwa kelompok DM mengalami penurunan jumlah dan motilitas sperma yang signifikan dibandingkan kelompok kontrol, sedangkan tingkat kelainan sperma meningkat secara signifikan pada kelompok DM. Menariknya, jumlah sperma, motilitas sperma, dan angka kelainan sperma pada kelompok DMR mengalami peningkatan namun motilitas sperma tidak mencapai tingkat yang signifikan dibandingkan dengan DME4. DME2 menunjukkan jumlah sperma yang lebih baik dibandingkan semuanya dan tingkat motilitas meningkat secara signifikan pada kelompok DME4. Tidak ada perbedaan yang signifikan antara jumlah sperma abnormal antara kelompok yang diobati dengan RSG dan CTE (Tabel 5).

3.2.7. Pengaruh CTE Terhadap Morfologi Tubulus Seminiferus Pada Tikus Diabetes

Gambar 9 menunjukkan pewarnaan H&E pada bagian testis. Panah hitam menandakan sel Leydig dan panah putih menandakan sel Sertoli. Baik sel Leydig dan sel Sertoli pada kelompok DM menunjukkan atrofi yang signifikan dan terlihat rongga di lumen. Struktur sel Leydig dan Sertoli dipulihkan pada kelompok yang diobati dengan CTE dan RSG. Ketebalan tubulus seminiferus lebih tinggi pada kelompok CTE dan RSG dibandingkan pada kelompok DM.

3.2.8. Pengaruh CTE Terhadap MRNA KiSS1, GPR54, SOCS-3, Dan SIRT1 Di Hipotalamus Tikus Diabetes

Ekspresi KiSS1 (Gambar 10a), GPR54 (Gambar 10b), SOCS-3 (Gambar 10d), dan SIRT1 (Gambar 10c) ditunjukkan pada Gambar 10. Ekspresi mRNA KiSS1 dan reseptor GPR54 pada tikus diabetes adalah secara signifikan lebih rendah dibandingkan pada kelompok kontrol. Tingkat ekspresi mRNA KiSS1 dan GPR 54 di DMR, DME1, DME2, dan DME4 meningkat secara signifikan. Secara khusus, ekspresi mRNA GPR54 meningkat secara signifikan pada DME4 dan hampir mirip dengan kelompok kontrol.

CISTANCHE TUBULOSA ALAMI UNTUK MELINDUNGI PRODUKSI TESTOSTERON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Eksperimen ini mengeksplorasi lebih lanjut jumlah mRNA SOCS-3 dan SIRT1 di hipotalamus tikus. Ekspresi SOCS-3 mRNA pada tikus diabetes meningkat secara signifikan yang menunjukkan bahwa impedansi leptin lebih serius. Kelompok DMR, DME1, DME2, dan DME4 menunjukkan perbaikan yang signifikan jika dibandingkan dengan kelompok diabetes. Ekspresi mRNA SIRT1 pada kelompok DM menurun secara signifikan dan meningkat secara signifikan pada kelompok DME1 dan DME4.

3.2.9. Pengaruh CTE Terhadap Enzim Antioksidan Dalam Plasma Dan Testis Tikus Diabetes

Tabel 6 menunjukkan bahwa aktivitas SOD plasma, aktivitas GPx, dan aktivitas katalase tikus diabetes menurun secara signifikan dan aktivitas tersebut meningkat pada kelompok yang diobati dengan CTE dan RSG. Selain itu, DME4 menunjukkan peningkatan signifikan dalam aktivitas GPx dibandingkan yang lain. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas SOD dan katalase pada tikus diabetes menurun secara signifikan setelah enam minggu. Aktivitas SOD dan katalase kelompok DMR tidak mencapai tingkat yang signifikan. Kelompok yang diobati dengan CTE menunjukkan peningkatan signifikan dalam aktivitas SOD dan katalase. Peningkatan aktivitas katalase dan SOD pada kelompok CTE juga terlihat pada testis (Tabel 7). Aktivitas SOD dan katalase tertinggi masing-masing diamati pada kelompok DME1 dan kelompok DME2.

3.2.10. Pengaruh CTE Terhadap Stres Oksidatif Dan Peradangan Pada Plasma Dan Testis Tikus Diabetes

Produksi oksida nitrat (NO) dalam plasma (Gambar 11a) dan testis (Gambar 11b) ditunjukkan pada Gambar 11. Produksi NO pada kelompok DM meningkat secara signifikan baik pada testis maupun plasma dibandingkan dengan kelompok kontrol. Penurunan produksi NO secara bertahap diamati pada kelompok DME1, DME2, dan DME4 (dalam plasma). Kelompok DMR juga menunjukkan penurunan produksi NO yang signifikan. Dalam kasus testis, terdapat sedikit penurunan produksi NO yang diamati pada kelompok CTE, sedangkan kelompok DMR tidak mengurangi produksi NO secara signifikan.

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 12 dan 13, kadar TNF- dan IL-6 meningkat secara signifikan pada tikus diabetes (baik dalam plasma maupun testis), yang menunjukkan bahwa peradangannya lebih serius. Dalam plasma, tingkat TNF- serupa pada kelompok yang diobati dengan CTE dan RSG (Gambar 12a). Kelompok CTE secara signifikan (terutama DME2) mengurangi tingkat TNF- di testis (Gambar 12b). Tingkat IL-6 berkurang secara signifikan dalam plasma kelompok CTE dan RSG (Gambar 13a). Pada testis terdapat kecenderungan penurunan kadar IL-6, namun tidak mencapai tingkat yang signifikan (Gambar 13b).

3.2.1.1. Pengaruh CTE Terhadap Stres Oksidatif Dan Inflamasi Spermatozoa Tikus Diabetes Yang Diinduksi Diet Tinggi Lemak

Gambar 14 menunjukkan kandungan anion superoksida pada sperma tikus. Hasil penelitian menunjukkan bahwa produksi anion superoksida dalam sperma tikus diabetes meningkat secara signifikan dan tidak ada peningkatan signifikan yang diamati pada kelompok DMR. Kelompok DME1 dan DME4 menunjukkan penurunan produksi anion superoksida secara signifikan.

3.2.12. Pengaruh CTE Terhadap Peroksidasi Lipid Spermatozoa Tikus Diabetes Yang Diinduksi Diet Tinggi Lemak

Penelitian telah menunjukkan bahwa peroksidasi lipid meningkat pada pasien diabetes tipe 1 dan tipe 2 [19]. Kadar malondialdehid (MDA) dalam plasma, sperma, dan testis ditunjukkan pada Tabel 8. Kadar MDA dalam plasma, testis, dan sperma kelompok DM secara signifikan lebih tinggi dan pengobatan dengan CTE dan RSG mengurangi produksi MDA. Penurunan signifikan diamati pada kelompok DME4 dan DMEI dalam plasma. Studi ini menemukan bahwa tikus penderita diabetes tidak hanya meningkatkan derajat peroksidasi lipid dalam plasma tetapi juga meningkatkan testis dan sperma. Peningkatan yang signifikan diamati pada berbagai dosis CTE.

4. Diskusi

Diabetes adalah penyakit kronis yang berhubungan dengan tingginya kadar gula dalam darah. Ketidakseimbangan antara kadar antioksidan dan ROS akan menimbulkan kondisi yang disebut stres oksidatif. Superoksida, radikal hidroksil, hidrogen peroksida, oksida nitrat, dan oksigen singlet adalah beberapa contoh ROS yang akan berkontribusi terhadap kondisi diabetes melalui stres oksidatif [20].Cistanche tubulosamerupakan tumbuhan gurun yang mengandung komponen aktif sepertipolisakarida, oligosakarida, glikosida feniletanoid (echinacoside, verbascoside), asam palmitat, asam linoleat, iridoid, alditol, dan lignan. Tanaman ini mampu menghasilkan efek antiinflamasi, neuroprotektif, antibakteri, antivirus, antioksidan, antitumor, dan imunomodulator (21). Studi literatur menunjukkan bahwa glikosida feniletanoid dari Cistanche tubulosa adalah alasan utama aktivitas antioksidan [22]. Resveratrol (RES) dan rosiglitazone (RSG) masing-masing diambil sebagai kontrol positif untuk penelitian in vitro dan in vivo. RSG adalah sensitizer insulin yang kuat dan memiliki afinitas terhadap isoform peroxisome proliferator-activated receptor (PPARc). Ini mengontrol hiperglikemia pada pasien diabetes [23]. RES memiliki aktivitas antioksidan alami dan berperan sebagai vasodilator, mengatur metabolisme lipoprotein, menghambat agregasi trombosit, dan mencegah kanker [24,25]. Investigasi kami menunjukkan bahwa ECH menunjukkan aktivitas pembersihan radikal yang lebih baik dibandingkan CTE dan RES (Gambar 1). Juga dipahami bahwa ECH tidak menyebabkan toksisitas yang signifikan terhadap sel Leydig LC-540 dan TM3 (Gambar 2).

CISTANCHE TUBULOSA ALAMI UNTUK FUNGSI SEKSUAL PRIA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

AGEs digunakan untuk menginduksi kondisi stres pada sel Leydig. Produksi AGEs, peradangan, stres oksidatif, dan diabetes saling berhubungan. Kondisi hiperglikemik diabetes menyebabkan kerusakan sel melalui produksi AGEs dan stres oksidatif. AGEs menginduksi toksisitas sel, yang selanjutnya mendorong perekrutan sel kekebalan dan kematian sel. Peningkatan level AGEs mendorong ekspresi dua jenis reseptor yang disebut RAGE dan AGER1 [26]. Penetesan dan transfer elektron selanjutnya dari rantai pernapasan mitokondria ke molekul oksigen selama stres oksidatif menghasilkan pembentukan anion superoksida. Hasil kami menunjukkan bahwa produksi anion superoksida yang disebabkan oleh AGEs meningkat pada kelompok kontrol dan perbaikan lebih lanjut diamati dengan perlakuan ECH dan RES. Berdasarkan penelitian kami, dapat dipahami bahwa produksi superoksida (Gambar 3) dan H2O2 (Gambar 4) yang disebabkan oleh AGEs menurun dengan adanya ECH dan RES.

NF-κB dikenal sebagai mediator penting inflamasi yang berhubungan dengan diabetes [27]. Ekspresi NF-κB menyebabkan disfungsi sel dan kematian sel. Aktivasi NF-κB oleh stres oksidatif merangsang respon pro-inflamasi, peningkatan regulasi endotelin, dan apoptosis [28]. Ekspresi RAGE dan NF-κB meningkat pada kelompok yang distimulasi AGE dan penurunan selanjutnya diamati pada sel yang diobati dengan ECH dan RES (Gambar 5).

Testosteronadalah steroid anabolik dan primerhormon seks priadisintesis dari kolesterol. Prosesnya dimulai dengan pembelahan oksidatif rantai samping kolesterol oleh gen pembelahan rantai samping kolesterol (CYP11A). Gen ini terlokalisasi di membran mitokondria dan mengubah kolesterol menjadi pregnenolon. Selanjutnya, gen CYP17A1 dari retikulum endoplasma menghilangkan dua atom karbon tambahan dan menghasilkan banyak steroid C19. Selain itu, pregnenolon dioksidasi menjadi androstenedion/progesteron oleh hidroksisteroid dehidrogenase (3- -HSD). Terakhir, testosteron diproduksi melalui reduksi gugus keto pada posisi karbon ke-17 androstenedion oleh 17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase (17- -HSD). Sel Leydig terlibat dalam produksi utama testosteron. Pemindahan kolesterol ke dalam membran mitokondria bagian dalam memerlukan tindakan protein pengatur akut steroidogenik (StAR). Penelitian saat ini menunjukkan bahwa ekspresi StAR, CYP11A1, CYP17A1, dan HSD17 3 mengalami penurunan pada sel yang diobati dengan AGE (kontrol) dan terdapat peningkatan luar biasa yang ditunjukkan pada sel yang diobati dengan ECH dan RES (Gambar 6) . Dengan demikian, hasil menunjukkan bahwa produksitestosteron meningkat pada kelompok yang diobati dengan ECH dan RES. 

CISTANCHE TUBULOSA ALAMI UNTUK MENINGKATKAN KEKUATAN SEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Selama kondisi diabetes, pengangkutan glukosa ke organ tubuh menjadi terbatas dan akibatnya kadar glukosa meningkat [29]. Oleh karena itu, kondisi hiperglikemik merupakan salah satu penanda penting untuk deteksi diabetes. Penelitian kami menunjukkan bahwa kadar glukosa plasma meningkat pada kelompok diabetes dan AUC pada kelompok DM secara signifikan lebih tinggi dibandingkan kelompok lainnya (Gambar 8). Seiring dengan glukosa plasma, kandungan kolesterol total dan trigliserida meningkat secara signifikan pada kelompok DM (Tabel 2). Aterosklerosis difasilitasi oleh peningkatan kadar kolesterol dan trigliserida [30]. Namun, tingkat kolesterol dan trigliserida menurun pada kelompok yang diobati dengan CTE dan RSG. Kandungan trigliserida kelompok DME4 mencapai nilai yang hampir sama dengan kelompok kontrol.

Insulin merupakan hormon yang diproduksi oleh sel pankreas dan berfungsi untuk mengontrol kadar gula darah dalam tubuh sedangkan leptin merupakan hormon yang diproduksi oleh adiposit yang mampu mengatur asupan makanan dan pemanfaatan energi. Studi menunjukkan bahwa leptin terlibat dalam patofisiologi obesitas dan terdapat interaksi positif antara leptin dan insulin [31]. Penelitian kami menunjukkan bahwa kadar inulin dan leptin plasma lebih tinggi pada kelompok DM dan kadar insulin menurun seiring dengan peningkatan konsentrasi CTE. Kelompok RSG tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan kelompok DM. Resistensi insulin dan fungsi sel dinilai dengan metode HOMA-IR. Nilai HOMA-IR meningkat pada kelompok DM dan berbeda nyata dengan kelompok lainnya (Tabel 3).

DM mempengaruhi fungsi reproduksi melalui pergantian hormonal pada sumbu HPG dan penelitian mengungkapkan bahwa ekspresi insulin di testis juga dipengaruhi oleh diabetes. Hal ini ditandai dengan vakuolisasi sel Sertoli, peningkatan fragmentasi DNA, gangguan spermatogenesis, dan peningkatan penipisan sel germinal. Stres oksidatif juga berkontribusi terhadap kelainan fungsi reproduksi [32]. Proses pembentukan sperma pada alat reproduksi pria (testis) disebut dengan spermatogenesis. Testis terdiri dari tubulus melingkar rapat yang disebut tubulus seminiferus. Sel Sertoli terlihat di dinding tubulus seminiferus dan memberi nutrisi pada sperma yang belum matang. Pemeriksaan parameter sperma menunjukkan bahwa jumlah dan motilitas sperma menurun dan kelainan meningkat pada kelompok DM (Tabel 5). Efek sebaliknya diamati pada kelompok yang diobati dengan CTE dan RSG. Baik sel Leydig maupun sel Sertoli pada kelompok DM menunjukkan atrofi yang signifikan dan rongga terlihat di lumen. Ketebalan tubulus seminiferus juga menurun pada kelompok DM. Hasil yang lebih baik diamati pada kelompok yang diobati dengan CTE dan RSG (Gambar 9). Selain itu, kadar LH dan testosteron menurun pada kelompok DM dan kadarnya meningkat pada kelompok yang diobati dengan CTE (Tabel 4). Pada pria, testosteron serum yang rendah dan frekuensi denyut LH yang lebih rendah sering dikaitkan dengan obesitas dan diabetes mellitus tipe 2 [33].

Kisspeptins yang dikodekan oleh gen KiSS1 dikenal sebagai stimulator kuat dari sumbu HPG dan setiap mutasi pada genkispeptin akan menyebabkan rendahnya tingkat steroid seks dan gonadotropin. Studi menunjukkan bahwa pada tikus diabetes yang diinduksi STZ, tingkat mRNA Kiss1 menurun [33]. Inisiasi dan pemeliharaan infertilitas mamalia dihubungkan dengan G-protein coupled receptor 54 (GPR54). Mutasi pada GPR 54 ditandai dengan tidak adanya pematangan seksual dan rendahnya kadar hormon gonadotropik (LH dan FSH). Sitokin pro-inflamasi seperti IL-6 dan TNF- meningkatkan ekspresi penekan sitokin sinyal 3 (SOCS3) yang terlibat dalam resistensi insulin yang dimediasi peradangan di hati dan adiposit [34]. SIRT 1 adalah gen yang terkait dengan regulasi beberapa penyakit penuaan. Gen ini diekspresikan secara jelas di sel pankreas dan mengatur sekresi insulin serta mencegah apoptosis. Penelitian saat ini menunjukkan bahwa ekspresi KiSS1, GPR54, dan SIRT1 menurun pada kelompok DM, namun ekspresi tersebut meningkat pada kelompok yang diobati dengan CTE (Gambar 10). Peningkatan ekspresi SOCS-3 pada kelompok DM menunjukkan kondisi inflamasi. Tautan molekuler pertama yang diidentifikasi antara obesitas dan peradangan adalah TNF-. Oleh karena itu, peningkatan kadar TNF- merupakan indikator peradangan. Penurunan tingkat sitokin pro-inflamasi seperti TNF- dan IL-6 terlihat pada kelompok yang diobati dengan CTE (Gambar 12 dan 13).

Ketidakseimbangan antara ROS dan antioksidan menyebabkan kondisi diabetes. Superoksida dismutase (SOD), katalase (CAT), dan glutathione peroksidase (GPX) dikenal sebagai antioksidan utama yang bertanggung jawab untuk menjaga tingkat ROS optimal [35]. Dari hasil penelitian diketahui bahwa aktivitas antioksidan lebih rendah secara signifikan pada kelompok DM. Kelompok yang diobati dengan CT menunjukkan perbaikan dalam produksi antioksidan. Kelompok yang diobati dengan RSG tidak menunjukkan peningkatan aktivitas antioksidan yang signifikan (Tabel 6 dan 7).

Nitric oxide (NO) dikenal sebagai ROS penting yang berkontribusi terhadap peradangan. Penelitian kami menunjukkan bahwa tingkat NO menurun pada kelompok yang diobati dengan CTE (Gambar 11). Hasil penelitian menunjukkan kandungan anion superoksida pada sperma tikus diabetes meningkat secara signifikan dan tidak terdapat perbaikan yang signifikan setelah pemberian RSG. Produksi superoksida berkurang pada kelompok CTE.

Penentuan MDA sangat berguna untuk mengevaluasi peroksidasi lipid. Peroksidasi lipid adalah proses oksidasi pada lipid dan akhirnya mengakibatkan kerusakan sel. MDA diproduksi sebagai hasil peroksidasi lipid dari asam lemak tak jenuh ganda. Studi menunjukkan bahwa kadar MDA berkorelasi dengan usia dan kadar glukosa darah puasa [36]. Penelitian saat ini menunjukkan bahwa CTE meningkatkan peroksidasi lipid dalam plasma, testis, dan sperma (Tabel 8).

CISTANCHE TUBULOSA ALAMI UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%

5. Kesimpulan

Stres oksidatif pada kondisi diabetes mengganggu sistem reproduksi pria melalui gangguan sperma dan disfungsi gonad. Cistanche tubulosa adalah tanaman gurun yang diterima secara luas dalam pengobatan Tiongkok karena efek farmakologisnya.Echinakosida (ECH)adalah konstituen utama CTE yang bertanggung jawab atas aktivitas antioksidan dan anti-inflamasinya. Hasil in vitro kami menunjukkan bahwa ECH memulihkan jalur sintesis testosteron dan menurunkan tingkat ekspresi protein NF-κB dan RAGE. ECH secara efektif menghambat produksi anion superoksida dan H2O2 dalam sel Leydig. Studi in vivo mengungkapkan bahwa ECH mengurangi kadar kolesterol, trigliserida, TNF-, dan IL-6. Selain itu, ekspresi mRNA di hipotalamus tikus diabetes meningkat secara signifikan. Perlu juga dicatat bahwa ECH mengurangi peroksidasi lipid dan meningkatkan resistensi insulin pada tikus jantan penderita diabetes. Aktivitas antioksidan meningkat baik dalam plasma dan testis. Oleh karena itu, penelitian kami menunjukkan bahwa ECH memberikan perlindungan efektif terhadap disfungsi reproduksi pada tikus jantan diabetes yang diinduksi STZ.