Paparan Knalpot Diesel Mengubah Ekspresi Jaringan yang Terlibat dalam Degenerasi Saraf pada Otak Ikan Zebra Bagian 3

Hasil perbandingan proteomik menunjukkan adanya upregulasi (overrepresentasi) ACTG2 (aktin, gamma 2), CAT (katalase), GSR (glutathione-disulfidereductase), GST (glutathione S-transferase), HMOX1 (heme oksigenase 1), dan PRDX1 (peroxiredoxin 1), serta downregulasi ubiquitin-conjugatingenzyme ubcM2, RAP1A (RAP1A, anggota keluarga RASoncogene), UBE2E3 (ubiquitin-conjugatingenzyme E2 E3), dan ACTA1 (actin, alpha 1).

Proteomik adalah teknologi ilmiah berskala besar yang mempelajari jenis, struktur, jumlah, dan fungsi protein dalam organisme. Dalam beberapa tahun terakhir, semakin banyak penelitian yang menunjukkan bahwa proteomik berkaitan erat dengan memori.

Para peneliti telah menemukan bahwa protein di otak dapat mempengaruhi sinyal antar neuron, sehingga mempengaruhi aktivitas kognitif seperti pembelajaran dan memori. Misalnya, sebagian besar molekul protein yang diperlukan untuk proses pengkodean dan penyimpanan memori disintesis di sinapsis. Molekul protein ini tidak hanya terlibat langsung dalam konduksi dan transduksi sinyal saraf, tetapi juga dapat mempengaruhi koneksi sinaptik dan stabilitasnya antar neuron, sehingga mempengaruhi pembentukan dan konsolidasi memori.

Penelitian juga menemukan bahwa protein tertentu memainkan peran penting dalam proses memori. Misalnya, protein kinase CaMKII di neuron mengatur kekuatan dan stabilitas koneksi sinaptik dan memainkan peran penting dalam pembelajaran dan memori. Protein penting lainnya adalah BDNF, yang dapat mendorong pertumbuhan neuron, penguatan sinaptik, dan kelangsungan hidup neuron, sehingga meningkatkan konsolidasi dan pemeliharaan memori.

Selain itu, beberapa penelitian menemukan bahwa kesehatan fisik dan pola makan juga memiliki pengaruh signifikan terhadap proteomik dan memori. Tidur yang cukup, olahraga yang tepat, dan pola makan rendah lemak dan tinggi protein dapat meningkatkan sintesis dan perbaikan protein, yang bermanfaat untuk meningkatkan daya ingat dan kemampuan kognitif.

Singkatnya, proteomik dan memori terkait erat. Para ilmuwan yang mempelajari ilmu kehidupan semakin menemukan cara memodulasi proteom untuk meningkatkan daya ingat dan mencegah pengobatan gangguan kognitif seperti penyakit Alzheimer. Oleh karena itu, kita harus memperhatikan hasil penelitian ilmiah dan menjaga kebiasaan makan, hidup, dan olahraga yang baik untuk menjaga kesehatan, otak yang kuat, dan daya ingat yang lebih baik. Terlihat bahwa kita perlu meningkatkan daya ingat, dan Cistanche deserticola dapat meningkatkan daya ingat secara signifikan, karena Cistanche deserticola juga dapat mengatur keseimbangan neurotransmiter, seperti meningkatkan kadar asetilkolin dan faktor pertumbuhan. Zat-zat ini sangat penting untuk daya ingat dan pembelajaran. Selain itu, Cistanche deserticola juga dapat meningkatkan aliran darah dan meningkatkan pengiriman oksigen, yang dapat memastikan otak menerima nutrisi dan energi yang cukup, sehingga meningkatkan vitalitas dan daya tahan otak.

Klik tahu 10 cara meningkatkan daya ingat

Diantaranya, penurunan regulasi ubcM2, penghambat Nrf2, dapat menyebabkan aktivitas jalur ini lebih tinggi. Karena komponen sitoskeleton yang berbeda (ACTG2 danACTA1) berperilaku berbeda dan mempertimbangkan kurangnya ekspresi diferensial yang signifikan pada Nrf2 atau Keap1, dapat disimpulkan bahwa paparan DEPe dapat menyebabkan penataan ulang sitoskeleton (mendukung translokasi Nrf2 ke nukleus) dan aktivasi sitoskeleton. Jalur Nrf2 secara tidak langsung melalui rangsangan stres oksidatif (Gbr. 4).

Temuan ini didukung dengan baik oleh analisis transkriptomik kami, yang menunjukkan upregulasi PRDX, GSR, dan GST (gen hilir). Namun, analisis transkriptome lebih lanjut merinci bahwa c-Fos dan FRA1 (dua penghambat Nrf2 nuklir) diturunkan regulasinya secara signifikan dan oleh karena itu memungkinkan aktivitas Nrf2 yang lebih tinggi selama pengobatan DEPe.

Pematangan fagosom

Pematangan fagosom memfasilitasi perdagangan partikel yang terinternalisasi menuju serangkaian struktur subseluler yang semakin diasamkan dan terikat membran, sehingga mengakibatkan degradasi partikel. Setelah penyegelan atau pemotongan dari membran permukaan, fagosom menyatu dengan endosom awal, endosom akhir, dan lisosom disertai dengan perubahan pengasaman yang signifikan dalam komposisinya, mengubahnya menjadi lingkungan oksidatif dan degradatif.

Pergerakan fagosom terjadi berdasarkan pengikatan protein sitoskeletal (mikrotubulus), yang mengarah pada fusi endosom dan lisosom secara berurutan secara dinamis (Gotthardt et al. 2002). Selama pematangan, GTPase Rab5 mendorong fusi endosom awal melalui interaksi dengan beberapa molekul, termasuk antigen endosom awal 1 (EEA1), kompleks VPSS34, dan SNAREprotein.

Selain itu, pengasaman terjadi secara bersamaan melalui vATPase (pompa proton vakuolar) yang mentranslokasi H+ melintasi membran dan selanjutnya mengasamkan lumen (Desjardins dkk. 1994).

Meskipun tidak ada keterlibatan signifikan jalur ini yang ditemukan pada tingkat transkriptomik, analisis proteomik kami menunjukkan penurunan regulasi ATP6V1A (ATPase H+mengangkut subunit A V1), ATP6V1E1, ATP1B2B, ATP1B3A, ATP6V1F, DYNLRB1 (penghalang jalan rantai ringan dynein tipe 1), TUBA1C (tubulin alpha 1c), TUBB2A, TUBB4A, dan VAMP2 (protein membran terkait vesikel 2) yang menunjukkan bahwa pengobatan dengan DEPe dapat menyebabkan aktivitas maturasi fagosom yang lebih rendah atau perubahan pH lisosom (Gbr. 4). Hal ini konsisten dengan laporan terbaru kami bahwa paparan DEPe menghasilkan fux neuronalautophagic yang lebih rendah dan menunjukkan adanya mekanisme yang mendasari toksisitas neuron akibat polusi udara (Barnhill et al.2020).

Pemrosesan amiloid

Plak amiloid merupakan ciri khas lesi neuropatologis otak pada DA dan PD dengan demensia. Struktur ini terdiri dari peptida A-beta, yang merupakan inti dari patofisiologi DA (Sadigh Eteghad dkk. 2015).

Beta amiloid diproses oleh kompleks gamma-sekretase (Presenilin1/2) dan beta-sekretase (BACE1) dari protein transmembran-Amiloid Tipe 1 (APP). Diketahui bahwa masuknya Ca2+yang tidak normal menyebabkan aktivasi Calpain yang menyimpang, yang berperan dalam fosforilasi protein Tau yang terkait mikrotubulus melalui jalur CDK5.

Selain itu, stres oksidatif yang terkait dengan akumulasi A-beta berkontribusi pada aktivasi beberapa kinase, termasuk MAP kinase, yang mengakibatkan fosforilasi tau. Hiperfosforilasi patologis tau memiliki peran penting dalam destabilisasi mikrotubulus (Sadigh-Eteghad dkk. 2015 ). Perubahan-perubahan ini sangat relevan dengan patogenesis AD dan PD dan dapat menjadi faktor yang berkontribusi terhadap peningkatan risiko polusi udara.

Analisis ekspresi kami menunjukkan dampak destabilisasi DEPe pada regulator pemrosesan amiloid karena tiga regulator termasuk CAPNS1 (calpain subunit kecil 1), MARK1 (pengatur afinitas mikrotubulus kinase 1), dan PRKAR1B (subunit pengatur tipe I yang bergantung pada protein kinasecAMP) diturunkan regulasinya di tingkat protein (Gbr. 4).

Disfungsi mitokondria

Sebagai konsumen utama oksigen dalam sel, mitokondria mengandung banyak pembawa redoks untuk mentransfer elektron ke oksigen, yang menghasilkan pembentukan spesies oksigen reaktif (ROS).

Organel ini mengandung sistem pertahanan antioksidan untuk mendetoksifikasi ROS dan menghindari kerusakan oksidatif pada komponen seluler lainnya. Paparan DEPe menyebabkan perubahan ekspresi protein utama yang kemungkinan besar mengakibatkan disfungsi mitokondria. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4, terdapat penurunan yang signifikan pada kadar protein ATP sintase (ATP5F1D, ATP5mea), Sitokrom c oksidase (COX7A2), NADH dehydrogenase (NDUFA10,NDUFS8), 2-oxoglutarate dehydrogenase (OGDH), dan subunit kompleks sitokrom b-c1 2 (UQCRC2) yang memainkan peran penting dalam transportasi elektron.

Hal ini dapat mengubah produksi ATP dan juga secara langsung mengakibatkan peningkatan produksi ROS dan toksisitas. Disfungsi mitokondria telah diusulkan untuk berkontribusi terhadap patogenesis AD dan PD dan, seperti beberapa jalur yang disebutkan di atas, polusi udara dapat mengubah risiko dengan mengganggu fungsi organel penting ini.

Sinyal panduan aksonal

Pembentukan koneksi saraf memerlukan perluasan akson yang bermigrasi menuju target sinaptiknya. Di tepi depan akson, kerucut pertumbuhan aksonal mengandung reseptor dengan kemampuan untuk merasakan isyarat panduan menarik dan menjijikkan yang diperlukan untuk navigasi akson.

Selain BMP, Shh, dan Wnt (yang baru-baru ini terlibat dalam panduan aksonal), setidaknya ada empat kelompok utama isyarat panduan: (i) reseptor Netrin dan DCC/UNC-5; (ii) Reseptor plexin, semaphorin, dan neuropilin; (iii) Reseptor celah dan Robo; dan (iv) Reseptor Ephrin dan Eph. Protein ini mungkin disekresi dan dikaitkan dengan matriks ekstraseluler (Slits, Netrins, dan beberapa Semaphorin) atau melekat pada permukaan sel (Ephrins dan Semaphorin lainnya) (Stoeckli 2018). Pengobatan dengan DEPe berdampak pada beberapa aspek panduan aksonal.

Pada tingkat protein, beberapa faktor dan pengatur penting diubah setelah pengobatan. Representasi berlebihan dari PLXNB2 (plexin B2) dan kurang terwakilinya beberapa protein termasuk ARHGEF11 (faktor pertukaran nukleotida Rho guanine 11), CHMP1A (protein tubuh multivesikular bermuatan 1A), COPS5 (COP9 signalosomesubunit 5), GNAT1 (G protein subunit alpha transducin 1), GNAT2 (Subunit protein G alfa transdusin 2), GNB5 (subunit protein G beta 5), ​​MYL1 (rantai ringan myosin 1), MYL2 (rantai ringan myosin2), NCK1 (protein adaptor 1), PLXNA1 (plexin A1), PRKAR1B (protein kinase subunit pengatur tipe I yang bergantung pada cAMP), RAC3 (keluarga Rac smallGTPase 3), RAP1A (anggota keluarga onkogen RAS), SHANK2 (SH3 dan beberapa ankyrin repeatdomains 2), TUBA1C (tubulin alpha 1c), TUBB2A (tubulin beta 2A kelas IIa ), dan TUBB4A (tubulinbeta 4A kelas Iva) menunjukkan adanya penurunan panduan akson yang signifikan pada embrio yang sedang berkembang (Tambahan Tabel 5).

Menariknya, jalur panduan aksonal tidak terpengaruh secara signifikan pada tingkat transkriptomik, yang menunjukkan bahwa keterlibatan jalur ini mungkin merupakan hasil hilir dimana beberapa protein efektor/regulator telah terdegradasi.

Perubahan jalur panduan aksonal yang dijelaskan di sini mungkin mencerminkan jalur neurotoksik yang relevan dengan AD dan PD atau sekadar mencerminkan gangguan perkembangan saraf dalam perkembangan embrio. Analisis profil ekspresi pada orang dewasa yang terpajan DEPe akan membantu menyelesaikan pertanyaan ini.

Jalur lainnya

Analisis proteomik dan transkriptomik kami juga menunjukkan keterlibatan beberapa jalur dan rute metabolik termasuk degradasi melatonin, ritme sirkadian, pensinyalan sambungan sel Sertoli-sel Sertoli, pensinyalan sambungan melekat epitel, metabolisme hormon tiroid II (melalui konjugasi dan/atau degradasi), pensinyalan RhoA, inosin -5′-biosintesis fosfat II, jalur pensinyalan GP6, pensinyalan RhoGDI, jalur aktivasi protrombin ekstrinsik, dan sistem koagulasi. Banyak dari perubahan ini mencerminkan perubahan akibat terhentinya pembangunan.

Misalnya, analisis proteomik dan transkriptomik mengungkapkan bahwa jalur fototransduksi memiliki perubahan ekspresi terbesar pada pengobatan DEPe. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel Tambahan 5, beberapa gen, termasuk Opsin, GRK, S-arrestin, Transducin-, Transducin-, PDC, dan GUCA memiliki tingkat transkripsi yang dilemahkan karena paparan DEPe. Karena kurangnya bukti induksi elemen apa pun di jalur ini, pengobatan DEPe tampaknya mengganggu perkembangan sistem visual. Hal ini konsisten dengan pengamatan kami bahwa mata tidak pernah berkembang sepenuhnya dan menjadi kecil setelah pengobatan.

Penilaian fungsional

Dalam laporan ini, peningkatan regulasi sitokrom P450 (Cyp1A) yang signifikan merupakan efek paling menonjol dari paparan DEPe. Cyp1A memetabolisme banyak senyawa endogen dan eksogen dan peningkatan ekspresi di otak mungkin bersifat melindungi, atau berkontribusi terhadap, toksisitas. Untuk lebih memahami peran Cyp1A dalam toksisitas DEPe, kami menggunakan CRISPR/Cas9 untuk menghasilkan model knockdown Cyp1A. Karena prosedur penyuntingan gen pada ikan zebra kemungkinan besar merupakan proses parsial yang menghasilkan embrio mosaik, kami menggunakan istilah "knockdown" (KD) dan bukan "knockout". Dengan menggunakan RNA panduan spesifik urutan, kami mengubah situs CCA PAM pertama menjadi kodon TGA (stop) di ekson pertama Cyp1A. Panduan non-target-RNA digunakan sebagai alternatif digunakan sebagai kontrol perebutan (SC).

Total RNA kemudian diisolasi dari kepala hingga 20 embrio KD dan SC (5 pdf), dan efisiensi knockdown divalidasi dengan analisis qPCR. Mirip dengan apa yang diamati dalam studi RNA-Seq throughput tinggi, percobaan ini menunjukkan induksi yang tajam (30.59-kali lipat dari garis dasar) Cyp1A setelah perlakuan DEPe pada embrio SC, sedangkan embrio KD tidak mengalami peningkatan ekspresi seperti itu ( Gambar 5a).

Kelangsungan hidup enam kelompok embrio selama 7-siang hari (n Lebih besar dari atau sama dengan 40) ditunjukkan pada Gambar. 5b. Singkatnya, pada 7pdf, rata-rata kelangsungan hidup adalah 89,1%, 74,4%, 79,4%,68,5%, 48,8%, dan 7,6% untuk WT/DMSO, WT/DEPe, SC/DMSO, SC/DEPe, KD/DMSO, dan KD/DEPe, masing-masing. Dengan demikian, KD dari Cyp1A mengakibatkan berkurangnya kelangsungan hidup tetapi berkurang secara dramatis pada ikan yang diberi perlakuan DEPe dibandingkan dengan kontrol.

Selain itu, KD juga menghasilkan tingkat malformasi morfologi yang jauh lebih tinggi (Gambar 5c). Dengan demikian, induksi ekspresi Cyp1A oleh DEPe tampaknya merupakan mekanisme kompensasi protektif. Keterbatasan signifikan dari temuan kami adalah kami mengukur induksi ekspresi Cyp1A di otak ikan zebra tetapi KDexperiments mengurangi ekspresi di seluruh embrio.

Pentingnya dan implikasinya terhadap penyakit neurodegeneratif

Polusi udara diketahui berdampak negatif terhadap kualitas hidup dan berperan penting dalam perkembangan penyakit pada manusia dan hewan. Dengan menggunakan analisis ekspresi throughput tinggi, kami menunjukkan bahwa pengobatan DEPe mengubah beberapa proses biologis dan jalur sinyal di kepala embrio ikan zebra. Perubahan dalam pembentukan fagosom, pemrosesan amiloid, dan fungsi mitokondria sangat relevan dengan degenerasi saraf.

Anehnya, hasil penelitian kami tidak menunjukkan adanya keterlibatan jelas dalam peradangan, yang diperkirakan berperan penting dalam toksisitas polusi udara. Hal ini mungkin terjadi karena kami mengukur ekspresi hanya pada kepala ikan zebra berumur 5-hari dan bukan seluruh tubuhnya. Studi-studi ini bertujuan untuk mengetahui bagaimana otak dipengaruhi oleh paparan DEPe.

Otak memang mengandung mikroglia, yang kemungkinan besar diaktifkan oleh DEPe, namun mikroglia tersebut menyusun sebagian kecil sel di otak sehingga perubahan apa pun mungkin tidak terdeteksi. Selain itu, mikroglia tidak ada dan berfungsi di otak larva yang sedang berkembang hingga 3–5 pdf. Oleh karena itu, paparan dini mungkin bukan cara yang paling relevan untuk mempelajari respons inflamasi. Induksi metabolisme xenobiotik juga mungkin relevan sebagai respons kompensasi atau perlindungan terhadap polusi udara.

Model Cyp1AKD kami memvalidasi peran protektif dari jalur ini dan merupakan contoh yang sangat baik tentang bagaimana studi ekspresi dapat memberikan petunjuk penting untuk menentukan mekanisme racun seperti polusi udara. Tidak diketahui apakah polimorfisme pada gen Cyp1A mengubah risiko AD atau PD pada manusia yang terpapar polusi udara, namun hasil ini menunjukkan potensi interaksi gen-lingkungan dan memerlukan penyelidikan lebih lanjut.

Satu pertanyaan penting untuk dijawab adalah relevansi paparan DEPe terhadap polusi udara. DEPe adalah campuran yang paling umum digunakan dalam penelitian polusi udara untuk kultur sel dan model lain yang tidak dapat digunakan pada ruang inhalasi. Ekstrak diklorometana DEP mengandung gugus hidrofobik seperti PAH yang kemungkinan besar akan memasuki aliran darah dan terakumulasi secara biologis di otak. Sebuah penelitian baru-baru ini menentukan konsentrasi beberapa PAH dalam otak otopsi manusia dan menemukan bahwa mereka mengandung konsentrasi PAH yang sangat mirip dengan yang digunakan dalam penelitian yang disajikan di sini (Pastor-Beldaet al. 2019). Oleh karena itu, paparan terhadap otak ikan zebra sangat relevan, karena mengandung PAH dan bagian lain yang telah diamati terakumulasi secara hayati di otak manusia.

Ucapan Terima Kasih Kami berterima kasih kepada lembaga-lembaga berikut yang mendanai pekerjaan ini: The Levine Foundation (JMB), hibah dari Institut Nasional Ilmu Kesehatan Lingkungan, NIEHST32ES015457 (LMB, SK), dan The Parkinson's Alliance (JMB).

Kontribusi penulis Konsepsi dan desain penelitian (MSJ, LMB, JMB); Akuisisi data (MSJ, HM, LMB, SL):Analisis dan interpretasi data (MSJ, LMB, JMB); Menyusun artikel atau merevisinya secara kritis untuk konten intelektual penting (MSJ, HM, LMB, JMB).

Pendanaan Penelitian ini didukung oleh The Levine Foundation (JMB), hibah dari National Institute of Environmental Health Sciences, NIEHS T32ES015457 (LMB, SK), dan The Parkinson's Alliance (JMB).

Ketersediaan Data Semua data tersedia di file tambahan kami.

Deklarasi

Persetujuan etika Semua percobaan pada hewan disetujui oleh Komite Penelitian Hewan UCLA.

Persetujuan untuk publikasi Semua penulis menyetujui penyerahan ini untuk publikasi.

Kepentingan yang bersaing Para penulis menyatakan tidak ada kepentingan yang bersaing.

Akses Terbuka Artikel ini dilisensikan di bawah Creative Commons Attribution 4.0 Lisensi Internasional, yang mengizinkan penggunaan, berbagi, adaptasi, distribusi, dan reproduksi dalam media atau format apa pun, selama Anda memberikan kredit yang sesuai kepada penulis asli dan sumbernya, berikan tautan ke lisensi Creative Commons, dan tunjukkan jika ada perubahan.

Gambar atau materi pihak ketiga lainnya dalam artikel ini disertakan dalam lisensi Creative Commons artikel tersebut kecuali dinyatakan lain dalam batas kredit materi tersebut. Jika materi tidak termasuk dalam penerima lisensi Creative Commons artikel dan tujuan penggunaan Anda tidak diizinkan oleh peraturan perundang-undangan atau melebihi penggunaan yang diizinkan, Anda harus mendapatkan izin langsung dari pemegang hak cipta. Untuk melihat salinan lisensi ini.

Referensi

1. Ahmadinejad F, Møller, SG Hashemzadeh-Chaleshtori M, BidkhoriG, Jami MS. Mekanisme molekuler di balik fungsi pemulung radikal bebas melawan stres oksidatif Antioksidan 2017;6https://doi.org/10.3390/antiox6030051

2. Barnhill LM, Khuansuwan S, Juarez D, Murata H, AraujoJA, Bronstein JM. 2020. Paparan ekstrak knalpot diesel menyebabkan toksisitas saraf dengan mengganggu autophagy. Ilmu Toksikol; https://doi.org/10.1093/toxsci/kfaa055. Tersedia:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32298450 [Diakses1 Mei 2020].

3. Bostancıklıoğlu M. Pembaruan tentang interaksi antara penyakit Alzheimer, autophagy, dan peradangan. Gene.2019;705:157–66. https://doi.org/10.1016/j.gene.2019.04.040.

4. Calderón-Garcidueñas L, Maronpot RR, Torres-Jardon R,Henríquez-Roldán C, Schoonhoven R, Acuña-Ayala H, dkk. Kerusakan DNA pada jaringan hidung dan otak anjing yang terpapar polutan udara dikaitkan dengan bukti peradangan otak kronis dan degenerasi saraf. Toxicol Pathol. 2003;31:524–38. https://doi.org/10.1080/01926230390226645.

5. Calderón-Garcidueñas L, Mora-Tiscareño A, Ontiveros E,Gómez-Garza G, Barragán-Mejía G, Broadway J, dkk. Polusi udara, defisit kognitif, dan kelainan otak: studi percontohan dengan anak-anak dan anjing. Otak Cogn.2008a;68:117–27. https://doi.org/10.1016/j.bandc.2008.04.008.

6. Calderón-Garcidueñas L, Reed W, Maronpot RR, HenríquezRoldán C, Delgado-Chavez R, Calderón-Garcidueñas A, dkk. Peradangan otak dan patologi mirip Alzheimer pada individu yang terpapar polusi udara parah. Pathol Toksikol. 2004;32:650–8. https://doi.org/10.1080/01926230490520232.

7. Calderón-Garcidueñas L, Solt AC, Henriquez-Roldán C, TorresJardón R, Nuse B, Herritt L, dkk. Paparan polusi udara jangka panjang dikaitkan dengan peradangan saraf, perubahan respons imun bawaan, gangguan sawar darah-otak, pengendapan partikulat ultrahalus, dan akumulasi amiloid -42 dan -synuclein pada anak-anak dan dewasa muda. Toxicol Pathol. 2008b;36:289–310. https://doi.org/10.1177/0192623307313011.

8. Calderón-Garcidueñas L, Villarreal-Calderon R, ValenciaSalazar G, Henríquez-Roldán C, Gutiérrez-Castrellón P,Coria-Jiménez R, dkk. Peradangan sistemik, disfungsi endotel, dan aktivasi pada anak-anak yang sehat secara klinis yang terpapar polutan udara. Menghirup Toksikol. 2008c;20:499–506. https://doi.org/10.1080/08958370701864797.

   ---

   For more information:1950477648nn@gmail.com