CAR-neutrofil Dimediasi Pengiriman Nanodrug Responsif Lingkungan Mikro Tumor Untuk Kemo-imunoterapi Glioblastoma

Glioblastoma (GBM) adalah salah satu tumor padat paling agresif dan mematikan pada manusia. Meskipun terapi yang manjur, seperti sel T reseptor antigen chimeric (CAR) dan kemoterapi, telah dikembangkan untuk mengobati berbagai jenis kanker, efektivitasnya dalam pengobatan GBM sebagian besar terhambat oleh penghalang darah-otak dan penghalang darah-otak-tumor. Neutrofil manusia secara efektif melintasi hambatan fisiologis dan menunjukkan kekebalan efektor terhadap patogen, tetapi umur pendek dan resistensi terhadap pengeditan genom neutrofil primer telah membatasi penerapannya secara luas dalam imunoterapi. Di sini kami merekayasa sel induk berpotensi majemuk manusia secara genetis dengan knock-in gen yang dimediasi CRISPR/Cas9-untuk mengekspresikan berbagai konstruksi CAR anti-GBM dengan domain pensinyalan spesifik T CD3ζ atau spesifik neutrofil. CAR-neutrofil dengan aktivitas anti-tumor terbaik diproduksi untuk secara spesifik dan non-invasif mengirimkan dan melepaskan obat nano yang responsif terhadap lingkungan mikro tumor untuk menargetkan GBM tanpa perlu menginduksi peradangan tambahan di lokasi tumor. Kombinasi kemo-imunoterapi ini menunjukkan aktivitas anti-GBM yang unggul dan spesifik, mengurangi pemberian obat yang tidak tepat sasaran, dan memperpanjang umur tikus betina yang mengandung tumor. Bersama-sama, sistem penghantaran obat CAR-neutrofil biomimetik ini merupakan platform yang aman, ampuh, dan serbaguna untuk mengobati GBM dan kemungkinan penyakit mematikan lainnya.

Manfaat cistanche tubulosa-Antitumor

Glioblastoma (GBM) ditandai dengan angka kematian yang tinggi, masa hidup yang singkat, dan prognosis yang buruk dengan kecenderungan kekambuhan yang tinggi1,2. Kemanjuran terapeutik dari pembedahan dan obat-obatan kemo terutama terhambat oleh struktur otak halus dan penghalang darah-otak fisiologis (BBB) ​​atau penghalang darah-otak-tumor (BBTB)3-5. Khususnya, pemberian obat ke sistem saraf pusat (SSP) untuk mengobati tumor otak sangatlah menantang:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

Imunitas dan plastisitas bawaan neutrofil terhadap berbagai jenis kanker12-16, termasuk GBM, kurang dieksplorasi dibandingkan penerapannya sebagai pembawa sel dalam pemberian obat8-10. Sirkulasi neutrofil dalam darah menjadi rumah bagi lingkungan mikro tumor hipoksia (TME), di mana mereka menjadi neutrofil terkait tumor heterogen (TAN), sebuah komponen penting dari TME imunosupresif yang berkontribusi terhadap perkembangan kanker dan resistensi terapeutik12,17. Mirip dengan makrofag, fenotip TAN anti-tumor N1 dan pro-tumor N2 ditemukan dalam TME18-21 hipoksia. Berbagai strategi terapi telah dikembangkan untuk menargetkan neutrofil secara langsung dengan fokus pada penipisan atau penghambatan neutrofil12,22, yang mengarah pada beberapa uji klinis (misalnya, penghambat CCR5 Maraviroc di NCT03274804). Dengan demikian, penerapan langsung neutrofil yang tidak diobati sebagai nanocarrier dapat menimbulkan risiko tambahan bagi pasien kanker di mana neutrofil penyelundup obat dapat diprogram ulang menjadi fenotip N2 pro-tumor imunosupresif dalam TME setelah berpindah ke lokasi tumor13,23. Selain itu, aktivitas antitumor intrinsik dari neutrofil naif harus dieksplorasi dan ditingkatkan untuk mencapai kemanjuran terapeutik yang optimal bila digunakan sebagai pembawa obat dalam kombinasi dengan kemoterapi.

Manfaat cistanche tubulosa-memperkuat sistem kekebalan tubuh

Modifikasi reseptor antigen chimeric (CAR) telah secara signifikan meningkatkan aktivitas anti-tumor sel T imun atau sel pembunuh alami (NK)24-27. Namun, kemanjurannya pada tumor padat masih terbatas karena kemampuan perdagangan dan penetrasi tumornya yang relatif rendah. Kehadiran BBB fisiologis dan BBTB semakin menghambat kemanjuran terapi yang muncul terhadap GBM di otak. Kami berspekulasi bahwa kombinasi rekayasa CAR dan neutrofil yang sangat motil mungkin mempertahankan fenotip anti-tumor N1 dan menghasilkan kemanjuran terapi yang sangat baik dalam mengobati GBM. Neutrofil primer berumur pendek dan resisten terhadap pengeditan genom, sehingga membatasi penerapannya dalam imunoterapi terarah CAR. Sel induk berpotensi majemuk manusia (hPSCs), yang lebih mudah diakses untuk penyuntingan gen dan mampu berdiferensiasi menjadi neutrofil secara besar-besaran, dapat menyediakan sumber neutrofil CAR berkualitas tinggi yang tidak terbatas untuk imunoterapi bertarget dalam kondisi bebas xeno yang ditentukan secara kimia29. Neutrofil juga lebih disukai memfagosit patogen mikroba dengan permukaan kasar atau panjang, seperti S. aureus dan E. coli30, yang harus diperhitungkan untuk desain nanopartikel dalam penghantaran obat yang dimediasi neutrofil. Memang, Safari dkk. baru-baru ini melaporkan fagositosis yang lebih disukai pada partikel memanjang yang diberikan secara intravena, tanpa modifikasi permukaan yang rumit, dengan mensirkulasikan neutrofil30. Desain yang mudah dan terinspirasi oleh bioinspirasi dalam nanopartikel yang mengandung obat dapat memaksimalkan pemuatan obat dalam neutrofil dan memungkinkan tingkat terapeutik penghantaran obat di lokasi yang ditargetkan.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>20% obat nano yang diberikan dikirim ke tumor otak melalui neutrofil CAR dibandingkan dengan 1% obat nano gratis. Singkatnya, sistem penghantaran obat CAR-neutrofil biomimetik kami adalah platform yang aman, ampuh, dan serbaguna untuk mengobati GBM dan penyakit mematikan lainnya.

Manfaat cistanche tubulosa-Antitumor

Hasil

Skrining struktur CAR spesifik neutrofil untuk meningkatkan aktivitas anti tumor

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >90%, dan sebagian besar klon yang ditargetkan adalah heterozigot (Gambar Tambahan 1a – d). Ekspresi CAR pada hPSC yang direkayasa selanjutnya dikonfirmasi oleh RT-PCR dan analisis aliran sitometri CLTX-IgG4 (Gambar Tambahan 1e-g). Seperti yang diharapkan, hPSC yang mengekspresikan CAR mempertahankan tingkat ekspresi penanda berpotensi majemuk yang tinggi, termasuk OCT4, SSEA4, dan SOX2 (Gambar Tambahan 1f).

Untuk menghasilkan neutrofil CAR de novo, hPSC yang mengekspresikan CAR pertama-tama dibedakan menjadi hematopoietik multipoten dan kemudian progenitor myeloid dengan pengobatan sitokin spesifik tahap (Gbr. 2c). Penggunaan G-CSF dan agonis asam retinoat AM580 selanjutnya mendorong produksi neutrofil yang kuat36. Mirip dengan rekan-rekan mereka dalam darah tepi (PB), neutrofil CLTX-CAR yang diturunkan dari hPSC menunjukkan morfologi neutrofil yang khas dan penanda permukaan CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b, dan CD18 (Gambar Tambahan 2). Kami selanjutnya menentukan efek ekspresi CAR pada sitotoksisitas anti tumor dari neutrofil yang diturunkan dari hPSC dengan mengkulturkannya dengan sel glioblastoma (GBM) U87MG secara in vitro. Seperti yang diharapkan, neutrofil CLTX-CAR yang diturunkan dari hPSC menunjukkan peningkatan kemampuan membunuh tumor dibandingkan dengan neutrofil PB (Gambar 2d), konsisten dengan pengamatan sebelumnya pada sel CLTX CAR-T . Di antara CAR yang berbeda ini, CAR #1 memediasi aktivitas pembunuhan tumor yang unggul pada neutrofil hPSC. Khususnya, CAR #4 berbasis rantai paling tidak efektif dalam memicu pembunuhan tumor yang dimediasi oleh neutrofil, yang mungkin disebabkan oleh salinan ITAM yang lebih rendah dibandingkan subunit ζ dan ekspresi CAR yang mengandung lebih rendah pada permukaan sel28. Neutrofil melepaskan spesies oksigen reaktif sitotoksik (ROS) dan faktor nekrosis tumor- (TNF-) untuk membunuh sel target. Produksi ROS dan TNF- (Gambar 2e, f) dari neutrofil yang berbeda bertepatan dengan peningkatan sitolisisnya. Seperti yang diharapkan, produksi ROS dan TNF- dari neutrofil yang berbeda setelah dikultur dengan sel glial SVG p12 normal tetap serendah kelompok kontrol negatif (Gambar Tambahan 3a, b). Selain itu, peningkatan sitotoksisitas anti-tumor dari CAR-neutrofil hanya diamati dalam inkubasi bersama dengan sel GBM, termasuk U87MG, GBM43 dewasa primer, dan sel SJ-GBM2 pediatrik (Gambar Tambahan 3c), menunjukkan spesifisitas tinggi dari CLTX kami -MOBIL. Khususnya, neutrofil CAR menunjukkan biokompatibilitas tinggi dengan sel glial SVG p12 normal, hPSCs, dan sel turunan hPSC (Gambar Tambahan 3d), konsisten dengan pengamatan sebelumnya bahwa neutrofil primer yang diinaktivasi tidak membunuh sel-sel sehat . Secara kolektif, neutrofil CAR yang diturunkan dari hPSC, khususnya neutrofil CAR yang mengandung CD3ζ, menunjukkan peningkatan sitotoksisitas anti-tumor dan menghasilkan lebih banyak ROS dan TNF- in vitro, menyoroti potensi mereka dalam imunoterapi yang ditargetkan.

Gambar 1|Skema peningkatan kemanjuran anti-glioblastoma menggunakan imunoterapi kombinasi CAR-neutrofil dan obat nano yang responsif terhadap lingkungan mikro tumor. Sel induk berpotensi majemuk manusia direkayasa dengan CAR dan dibedakan menjadi CAR-neutrofil yang diisi dengan nanopartikel silika kasar (SiO2 NPs) yang mengandung tirapazamine penargetan hipoksia (TPZ) atau obat lain, sebagai imunokemoterapi ganda. b CAR-neutrophil@R-SiO2- TPZ NP yang diberikan secara sistemik pertama-tama menyerang sel tumor normoksik eksternal dengan membentuk sinapsis imunologis dan membunuh sel tumor melalui fagositosis. Setelah apoptosis, CAR-neutrofil kemudian dapat melepaskan R-SiO2-TPZ NP, yang diambil alih oleh sel tumor. Setelah itu, produk nano merespons lingkungan mikro tumor hipoksia dan secara efektif membunuh sel tumor. TEOS tetraetil ortosilikat, BTES bis[3-(trietoksisilil) propil] tetrasulfida, TPZ tirapazamine, BTZ benzotriazinil.

CAR-neutrofil mempertahankan aktivitas anti-tumor yang unggul di bawah lingkungan mikro tumor imunosupresif

Mirip dengan makrofag, fenotip anti-tumor N1 dan pro-tumor N2 dari neutrofil terkait tumor ditemukan dalam lingkungan mikro tumor imunosupresif17. Neutrofil N2 pro-tumor memainkan peran penting dalam angiogenesis tumor, metastasis, dan imunosupresi, tetapi penargetan terapi jenis sel ini merupakan tantangan.

Daripada menggunakan strategi penipisan sistemik22, di sini kami mengevaluasi potensi rekayasa CAR dalam mempertahankan fenotip neutrofil anti-tumor. Neutrofil yang diturunkan dari CAR hPSC dan PB diobati dengan hipoksia (3% O2) dan TGF, yang berkontribusi terhadap imunosupresi lingkungan mikro tumor, untuk menilai aktivitas pembunuhan tumor yang berkelanjutan. Sementara neutrofil PB menunjukkan penurunan sitolisis secara signifikan terhadap sel-sel GBM dalam kondisi imunosupresif, neutrofil CAR mempertahankan aktivitas pembunuhan tumor yang tinggi (Gambar Tambahan 4a). Pengamatan serupa juga dilakukan pada pelepasan TNF dan generasi ROS (Gambar Tambahan 4b, c) dari neutrofil PB atau CAR dalam kondisi imunosupresif dan normal. Untuk mengkonfirmasi lebih lanjut fenotip neutrofil dalam kondisi hipoksia dan TGF, kami mengukur ekspresi N1-iNOS spesifik dan N2- N2-arginase spesifik pada neutrofil yang diisolasi dengan flow cytometry (Gambar Tambahan. 4d–f). Dibandingkan dengan normoksia, hipoksia imunosupresif, dan TGF secara signifikan menurunkan tingkat ekspresi iNOS dan meningkatkan kadar arginase pada neutrofil PB, sedangkan neutrofil CAR mempertahankan tingkat ekspresi iNOS yang tinggi. Penelitian sebelumnya menunjukkan aktivasi jalur pensinyalan Syk-Erk mengarah pada produksi ROS39-42. Oleh karena itu, kami mendeteksi dan membandingkan aktivasi Syk-Erk pada neutrofil yang tidak dimodifikasi dan neutrofil CAR, dan hasil kami menunjukkan aktivasi jalur Syk-Erk yang jauh lebih tinggi pada neutrofil CAR di bawah hipoksia (Gambar Tambahan 5a – d), yang mungkin mempertahankan produksi ROS neutrofil CAR yang tidak berubah di bawah hipoksia. Secara keseluruhan, CAR-neutrofil mempertahankan fenotip anti-tumor dan mempertahankan aktivitas anti-tumor yang tinggi di bawah lingkungan mikro tumor yang meniru kondisi in vitro, menyoroti potensi mereka dalam imunoterapi yang ditargetkan.

Gambar 2|Skrining struktur reseptor antigen chimeric (CAR) spesifik neutrofil dengan peningkatan aktivitas antitumor yang dimediasi neutrofil. skema berbagai struktur CAR. b Skema konstruksi CAR #1 dan strategi knock-in yang ditargetkan di lokus pelabuhan aman sel induk berpotensi majemuk manusia (hPSC) AAVS1. Panah vertikal menunjukkan sgRNA penargetan AAVS1. Panah horizontal merah dan biru masing-masing menunjukkan primer untuk menguji efisiensi penargetan dan homozigositas. HDR: perbaikan rekombinasi homolog. c Skema diferensiasi neutrofil yang dioptimalkan dari hPSC dalam kondisi yang ditentukan secara kimia. d Uji sitotoksisitas terhadap sel glioblastoma U87MG dilakukan pada rasio target neutrofil-tumor yang berbeda menggunakan neutrofil yang ditunjukkan. Data direpresentasikan sebagai rata-rata ± SD dari lima ulangan biologis independen, uji-t Student dua sisi. Generasi spesies oksigen reaktif (ROS) (e) dan analisis ELISA pelepasan TNF (f) dari neutrofil yang berbeda setelah dikultur dengan sel U87MG ditentukan. n=5 sampel yang independen secara biologis. Data direpresentasikan sebagai mean ± SD, uji-t Student dua sisi. Data sumber disediakan sebagai file Data Sumber.

Persiapan dan karakterisasi neutrofil CAR hPSC yang diisi dengan nanopartikel SiO2 yang mengandung tirapazamine (TPZ)

Neutrofil PB telah digunakan sebagai pembawa seluler untuk mengirimkan pencitraan dan obat terapeutik ke dalam tumor otak8-10, meskipun infiltrasi neutrofil yang ditargetkan memerlukan peradangan yang disebabkan oleh pembedahan atau cahaya dan pemberian obat yang tidak tepat sasaran mungkin menjadi perhatian11. Untuk lebih meningkatkan aktivitas antitumor neutrofil CAR, kami menyiapkan nanopartikel silika (SiO2-NP) dengan permukaan kasar atau halus untuk memuat obat kemoterapi atau radiasi ke dalam neutrofil. Gambar mikroskop elektron transmisi (TEM) menunjukkan bahwa kedua nanopartikel SiO2 tersebar dengan baik dan menunjukkan morfologi bola dengan ukuran seragam (Gambar 3a, Gambar Tambahan 6a). Analisis distribusi komposisi melalui pemindaian TEM (STEM) dengan spektroskopi sinar-X (EDS) terdispersi energi menunjukkan bahwa unsur sulfur (S) terdistribusi secara merata dalam seluruh nanopartikel SiO2 kasar (R-SiO2) (Gbr. 3b). Dengan menggunakan isoterm adsorpsi-desorpsi nitrogen (N2) dan analisis distribusi ukuran pori yang sesuai, ukuran pori NP R- dan SSiO2 diukur masing-masing sebagai 25 nm dan 35 nm (Gambar 3c, Gambar Tambahan 6b). Mengingat luas permukaan yang tinggi dan ukuran pori yang besar, obat terapeutik dapat secara efektif dimasukkan ke dalam NP R dan S-SiO2, seperti yang dicontohkan oleh tirapazamine pro-obat yang responsif terhadap hipoksia (TPZ) (Gambar 3d, Gambar Tambahan. 6c) . Setelah pemuatan TPZ, perubahan signifikan tidak diamati pada dispersi, morfologi, dan ukuran R-SiO2-TPZ menggunakan TEM dan analisis hamburan cahaya dinamis (Gambar Tambahan 6d, e). Ikatan tetra-sulfida yang dimasukkan ke dalam NP R-SiO2 sensitif terhadap lingkungan reduktif dan dapat dengan cepat terdegradasi oleh banyaknya glutathione (GSH) yang ada di dalam sel tumor43. Kami selanjutnya menentukan degradabilitas responsif GSH dari NP R-SiO2-TPZ dengan adanya 10 mM, 1 mM, dan 10 μM GSH, yang masing-masing sama dengan kondisi intraseluler sel kanker, sel normal, dan lingkungan ekstraseluler43. Setelah pengobatan 10 mM GSH, struktur bola awal NP R-SiO2-TPZ rusak parah setelah 24 jam (Gambar Tambahan 6f, g). Partikel nano benar-benar hancur menjadi puing-puing kecil setelah 48 jam, menghasilkan pelepasan TPZ dengan cara yang responsif terhadap GSH (Gbr. 3e). Puing-puing NP R-SiO2 tidak menyebabkan sitotoksisitas yang signifikan pada sel yang diuji secara in vitro (Gambar Tambahan 6h), yang menunjukkan keamanan relatif dari NP R-SiO2.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Meningkatkan Imunitas

【Minta lebih lanjut】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikasi WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Kami selanjutnya mengevaluasi kelayakan penggunaan NP SiO2-TPZ untuk memasukkan obat terapeutik ke dalam CAR-neutrofil sebagai kemoimunoterapi kombinasi untuk mencapai peningkatan kemanjuran terapeutik. Setelah sentrifugasi, kami mengukur serapan seluler NP SiO2-TPZ oleh neutrofil menggunakan mikroskop fluoresensi dan analisis aliran sitometri (Gambar 3f, g), dan mendeteksi serapan seluler NP R-SiO2-TPZ yang lebih signifikan dibandingkan S-SiO2– TPZ NP oleh neutrofil. Kandungan Si seluler dalam neutrofil diukur sebagai 11,3 dan 19,1 ng Si/ug protein untuk SiO2 halus dan kasar (Gambar 3h), masing-masing, dengan spektrometri massa plasma berpasangan induktif (ICP-MS). Mengingat kapasitas pemuatan neutrofil yang tinggi, NP R-SiO2 – TPZ digunakan untuk percobaan selanjutnya. Kami kemudian berusaha menguji fungsi fisiologis neutrofil CAR setelah memuat NP R-SiO2-TPZ. Tidak ada perubahan yang diamati dalam viabilitas sel (Gambar 3i, Gambar Tambahan. 6i), kemampuan migrasi transwell (Gambar 3j), kemotaksis, dan kecepatan yang sesuai (Gambar 3k, l) dari CAR-neutrofil sebelum atau setelah memuat R-SiO2 –TPZ NP, menunjukkan biokompatibilitasnya yang tinggi. Analisis pemuatan obat nano yang bergantung pada waktu juga dilakukan dan konten pemuatan maksimum dicapai pada 1 jam setelah inkubasi sel-NP (Gambar Tambahan 7a). Lebih dari 95% CAR-neutrofil berhasil dimuat dengan NP R-SiO2-TPZ (Gambar Tambahan 7b). Tingkat ekspresi CD11b, protein permukaan neutrofil yang memediasi fungsi adhesi dan migrasi pada stimulasi molekul inflamasi, tidak berubah pada CAR-neutrofil dengan atau tanpa pemuatan R-SiO2-TPZ (Gambar Tambahan 7c, d). Spesies oksigen superoksida atau reaktif (ROS) dilepaskan dari neutrofil aktif untuk membunuh mikroba dan sel tumor44. Seperti yang diharapkan, pembentukan ROS oleh CAR-neutrofil meningkat secara signifikan setelah pengobatan N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP), dan perbedaan signifikan tidak teramati dalam produksi ROS oleh CAR-neutrofil sebelum dan sesudah memuat R-SiO2- TPZ (Gbr. 3m). Secara keseluruhan, data kami menunjukkan bahwa neutrofil CAR yang mengandung R-SiO2-TPZ mempertahankan aktivitas fisiologis neutrofil tipe liar dan dapat secara aktif bermigrasi menuju rangsangan inflamasi, menyoroti potensi mereka dalam kemoimunoterapi kanker yang ditargetkan.

CAR-neutrofil yang diisi dengan nanopartikel R-SiO2-TPZ secara efektif membunuh sel glioblastoma

Kami selanjutnya mengevaluasi efek R-SiO2-TPZ pada kemampuan membunuh tumor neutrofil CAR. Interaksi intim efektor-target merupakan prasyarat untuk sitolisis yang dimediasi neutrofil. Seperti yang diharapkan, CAR-neutrophils@R-SiO2-TPZ membentuk sinapsis imun dengan sel tumor dalam waktu 2 jam dan menunjukkan jumlah interaksi target efektor yang serupa dengan CAR-neutrofil bebas obat (Gambar 4a, Gambar Tambahan 8) . Khususnya, tidak ada interaksi yang dapat diamati yang ditemukan antara CAR-neutrophils@RSiO2-TPZ dan sel somatik non-kanker (Gambar Tambahan 8), menyoroti kekhususan CLTX-CAR terhadap tumor otak. Lebih lanjut, NP R-SiO2-TPZ dilepaskan dari neutrofil ke dalam media kultur (Gambar Tambahan 9a, b) 12 jam setelah kultur bersama dan memasuki sel tumor yang tersisa (Gambar 4a). Dua puluh empat jam setelah ko-inkubasi neutrofil CAR yang diisi SiO2-TPZ NP dengan sel tumor, hingga 95% sel tumor mengandung NP R-SiO2-TPZ (Gambar 4a, Gambar Tambahan 9c), menunjukkan keberhasilan transport cascade yang melibatkan neutrofil pembawa yang mengerahkan fungsi sel efektornya dan menjalani apoptosis, sehingga secara pasif melepaskan NP R-SiO2-TPZ ke sel tumor target45. Kami juga memvalidasi fungsi responsif hipoksia dan sitotoksisitas TPZ pro-obat dalam sel tumor dengan analisis spektroskopi resonansi paramagnetik elektron (EPR) terhadap pembentukan radikal dari TPZ (Gambar Tambahan 9d) dan analisis aliran sitometri TOPRO-3 pada tumor sel (Gambar Tambahan 9e) di bawah hipoksia dan normoksia. Untuk menentukan sitolisis neutrofil CAR yang mengandung R-SiO2-TPZ NP, kami menerapkan model penantang tumor normoxia-hipoksia in vitro (Gbr. 4b). Dua puluh empat jam setelah kultur normoksik, CAR-neutrofil yang diisi dengan R-SiO2-TPZ NP atau tidak menunjukkan sitotoksisitas anti-tumor yang serupa (Gambar 4c), dan keduanya lebih tinggi dibandingkan dengan PB-neutrofil yang diisi dengan R -SiO2-TPZ NP atau tidak dan R-SiO2- NP TPZ saja. Peningkatan sitotoksisitas ini terutama disebabkan oleh peningkatan kemampuan neutrofil dalam menargetkan tumor setelah rekayasa CAR. Setelah tambahan 12 dan 24- jam kultur hipoksia dengan sel tumor, R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrofil menunjukkan kemampuan anti-tumor yang unggul dibandingkan dengan kelompok lain (Gbr. 4d, e). Selain itu, neutrofil CAR yang dimuat dengan R-SiO2-TPZ NP menunjukkan sitolisis yang sangat baik terhadap sel tumor segar yang diunggulkan kembali (Gambar 4f), yang menunjukkan kemampuan anti-tumor dari R-SiO2-TPZ yang dilepaskan nanopartikel setelah apoptosis neutrofil.

Kami kemudian melakukan analisis sekuensing RNA (RNA-seq) pada sel tumor untuk menjelaskan mekanisme molekuler potensial yang mendasari peningkatan sitolisis anti-tumor neutrofil dengan ekspresi CAR dan R-SiO2-TPZ NP. Analisis ekspresi gen menunjukkan bahwa dibandingkan dengan kontrol dan R-SiO2-TPZ NP, CAR-neutrofil yang dimuat dengan atau tanpa R-SiO2-TPZ NP secara signifikan menurunkan ekspresi gen sitoplasma dan membran dalam sel tumor ( Gambar Tambahan 10a, Gambar 4g), yang selanjutnya mendukung fagositosis sel tumor pada kultur bersama. Meskipun semua kelompok eksperimen meningkatkan stres oksidatif seluler dalam sel tumor, neutrofil CAR yang mengandung R-SiO2-TPZ mengungguli kelompok lain dalam memicu sinyal stres oksidatif. Selain itu, neutrofil CAR yang mengandung R-SiO2-TPZ secara signifikan mendorong apoptosis dan menurunkan proliferasi sel tumor. Untuk lebih memahami peningkatan aktivitas anti-tumor dari neutrofil CAR yang mengandung R-SiO2-TPZ, kami menerapkan sitokalasin D penghambat fagositosis dan pemulung spesies oksigen reaktif (ROS) N-asetil-sistein (NAC) dan penghambat ROS GSK2795039 untuk kultur tumor-neutrofil. Sitolisis sel tumor oleh CAR-neutrofil berkurang secara signifikan dengan 5 μM sitokalasin D, 5 mM NAC, dan 100 nM GSK2795039 (Gambar Tambahan 10b, c), menunjukkan peran penting fagositosis dan ROS dalam sel tumor yang dimediasi neutrofil CAR. pembunuhan. Sisa 40%-50% lisis sel tumor dengan adanya neutrofil dan NAC atau GSK2795039 menunjukkan keterlibatan mekanisme independen ROS dalam pembunuhan tumor yang dimediasi oleh neutrofil yang patut diselidiki lebih lanjut.

Gambar 3|Persiapan dan karakterisasi neutrofil CAR hPSC yang diisi dengan nanopartikel SiO2 yang mengandung tirapazamine (TPZ). a – e Gambar pemetaan unsur mikroskop elektron transmisi (TEM) (a) dan spektroskopi dispersif energi (EDS) (b) dari nanopartikel SiO2 kasar ditampilkan. c Isoterm adsorpsi-desorpsi nitrogen nanopartikel SiO2 kasar beserta plot distribusi ukuran pori Barrett-JoynerHalenda (BJH) ditampilkan. Rangkap tiga biologis dilakukan secara mandiri. Konten pemuatan TPZ dalam nanopartikel SiO2 (d) dan glutathione (GSH)--pelepasan TPZ responsif (e) diukur pada waktu yang ditentukan. n=3 sampel yang independen secara biologis. Analisis varians satu arah (ANOVA) untuk (e). Gambar fluoresensi (f) dan analisis aliran sitometri (g) neutrofil yang diisi dengan SiO2-TPZ halus dan kasar. Rangkap tiga biologis dilakukan secara mandiri. h Konten SiO2 Seluler dalam neutrofil CAR yang diturunkan dari hPSC diukur. n=5 sampel yang independen secara biologis, uji-t Student dua sisi. Viabilitas seluler (i), n=3 sampel yang independen secara biologis, transmigrasi (j), n=5 sampel yang independen secara biologis, kemampuan chemoattraction (k, l), n=20 sampel yang independen secara biologis, dan Kemampuan menghasilkan ROS (m) dari neutrofil CAR turunan hPSC yang dimuat dengan atau tanpa SiO2-TPZ kasar ditunjukkan, n=5 sampel independen secara biologis, uji-t Student dua sisi. PMA: phorbol miristat asetat. Semua data dalam gambar ini direpresentasikan sebagai mean ± SD. Data sumber disediakan sebagai file Data Sumber.

Evaluasi fungsional CAR-neutrofil yang diisi dengan obat nano menggunakan model glioblastoma biomimetik in vitro

Untuk menilai lebih lanjut aktivitas neutrofil CAR yang mengandung R-SiO2-TPZ NP, kami menerapkan model tumor penghalang darah-otak (BBB) ​​berbasis transwell menggunakan sel endotel mikrovaskuler otak manusia (Gambar 5a, Gambar Tambahan .11a). Seperti yang diharapkan, neutrofil CAR yang mengandung R-SiO2-TPZ NP menunjukkan kemampuan transmigrasi yang sangat baik di seluruh model BBB in vitro (Gambar 5b), secara efektif membunuh sel tumor yang ditargetkan setelah transmigrasi dalam kondisi normoksik dan hipoksia (Gbr. 5c , d), dan melepaskan lebih banyak sitokin inflamasi (Gambar 5e) yang dapat menarik sel efektor lain untuk membunuh sel tumor. Selain itu, neutrofil CAR tidak secara signifikan mempengaruhi kelangsungan hidup sel endotel setelah transmigrasi (Gambar Tambahan 11b). R-SiO2-neutrofil CAR yang dimuat TPZ NP mempertahankan kemampuan transmigrasi yang sangat baik selama percobaan transmigrasi kedua (Gambar 5f) dan kemampuan anti-tumor yang unggul dibandingkan dengan kelompok lain (Gambar 5g). Model spheroid tumor tiga dimensi (3D) kemudian digunakan untuk mengevaluasi kapasitas penetrasi tumor dari R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrofil (Gbr. 5h). CAR-neutrofil secara bertahap bermigrasi menuju pusat spheroid tumor dan didistribusikan secara merata dalam spheroid setelah 8 jam inkubasi (Gambar 5i). Ko-lokalisasi tingkat tinggi antara neutrofil CAR dan R-SiO2-TPZ NP diamati (Gambar Tambahan 12a – c), menunjukkan bahwa R-SiO2-TPZ NP dienkapsulasi secara stabil dalam CAR -neutrofil selama infiltrasi tumor sebelum sitolisisnya. Tanpa pengiriman yang dimediasi neutrofil, R-SiO2-TPZ NP hanya ditemukan pada lapisan luar spheroid tumor. Dibandingkan dengan R-SiO2-TPZ NP dan CAR-neutrofil, R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR neutrofil menunjukkan sitolisis antitumor yang unggul dalam model tumor 3D (Gbr. 5j). NP CAR-neutrofil @R-SiO2 juga dapat digunakan untuk mengirimkan obat lain, termasuk temozolomide klinis (TMZ) dan JNJ- 64619187, ke dalam model tumor 3D dan secara efisien membunuh sel GBM (Gambar Tambahan 12d – f). Secara bersama-sama, neutrofil CAR kombinasi dan obat nano menunjukkan aktivitas anti-tumor yang sangat baik dalam lingkungan mikro tumor biomimetik yang meniru kondisi in vitro, menyoroti potensi terapeutik dari kemoimunoterapi berbasis neutrofil kombinasi.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Distribusi in vivo nanopartikel R-SiO2-TPZ yang dikirimkan neutrofil CAR

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >20% dari obat nano yang diberikan dikirimkan ke tumor otak melalui CAR-neutrofil dibandingkan dengan 1% oleh obat nano gratis yang konsisten dengan laporan sebelumnya6. Pengiriman NP R-SiO2-TPZ yang ditargetkan ke otak inang melalui BBB oleh CAR-neutrofil juga dikonfirmasi oleh analisis histologi (Gambar 6d). Sebaliknya, R-SiO2-TPZ NP sendiri sebagian besar terakumulasi di hati dan limpa. Secara kolektif, data kami menunjukkan peningkatan penyampaian NP R-SiO2-TPZ yang ditargetkan oleh neutrofil CAR tanpa perlu menginduksi peradangan tambahan di lokasi tumor, sehingga menyoroti kelayakan dan keamanan kemoimunoterapi berbasis neutrofil dalam pengobatan kanker.

Kemoimunoterapi kombinasi CAR-neutrofil dan nanopartikel R-SiO2-TPZ menunjukkan aktivitas anti glioblastoma yang sangat baik secara in vivo

Untuk menentukan kemanjuran terapeutik neutrofil CAR yang mengandung R-SiO2-TPZ NP, model glioblastoma xenograft in situ dibuat pada tikus NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) menggunakan sel U87MG yang mengekspresikan luciferase. Tikus yang mengandung tumor diberikan secara intravena 5 × 106 neutrofil setiap minggu (Gambar 7a), dan beban tumor pada inang diukur dan dikuantifikasi (Gambar 7b, c). Dibandingkan dengan tikus yang diobati dengan PBS atau PB-neutrofil, pengobatan dengan CAR-neutrofil dan CAR NP secara efektif memperlambat pertumbuhan tumor. CAR neutrofil @R-SiO2 – TPZ NP menunjukkan sitotoksisitas anti tumor yang jauh lebih tinggi dibandingkan kelompok eksperimen lainnya. Sebaliknya, neutrofil PB secara signifikan mendorong pertumbuhan tumor di otak, yang mengakibatkan kematian tikus yang mengandung tumor pada hari ke 23 (Gambar 7d), menunjukkan bahwa neutrofil yang tidak direkayasa dapat menimbulkan risiko tambahan. Kami selanjutnya mengukur pelepasan sitokin manusia dalam plasma kelompok tikus percobaan yang berbeda (Gambar 7e). Semua kelompok eksperimen non-PBS menghasilkan TNF dan IL-6 yang terdeteksi dalam plasma dari hari ke-5 hingga hari ke-26, yang menunjukkan adanya aktivasi neutrofil manusia pada stimulasi tumor. Konsisten dengan tingkat pertumbuhan tumor yang lebih tinggi, neutrofil yang tidak dimodifikasi secara bertahap melepaskan lebih banyak IL-6 dan TNF , yang dapat menyebabkan sindrom pelepasan sitokin pada pasien dan memerlukan studi keamanan yang lebih mendalam dengan penghambat IL-646,47 . Khususnya, NP CAR-neutrofil @RSiO2 – TPZ menunjukkan penurunan kemampuan produksi sitokin di kemudian hari (hari ke-19 dan hari ke-26), menunjukkan potensi risiko rendah sindrom pelepasan sitokin pada pasien yang diobati dengan kemoimunoterapi berbasis CAR-neutrofil. Biokompatibilitas kombinasi CAR-neutrofil dan NP R-SiO2-TPZ dievaluasi melalui pengukuran berat badan mingguan dan pemantauan perubahan patologis pada organ utama tikus. Tidak ada perbedaan yang diamati pada berat badan antara tikus yang diobati dengan CAR-neutrofil NP dan kelompok eksperimen lainnya (Gambar 7f), yang menunjukkan toksisitas sistemik minimal dan biokompatibilitas yang sangat baik dari NP CAR-neutrofil @ R-SiO2 – TPZ dalam 28 hari pengobatan. Analisis histologis pada organ utama yang diiris dari tikus pada hari ke 30 menunjukkan bahwa tikus yang diobati dengan CAR-neutrophils@R-SiO2–TPZ NP tidak menyebabkan kelainan atau kerusakan organ yang nyata pada jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal (Gambar Tambahan. 13), yang selanjutnya menegaskan keamanan kombinasi neutrofil CAR dan NP R-SiO2 – TPZ.

Gambar 4|CAR-neutrofil yang diisi dengan nanopartikel R-SiO2-TPZ secara efektif membunuh sel glioblastoma. Gambar representatif dari sinapsis imunologis yang ditunjukkan oleh akumulasi F-aktin terpolarisasi pada antarmuka antara CAR-neutrofil dan sel tumor pada 6, 12, dan 24 jam ditunjukkan. Nanopartikel R-SiO2-TPZ yang dilepaskan dari CAR-neutrofil setelah fagositosis sel tumor diambil oleh sel tumor. Rangkap tiga dilakukan secara mandiri. b Skema uji sitotoksisitas anti tumor yang dimediasi neutrofil. Sitotoksisitas terhadap sel glioblastoma U87MG dilakukan pada rasio target neutrofil-tumor yang berbeda menggunakan neutrofil yang ditunjukkan pada 24 jam (c), 36 jam (d), 48 jam (e), dan 72 jam (f). n=3 sampel yang independen secara biologis. Data direpresentasikan sebagai mean ± SD, analisis varians satu arah (ANOVA). g Analisis sekuensing RNA massal dilakukan pada sel U87MG dalam berbagai kondisi. Peta panas menunjukkan tingkat ekspresi sitoplasma, membran, stres oksidatif, apoptosis, dan gen terkait proliferasi terpilih dalam sel glioblastoma yang ditunjukkan. n=2 sampel yang independen secara biologis. Data sumber disediakan sebagai file Data Sumber.

Gambar 5|Evaluasi fungsional CAR-neutrofil yang dimuat dengan nanopartikel R-SiO2-TPZ menggunakan model biomimetik glioblastoma (GBM) in vitro. skema model tumor GBM in vitro kami dengan penghalang darah-otak (BBB), yang terdiri dari sel-sel endotel pada membran sisipan sel dan sel-sel tumor di bagian bawah transwell yang sama. b Analisis migrasi transwell neutrofil pada 12 jam ditampilkan. Sitotoksisitas anti-GBM dari neutrofil yang diindikasikan pada 24 jam (c) dan 36 jam (d) diukur dan dikuantifikasi. e Analisis ELISA terhadap IL-6 dan TNF yang dilepaskan dari neutrofil terindikasi pada 36 jam telah dilakukan. f Migrasi kedua neutrofil berbeda pada 48 jam ditampilkan. g Sitotoksisitas anti-GBM dari neutrofil yang diindikasikan pada 60 jam diukur dan dikuantifikasi. h – j Skema model tumor tiga dimensi (3D) yang diinfiltrasi neutrofil secara in vitro ditunjukkan pada (h). Gambar fluoresen yang representatif dari neutrofil yang diinfiltrasi dalam model tumor 3D ditunjukkan. DAPI digunakan untuk mewarnai inti sel dan CD45 digunakan untuk mewarnai neutrofil. Bilah skala, 200 μm. Rangkap tiga biologis dilakukan secara mandiri. j Kemampuan membunuh tumor dari neutrofil yang diindikasikan diukur dan dikuantifikasi menggunakan kit sitotoksisitas. Data direpresentasikan sebagai rata-rata ± SD dari lima ulangan biologis independen, analisis varians satu arah (ANOVA). Data sumber disediakan sebagai file Data Sumber.

Sementara NP CAR-neutrofil@R-SiO2–TPZ secara signifikan memperlambat pertumbuhan tumor pada tikus xenograft, perbedaan dalam kelangsungan hidup hewan pada kelompok eksperimen NP CAR-neutrofil, NP SiO2–TPZ, dan NP CAR-neutrofil@R-SiO2–TPZ tidak signifikan. (p > 0.05), yang kemungkinan disebabkan oleh kematian neutrofil berumur pendek selama persiapan dan injeksi sel. Kami selanjutnya fokus pada ketiga kelompok ini dan menentukan apakah pengurangan waktu persiapan sel dan peningkatan dosis CAR-neutrofil dan obat nano akan membuat perbedaan dalam kelangsungan hidup hewan (Gambar 7g). Ketika diberikan secara sistemik sebanyak 6 kali, NP CAR-neutrofil@R-SiO2–TPZ mengungguli dua kelompok lainnya dalam memperpanjang umur tikus yang mengandung tumor (Gambar 7h), sedangkan perbedaan kelangsungan hidup hewan pada kelompok CAR-neutrofil dan SiO2– NP TPZ tetap tidak signifikan. Meskipun kurva kelangsungan hidup serupa dari kelompok R-SiO2- TPZ diamati antara dua penelitian pada hewan independen ini, pengurangan waktu dalam isolasi sel dan persiapan injeksi dari total ~4 jam menjadi 1 jam selama 4 neutrofil pertama dosis menyebabkan peningkatan kelangsungan hidup hewan dalam kelompok CAR-neutrofil sebelum hari ke 32. Secara kolektif, data kami menunjukkan pentingnya persiapan neutrofil dan optimalisasi dosis dalam aplikasi klinis terapi neutrofil di masa depan.

Diskusi

Neutrofil tikus telah terbukti sebagai pembawa yang kuat untuk secara efisien mengirimkan obat nano ke tumor otak pasca operasi yang meradang8,9. Namun, kelayakan dan keamanan penggunaan neutrofil manusia dalam pemberian obat masih sulit dipahami. Jumlah neutrofil tikus yang besar (10 kali lebih tinggi dari jumlah total neutrofil yang bersirkulasi pada tikus11) yang digunakan dalam penelitian ini untuk mencapai manfaat terapeutik selanjutnya dapat menghambat penerjemahan klinisnya karena ekstraksi sejumlah besar neutrofil dari pasien kanker dapat menyebabkan neutropenia dan pose. risiko lainnya. Untuk mengatasi tantangan ini, kami memanfaatkan kekuatan hPSC yang memperbaharui diri dalam memperoleh neutrofil manusia de novo yang tidak terbatas29. Kami mengembangkan sistem penghantaran obat yang dimediasi neutrofil yang terinspirasi oleh bioinspirasi dengan rekayasa CAR29 dan menggunakan neutrofil CAR manusia yang direkayasa sebagai pembawa nano dengan aktivitas antitumor yang luar biasa. NP SiO2 kasar bekerja lebih baik daripada NP SiO2 halus pada pembawa CAR-neutrofil, konsisten dengan pengamatan sebelumnya bahwa neutrofil lebih suka memfagosit patogen mikroba kasar30. Neutrofil dilaporkan mendorong proliferasi dan perkembangan sel glioma48. Kami mengamati efek pro-tumor serupa dari neutrofil yang tidak dimodifikasi dalam penelitian pada hewan kami, menyoroti perlunya rekayasa CCAR atau modifikasi lain pada neutrofil untuk memastikan keamanannya dalam pemberian obat dan aplikasi terapeutik lainnya. Khususnya, pemberian obat yang dimediasi CAR-neutrofil kami hanya bergantung pada kemampuan penarik kemo asli GBM, namun tidak pada sinyal inflamasi pasca bedah yang diperkuat, menunjukkan spesifisitas tinggi dan potensi terapeutik dari sistem pemberian obat kami dalam memberantas glioma yang menyusup ke dalam. yang tidak bisa dihilangkan dengan operasi. Karena reseksi bedah dan kemoterapi/radioterapi adjuvan adalah intervensi klinis utama untuk GBM12, pengobatan kombinasi dengan nanocarrier neutrofil CAR dan pembedahan/radioterapi dapat mencapai kemanjuran terapeutik yang optimal dan patut diselidiki lebih lanjut. Konstruksi CAR spesifik sel T dan NK telah banyak digunakan untuk meningkatkan aktivitas anti tumor sel T dan NK, namun CAR spesifik neutrofil yang meningkatkan fungsi anti tumor neutrofil belum dijelaskan. Reseptor imun kimerik CD4ζ dan CD4 sebelumnya dilaporkan meningkatkan sitolisis neutrofil terhadap sel yang ditransfusikan HIV secara in vitro. Namun, efisiensi lisis hanya ~10% pada rasio efektor-target (E:T) 10:128. Fc RIIA (CD32a) adalah reseptor transmembran rantai tunggal dengan afinitas rendah untuk IgG monomer yang sangat diekspresikan dalam neutrofil (30,000 hingga 60,000 molekul/sel31), dan ligasinya menginduksi Fc - fungsi yang bergantung pada neutrofil, seperti pelepasan isi granul, mobilisasi Ca2+, sitotoksisitas anti tumor, dan fagositosis49. Mengingat peran penting CD32a dalam aktivasi dan fungsi neutrofil, kami merancang dan menguji konstruksi CAR berbasis CD32a. Namun, hasil kami menunjukkan bahwa CD3ζ memediasi sitolisis secara signifikan lebih baik daripada CD32a ketika diekspresikan dalam neutrofil yang diturunkan dari hPSC, yang mungkin sebagian disebabkan oleh salinan ITAM yang lebih tinggi dalam CD3ζ daripada CD32a: masing-masing tiga dan satu salinan, dan tingkat ekspresi yang lebih tinggi. ζ dibandingkan pada permukaan sel neutrofil28. Seperti CD32a, Fc RIII (CD16b) merupakan reseptor afinitas rendah lainnya untuk IgG monomer dan diekspresikan pada tingkat yang jauh lebih tinggi dibandingkan CD32a pada neutrofil31. Meskipun ikatan silang CD16b hanya menginduksi mobilisasi dan degranulasi Ca2+, namun tidak menginduksi fagositosis dan sitolisis pada neutrofil28,50, penelitian selanjutnya masih menarik untuk melakukan perbandingan sistematis mengenai kemampuan CD3ζ- dan CD16b -CAR dalam memicu dan meningkatkan fungsi anti tumor neutrofil.

Gambar 6|Distribusi in vivo nanopartikel R-SiO2-TPZ (NPs) yang dikirimkan neutrofil CAR. Skema NP Cy5-berlabel CAR neutrofil@R-SiO2 dan NP R-SiO2 yang diberikan secara intravena untuk studi pelacakan sel in vivo. Sel U87MG yang mengekspresikan 5 × 105 luciferase (Luci) ditanamkan secara stereotaktis ke otak depan kanan tikus NRG. Setelah 4 hari, tikus diobati secara intravena dengan PBS, 5 × 106 Cy5-berlabel CAR neutrofil@R-SiO2 NP dan R-SiO2 NP. b Biodistribusi neutrofil Cy5+ yang bergantung pada waktu di seluruh tubuh, otak, dan organ lain ditentukan dan diukur dengan pencitraan fluoresensi pada jam yang ditentukan. c Biodistribusi NP CAR dan NP R-SiO2 pada tikus pada 24 jam pasca injeksi dianalisis dengan spektrometri emisi optik plasma (ICP-OES) yang digabungkan secara induktif berdasarkan elemen Si, dan data dinyatakan sebagai persentase dosis yang disuntikkan per gram jaringan (%ID/g). n=5 sampel yang independen secara biologis. Data direpresentasikan sebagai rata-rata ± SD. Data sumber disediakan sebagai file Data Sumber. d Gambar fluoresensi representatif dari CD45 dan SiO2 dalam xenografts glioblastoma yang diisolasi dari tikus yang mengandung tumor ditunjukkan. Bilah skala, 100 μm. Rangkap tiga biologis dilakukan secara mandiri.

Gambar 7|Aktivitas anti-tumor in vivo dari kombinasi CAR-neutrofil dan nanopartikel R-SiO2-TPZ (NPs) dinilai melalui injeksi intravena. Skema PBS, PB-neutrofil, CAR-neutrofil, dan CAR-neutrofil@ R-SiO2-TPZ NP yang diberikan secara intravena untuk studi pembunuhan tumor in vivo. Sel U87MG yang mengekspresikan 5 × 105 luciferase (Luci) ditanamkan secara stereotaktis ke otak depan kanan tikus NRG. Setelah 4 hari, tikus diobati secara intravena dengan neutrofil yang diindikasikan setiap minggu selama sebulan. Beban tumor yang bergantung pada waktu ditentukan (b) dan diukur (c) dengan bioluminescent imaging (BLI) pada hari-hari yang ditentukan. Data adalah rata-rata ± SD untuk tikus di (b) (n=5), analisis varians satu arah (ANOVA). d Kurva Kaplan-Meier yang menunjukkan kelangsungan hidup kelompok eksperimen yang ditunjukkan (n=5) ditampilkan. Pelepasan faktor nekrosis tumor manusia- (TNF) dan IL-6 dalam darah tepi (e) dan berat badan (f) dari kelompok tikus yang berbeda diukur pada hari yang ditentukan. Data adalah rata-rata ± SD, n=5 sampel yang independen secara biologis. g, h Aktivitas anti-tumor dari peningkatan frekuensi dosis CAR-neutrofil dan RSiO2-TPZ NP dinilai. g Skema CAR-neutrofil yang diberikan secara intravena, R-SiO2-TPZ NP, dan CAR-neutrophil@ R-SiO2-TPZ NP untuk studi pembunuhan tumor in vivo. h Kurva Kaplan-Meier yang menunjukkan kelangsungan hidup kelompok eksperimen yang ditunjukkan ditunjukkan (n=5). Kurva Kaplan – Meier dianalisis dengan uji log-rank. Data sumber disediakan sebagai file Data Sumber.

Di sini kami juga menyajikan platform pengiriman obat neutrofil hPSC yang modular dan serbaguna yang dapat direkayasa ulang dan disesuaikan di masa depan untuk mendukung upaya berbasis neutrofil lainnya untuk mengobati penyakit manusia lainnya. Pertama, rekayasa CAR lebih mudah diakses di hPSC dibandingkan sel T imun primer dan neutrofil. Ini hanya memerlukan satu kali pengeditan genom untuk mencapai ekspresi berbagai CAR yang stabil dan homogen29. Selain CAR CLTX, kami juga membuat jalur hPSC stabil yang mengekspresikan anti-fluorescein (FITC) universal atau CAR52 anti-PD-L1, yang keduanya dapat dimanfaatkan untuk mendapatkan nanocarrier CAR-neutrofil penargetan tumor padat universal. Modifikasi genetik lainnya, seperti fibrosis yang menargetkan CAR anti-FAP53, juga dapat dilakukan untuk mengarahkan nanocarrier neutrofil untuk mengobati penyakit degeneratif yang fatal, termasuk trauma otak dan fibrosis jantung. Selain itu, hPSC yang mengekspresikan CAR juga dapat dengan mudah diadaptasi untuk menghasilkan sel CAR-T atau CAR-NK , dan kombinasi imunoterapi ini dengan nanocarrier CAR-neutrofil dapat mencapai manfaat terapeutik anti-tumor yang optimal. Yang terakhir, sistem obat nano responsif tumor glutathione (GSH) kami yang terinspirasi bioinspirasi adalah platform modular dan serbaguna untuk memuat obat kemoterapi atau radioaktif yang menjanjikan ke dalam CAR-neutrofil untuk pemberian obat yang ditargetkan, seperti yang dicontohkan oleh TMZ klinis, JNJ64619187, dan TPZ pro-obat. Penelitian di masa depan mengenai pengujian nanopartikel lain dapat menghasilkan pemuatan obat yang optimal dalam neutrofil dan mencapai kemanjuran terapi in vivo yang maksimal.

Meskipun kami telah mendemonstrasikan konsep terapeutik menggunakan CAR-neutrofil untuk secara spesifik dan efisien memberikan obat kemo pada tumor otak di seluruh BBB, terdapat beberapa keterbatasan dalam penelitian ini. Pertama, inokulasi sel tumor 4-hari mungkin tidak cukup untuk membentuk tumor yang meniru skenario klinis untuk penyelidikan terapeutik, dan penelitian di masa depan dengan periode inokulasi tumor yang berbeda diperlukan untuk merekapitulasi berbagai tahap perkembangan glioblastoma dan respons terapeutik di berbagai negara. pasien54,55. Kedua, tikus yang mengalami imunodefisiensi yang kami gunakan di sini tidak memiliki kekebalan adaptif, dan model praklinis lainnya dengan sistem kekebalan yang utuh, seperti anjing peliharaan dengan glioma spontan, diperlukan untuk menilai keamanan dan kemanjuran neutrofil CAR yang diproduksi secara in vitro dengan lebih baik. Khususnya, profil toksisitas neutrofil CAR di luar target dengan atau tanpa memuat obat nano pada hewan yang diinfus, termasuk sindrom pelepasan sitokin, neurotoksisitas, dan toksisitas di luar tumor sesuai target yang diamati pada sel CAR-T57, diperlukan, meskipun umurnya pendek. dari neutrofil. Meskipun pendekatan yang memungkinkan, seperti rekayasa hPSC donor universal hipoimunogenik dan perpustakaan hPSC homozigot perbankan antigen leukosit manusia (HLA), sudah tersedia untuk menghindari potensi risiko penyakit graft-versus-host (GvHD), model hewan praklinis dengan sistem kekebalan tubuh yang utuh masih diperlukan untuk menilai potensi translasi terapi neutrofil kami. Akhirnya, sitotoksisitas anti-tumor yang terbatas dan perpanjangan umur hewan dari terapi obat nano CAR-neutrofil diamati. Oleh karena itu, eksplorasi obat kemoterapi atau radiosensitizer yang lebih efektif di masa depan, dan terapi kombinasi dengan CAR-T klasik dan reseksi bedah sangat penting untuk mencapai kemanjuran antitumor maksimum dari terapi CAR-neutrofil. Misalnya, penelitian terbaru tentang desain berbasis mekanisme telah menghasilkan obat KL-50 yang lebih efektif yang mengatasi resistensi yang didapat seperti yang diamati pada obat TMZ klinis63 dan dengan demikian dapat dimasukkan ke dalam platform obat nano CAR-neutrofil modular kami untuk potensi kemanjuran terapi yang lebih baik. Memperpanjang umur simpan neutrofil hingga 5 hari melalui pengobatan CLON-G (penghambatan permeabilisasi membran caspases-lisosomal-oksidan-nekroptosis ditambah faktor perangsang koloni granulosit64) dan/atau menggunakan sistem pelepasan obat terkontrol jangka panjang pada CAR-neutrofil juga dapat mencapai kemanjuran anti-tumor in vivo yang berkelanjutan setelah apoptosis neutrofil. Secara kolektif, temuan kami dengan jelas menunjukkan bahwa neutrofil CAR yang mengandung R-SiO2-TPZ dapat mempertahankan fenotip anti-tumor N1 dan secara efisien membunuh sel-sel tumor dalam berbagai kondisi mirip tumor secara in vitro. Neutrofil CAR fungsional juga dapat diproduksi dalam jumlah besar dari hPSC yang direkayasa untuk secara tepat memberikan obat nano yang responsif terhadap lingkungan mikro tumor untuk menargetkan GBM in vivo, yang mengarah ke kemoimunoterapi kombinasi dengan aktivitas anti-GBM yang kuat dan spesifik serta pemberian obat di luar target yang minimal. umur panjang pada tikus yang mengandung tumor.

Referensi

1. Yang F. dkk. Imunoterapi sinergis glioblastoma dengan penargetan ganda IL-6 dan CD40. Nat. Komunitas. 12, 3424 https://doi.org/ 10.1038/s41467-021-23832-3 (2021).

2. Lim, M., Xia, Y., Bettegowda, C. & Weller, M. Keadaan imunoterapi saat ini untuk glioblastoma. Nat. Pendeta Klinik. Onkol. 15, 422–442 (2018).

3. Agliardi, G. dkk. Pengiriman IL-12 intratumoral memberdayakan imunoterapi sel CAR-T dalam model praklinis glioblastoma. Nat. Komunitas. https://doi.org/10.1038/s41467-020-20599-x (2021).

4. Németh, T., Sperandio, M. & Mócsai, A. Neutrofil sebagai target terapi yang muncul. Nat. Penemuan Narkoba Pendeta. https://doi.org/10.1038/s41573-019-0054-z (2020).

5. Subhan, MA & Torchilin, VP Neutrofil sebagai target terapi yang muncul dan alat untuk terapi kanker. Ilmu Kehidupan. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2021.119952 (2021).

6. Cheng, YH, He, C., Riviere, JE, Monteiro-Riviere, NA & Lin, Z. Meta-analisis pengiriman nanopartikel ke tumor menggunakan pendekatan pemodelan dan simulasi farmakokinetik berbasis fisiologis. ACS Nano 14, 3075–3095 (2020).

7. Wilhelm, S. dkk. Analisis pengiriman nanopartikel ke tumor. Nat. Pdt. Mater. 1, 1–12 (2016).

8. Xue, J. dkk. Pemberian obat antikanker yang dimediasi neutrofil untuk menekan kekambuhan glioma ganas pasca operasi. Nat. Nanoteknologi. 12, 692–700 (2017).

9. Wu, M. dkk. Pelacakan pencitraan MR dari neutrofil rekayasa yang dapat diaktifkan oleh peradangan untuk terapi target glioma yang diobati melalui pembedahan. Nat. Komunitas. 9, 1–13 (2018).

10. Chu, D., Dong, X., Zhao, Q., Gu, J. & Wang, Z. Fotosensitisasi priming lingkungan mikro tumor meningkatkan penyampaian nanoterapi melalui infiltrasi neutrofil. Adv. Materi. 29, (2017).

11. Osuka, S. & Van Meir, EG Terapi kanker: Lalu lintas neutrofil dalam obat nano kanker. Nat. Nanoteknologi. 12, 616–618 (2017).

12. Lin, YJ, Wei, KC, Chen, PY, Lim, M. & Hwang, TL Peran neutrofil dalam glioma dan metastasis otak. Depan. imunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2021.701383 (2021).

13. Fridlender, Z. dkk. Polarisasi fenotip neutrofil terkait tumor oleh TGF-beta: "N1" versus "N2" TAN. Sel Kanker (2009).

14. Blaisdell, A. dkk. Neutrofil melawan karsinogenesis epitel uterus melalui debridemen sel tumor hipoksia. Sel Kanker 28, 785–799 (2015).

15. Mahiddine, K. dkk. Meredakan hipoksia tumor melepaskan potensi tumorisidal dari neutrofil. J.Klin. Investasikan 130, 389–403 (2020).

16. Yan, J. dkk. Neutrofil polimorfonuklear manusia secara spesifik mengenali dan membunuh sel kanker. Onkoimunologi 3, e950163 (2014).

17. Penjara, S. dkk. Keanekaragaman dan plastisitas neutrofil dalam perkembangan dan terapi tumor. Nat. Pendeta Kanker 20, 485–503 (2020).

18. Li X. dkk. Kemajuan penelitian tentang sel induk glioma dalam lingkungan mikro imun glioma. Depan. Farmakol. https://doi.org/10. 3389/ffar.2021.750857 (2021).

19. Gieryng A., Pszczolkowska, D., Walentynowicz, KA, Rajan, WD & Kaminska, B. Lingkungan mikro imun glioma. Laboratorium. Selidiki. https://doi.org/10.1038/labinvest.2017.19 (2017).

20. Jung E. dkk. Plastisitas sel tumor, heterogenitas, dan resistensi dalam relung lingkungan mikro yang penting pada glioma. Nat. Komunitas. https://doi.org/10.1038/s41467-021-21117-3 (2021).

21. Dunn GP dkk. Imunoterapi yang muncul untuk glioma ganas: Dari imunogenomik hingga terapi sel. saraf. Onkol. (2020). https://doi.org/10.1093/neuonc/noaa154

22. Yee PP dkk. Ferroptosis yang diinduksi neutrofil meningkatkan nekrosis tumor pada perkembangan glioblastoma. Nat. Komunitas. 11, (2020).

23. Sagiv, JY dkk. Keanekaragaman fenotipik dan plastisitas dalam sirkulasi subpopulasi neutrofil pada kanker. Rep Sel 10, 562–573 (2015).

24. Li, Y., Hermanson, DL, Moriarity, BS & Kaufman, DS Sel pembunuh alami turunan iPSC manusia yang direkayasa dengan reseptor antigen chimeric meningkatkan aktivitas anti tumor. Sel Induk Sel 23, 181–192.e5 (2018).

25. Kim, GB dkk. Interleukin -13 mutan afinitas tinggi yang ditargetkan sel CAR T meningkatkan pengiriman nanopartikel fluoresen biodegradable yang dapat diklik ke glioblastoma. Bioak. Materi. 5, 624–635 (2020).

26. Nguyen, V. dkk. Sistem pengiriman ligan baru untuk memvisualisasikan secara non-invasif dan mengeksploitasi biomarker terbatas tumor IL13R 2 secara terapeutik. saraf. Onkol. 14, 1239–1253 (2012).

27. Wang D. dkk. Sel CAR T yang diarahkan oleh klorotoksin untuk penargetan glioblastoma yang spesifik dan efektif. Sains. Terjemahan. medis. 12, (2020).

28. Roberts, MR dkk. Sitolisis spesifik antigen oleh neutrofil dan sel NK yang mengekspresikan reseptor imun chimeric yang mengandung domain sinyal zeta atau gamma. J. Imunol. 161, 375–384 (1998).

29. Chang, Y. dkk. Merekayasa neutrofil reseptor antigen chimeric dari sel induk berpotensi majemuk manusia untuk imunoterapi kanker yang ditargetkan. Rep Sel 40, 111128 (2022).

30. Safari H. dkk. Neutrofil secara istimewa memfagosit partikel memanjang yang mempunyai peluang untuk penargetan selektif pada penyakit inflamasi akut. Sains. Adv. 6, (2020).

31. Wang, Y. & Jönsson, F. Ekspresi, peran, dan regulasi reseptor neutrofil Fc. Depan. imunol. https://doi.org/10.3389/fimmu. 2019.01958 (2019).

32. Németh T. dkk. Pentingnya Tirosin ITAM rantai reseptor fc dalam aktivasi neutrofil dan artritis autoimun in vivo. Depan. imunol. https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.00252 (2019).

33. Peran bentuk polimorfik neutrofil Fc RIIa (CD32) dan Fc RIIIb (CD16) dalam fagositosis bakteri dan eritrosit yang teropsonisasi IgG1- dan IgG3-manusia. Transfusi. medis. Pendeta https://doi.org/10.1016/ s0887-7963(05)80094-x (1995).

34. Tsuboi, N., Asano, K., Lauterbach, M. & Mayadas, TN Reseptor neutrofil Fc manusia memulai dan memainkan peran khusus yang tidak berlebihan dalam penyakit inflamasi yang dimediasi antibodi. Kekebalan. https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.04.013 (2008).

35. Chang, Y. dkk. Generasi endotel hemogenik manusia dan sel progenitor hematopoietik definitif yang ditentukan secara kimia. Biomaterial 285, 121569 (2022).

36. Brok-Volchanskaya, VS dkk. Pembuatan neutrofil fungsional yang efektif dan cepat dari sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi menggunakan mRNA yang dimodifikasi ETV2-. Rep Sel Induk 13, 1099–1110 (2019).

37. Emami Nejad A. dkk. Peran hipoksia dalam lingkungan mikro tumor dan pengembangan sel induk kanker: pendekatan baru untuk mengembangkan pengobatan. Sel Kanker Int. https://doi.org/ 10.1186/s12935-020-01719-5 (2021).

38. Lequeux A. dkk. Dampak lingkungan mikro tumor hipoksia dan plastisitas sel tumor pada ekspresi pos pemeriksaan kekebalan. Lett Kanker. (2019). https://doi.org/10.1016/j.canlet.2019.05.021 39. Takano, T., Sada, K. & Yamamura, H. Peran protein-tirosin kinase Syk dalam sinyal stres oksidatif dalam sel B. Sinyal Redoks Antioksidan. https://doi.org/10.1089/15230860260196335 (2002).

40. Zhang J. dkk. Sinyal seluler yang dimediasi ROS dan ROS. Oksidat. medis. Sel. Umur panjang. https://doi.org/10.1155/2016/4350965 (2016).

41. Kawakami Y. dkk. Jalur aktivasi Ras bergantung pada fosforilasi Syk dari protein kinase C. Proc. Natal. Akademik. Sains. AMERIKA SERIKAT. https://doi.org/10.1073/pnas.1633695100 (2003).

42. Mócsai, A., Ruland, J. & Tybulewicz, VLJ SYK tyrosine kinase: Pemain penting dalam beragam fungsi biologis. Nat. Pendeta Imunol. https://doi.org/10.1038/nri2765 (2010). 43. Liu B. dkk. Nanokomposit yang responsif terhadap lingkungan mikro untuk gas hidrogen sulfida dan Terapi dinamis enzim yang ditingkatkan trimodal. Adv. Materi. https://doi.org/10.1002/adma. 202101223 (2021).

44. Nguyen, GT, Green, ER & Mecsas, J. Neutrofil ke ROScue: Mekanisme aktivasi NADPH oksidase dan resistensi bakteri. Depan. Sel. Menulari. Mikrobiol. https://doi.org/10.3389/fcimb.2017. 00373 (2017).

45. Che J. dkk. Neutrofil memungkinkan pengiriman liposom lokal dan non-invasif ke otot rangka yang meradang dan jantung iskemik. Adv. Materi. 32, (2020).

46. ​​Le, RQ dkk. Ringkasan persetujuan FDA: tocilizumab untuk pengobatan sindrom pelepasan sitokin yang parah atau mengancam jiwa yang disebabkan oleh sel T reseptor antigen chimeric. Ahli Onkologi 23, 943–947 (2018).

47. Morris, EC, Neelapu, SS, Giavridis, T. & Sadelain, M. Sindrom pelepasan sitokin dan neurotoksisitas terkait dalam imunoterapi kanker. Nat. Pendeta Imunol. 22, 85–96 (2022).

48. Liang, J. dkk. Neutrofil mempromosikan fenotip glioma ganas melalui S100A4. Klinik. Res Kanker. 20, 187–198 (2014).

49. Nagarajan S. dkk. Regulasi fungsi pengikatan ligan neutrofil CD32A yang spesifik sel dan bergantung pada aktivasi. Darah https://doi.org/ 10.1182/blood.v95.3.1069.003k14_1069_1077 (2000).

50. Fanger, MW, Shen, L., Graziano, RF & Guyre, PM Sitotoksisitas yang dimediasi oleh reseptor Fc manusia untuk IgG. imunol. Hari ini. https://doi.org/10.1016/0167-5699(89)90234-X (1989).

51. Lee, YG dkk. Regulasi toksisitas seperti sindrom pelepasan sitokin yang dimediasi sel CAR T menggunakan adaptor dengan berat molekul rendah. Nat. Komunitas. 10, 2681 (2019).

52. Kagoya, Y. dkk. Reseptor antigen chimeric baru yang mengandung domain sinyal JAK-STAT memediasi efek antitumor yang unggul. Nat. medis. 24, 352–359 (2018).

53. Aghajanian H. dkk. Menargetkan fibrosis jantung dengan sel T yang direkayasa. Alam. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1546-z (2019).

54. Zhang C. dkk. Sel NK spesifik ErbB2/HER2-untuk terapi glioblastoma yang ditargetkan. J.Natal. Institut Kanker. https://doi.org/10.1093/jnci/ djv375 (2016).

55. Akhavan D. dkk. Sel CAR T untuk tumor otak: Pelajaran dan jalan ke depan. imunol. Pendeta https://doi.org/10.1111/imr.12773 (2019).

56. Omar, NB dkk. Data keamanan dan kelangsungan hidup sementara setelah pemberian M032 intrakranial, HSV oncolytic rekayasa genetika-1 yang mengekspresikan IL-12, pada anjing peliharaan dengan glioma sporadis. ahli bedah saraf. Fokus 50, 1–11 (2021).

57. Larson, RC & Maus, MV Kemajuan dan penemuan terkini dalam mekanisme dan fungsi sel CAR T. Nat. Pendeta Kanker 21, 145–161 (2021).

58. Wang, B. dkk. Generasi sel T hipoimunogenik dari sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi manusia alogenik yang direkayasa secara genetik. Nat. Bioma. bahasa Inggris 5, 429–440 (2021).

59. Deuse, T. dkk. Turunan hipoimunogenik dari sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi menghindari penolakan imun pada penerima alogenik yang imunokompeten penuh. Nat. Bioteknologi. 37, 252–258 (2019).

60. Han X. dkk. Generasi sel induk berpotensi majemuk manusia yang hipoimunogenik. https://doi.org/10.1073/pnas.1902566116

61. Kwon YW dkk. Pengeditan Genom HLA DR dengan TALENs di iPSC manusia menghasilkan sel dendritik yang toleran terhadap kekebalan. Sel Induk Int. https://doi.org/10.1155/2021/8873383 (2021).

62. Morizane A. dkk. Pencocokan MHC meningkatkan pengerjaan neuron yang diturunkan dari iPSC pada primata non-manusia. Nat. Komunitas. https://doi. org/10.1038/s41467-017-00926-5 (2017).

63. Lin, K. dkk. Desain agen berbasis mekanisme yang secara selektif menargetkan glioma yang resistan terhadap obat. Sains. (80-.) 377, 502–511 (2022).

64. Fan Y. dkk. Menargetkan jalur kematian banyak sel akan memperpanjang umur simpan dan mempertahankan fungsi neutrofil manusia dan tikus untuk transfusi. Sains. Terjemahan. medis. 13, (2021).

65. Chang Y. dkk. Indikator neon untuk pelaporan fase siklus sel yang berkesinambungan dan spesifik garis keturunan dalam sel induk berpotensi majemuk manusia. Bioteknologi. Bioeng. bit.27352. https://doi.org/10.1002/bit. 27352 (2020).

66. Jung, J. dkk. Generasi sel induk dan progenitor hematopoietik definitif manusia yang ditentukan secara kimia. Protokol BINTANG. 4, 101953 (2023).