Antioksidan Graphene Oxide Nanoribbon Sebagai Agen Pemutih Baru Menghambat Mekanisme Melanogenesis

Kontak:{0}}/ WhatsApp: 008618081934791

Hsin-Yu Chou, Hui-Min David Wang,* Chia-Heng Kuo, Pei-Hsuan Lu, Lin Wang, Wenyi Kang, and Chia-Liang Sun*

ABSTRAK:Dalam proses sintesis melanin, reaksi oksidatif memainkan peran penting, dan merupakan strategi yang baik untuk menghambat produksi melanin dengan mengurangi stres oksidatif. Fullerene dan turunannya, atau kompleksnya, dianggap sebagai pemulung radikal bebas yang kuat, dan kami selanjutnya menerapkan nanokarbon sp2 berlapis-lapis untuk menemukanmelaninmekanisme penghambatan sintesis. Dalam penelitian ini, kami menggunakan nanomaterial baru, seperti nanotube karbon berdinding ganda (MWCNTs), MWCNTs tipe pendek, nanoribbons graphene oxide (GONRs), dan GONRs tipe pendek, sebagai agen anti-oksidatif untuk mengatur produksi melanin. Hasilnya menunjukkan bahwa GONR memiliki kemampuan anti-oksidatif yang lebih baik dalam platform analisis stres oksidatif intraseluler dan ekstraseluler daripada yang lain. Kami mengusulkan bahwa GONR memiliki gugus fungsi yang mengandung oksigen. Dalam uji 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, kami menemukan bahwa GONR dapat mengkhelat ion logam untuk mengais spesies oksigen reaktif. Dalam pandangan wawasan molekuler, kami mengamati bahwa bahan nano ini menurunkan regulasi sintesis melanin dengan mengurangi ekspresi gen terkait faktor transkripsi terkait mikroftalmia, dan ada konsekuensi serupa dalam ekspresi protein. Singkatnya, GONR adalah agen potensial sebagai antioksidan baru dan bahan tata rias pemutih kulit.

Cistanche jugaagen potensial sebagai novelantioksidandan pemutih kulitbahan tata rias.

1. PERKENALAN

Kulit adalah organ yang menutupi permukaan luar tubuh manusia. Karena antarmuka bersentuhan dengan lingkungan, lapisan kulit berperan penting dalam melindungi tubuh dari patogen, menghindari kehilangan air yang berlebihan, mengatur suhu tubuh, dan sebagainya. Melanosit tumbuh di membran basal epidermis kulit dan menyumbang 5 sampai 10 persen dari konten seluler. Mereka telah dicirikan sebagai "kelenjar" uniseluler yang memiliki dendrit dan percabangan yang tipis, panjang, seperti pita. Melanosit bergerak melalui sel-sel epidermis di sekitarnya, menciptakan konstelasi sel-sel epidermis di sekitar setiap melanosit. Ada banyak penyebab internal dan eksternal penuaan kulit, dan salah satu faktor tersebut adalah radiasi ultraviolet (UV) dari sinar matahari.1 Selama paparan UV, tingkat spesies oksigen reaktif (ROS) di kulit meningkat secara dramatis, yang dikenal sebagai stres oksidatif. Beberapa faktor toksisitas lingkungan juga meningkatkan stres oksidatif pada kulit, seperti pestisida, karbon tetraklorida, logam berat, amina aromatik, dan partikel 2.5 (PM2.5).2 Dalam mekanisme biokimia, oksidan intraseluler dihasilkan dari non- sistem enzimatik, mengubahnya menjadi ROS untuk memicu jalur melanogenesis

Selain ROS, ada banyak faktor yang mempengaruhiproduksi melanin, termasuk ekspresi gen, peradangan, perubahan endokrin, dan penyerapan pigmen.1 Pada langkah pertama produksi melanin, tirosinase berperan dalam mengkatalisis tirosin menjadi fenomelanin dan eumelanin. Mekanisme pembuatan kedua pigmen serupa, yang meliputi hidroksilasi L-tirosin menjadi 3,4-dihidroksi-L-fenilalanin (L-DOPA) dan oksidasi L-DOPA menjadi dopakuinon. Pada langkah berikutnya, dopamin dioksidasi oleh protein 1 terkait tirosinase (TRP-1) dan protein terkait tirosinase 2 (TRP-2) dalam melanosom, yang diatur oleh faktor transkripsi terkait mikroftalmia ( MITF) untuk membentuk melanin. Akhirnya, melanin matang dan diendapkan dalam stratum korneum.4,5 Ini menembus keratinosit tetangga dari lapisan basal dan melindungi DNA mereka dari mutasi atau modifikasi yang diinduksi UV. Melanosom yang matang dalam melanosom ditransfer ke keratinosit6-9 dan akhirnya menghasilkan pigmentasi yang tahan lama. Lentigines, bintik-bintik, dan bintik-bintik coklat / hitam kadang-kadang menyebabkan masalah sosial pada pria dan wanita. Memblokir stres oksidatif atau menekan aktivitas tirosinase adalah salah satu strategi untuk menurunkan regulasi sindrom hiperpigmentasi dan gangguan dermatologis. Antioksidan menyembuhkan hiperpigmentasi dan kerusakan sel yang disebabkan oleh ROS.10,11 Oleh karena itu, senyawa anti-oksidatif yang disintesis memiliki banyak aplikasi biofungsional dalam aplikasi perawatan kulit.

Fullerene (C60), carbon nanotube (CNT), graphene, dan graphene nanoribbon (GNR) adalah empat jenis nanokarbon sp2 yang banyak diteliti di seluruh dunia.12 Fullerene dan turunan atau kompleksnya telah dianggap kuatpemulung radikal bebasuntuk waktu yang lama. Yodh dkk. menggunakan C60 yang larut dalam air sebagai agen pelindung terhadap degenerasi yang diinduksi stres katabolik. Suntik dkk. menyimpulkan bahwa C60(OH)24 merupakan senyawa antioksidan kuat ketika stres oksidatif terlalu tinggi. Okuda dkk. menyarankan bahwa kompleks C60 dapat mencegah cedera sel yang dimediasi NO.13,14 Tong et al. menunjukkan bahwa kompleks C60 mungkin merupakan kandidat yang menjanjikan untuk mengobati penyakit terkait otak yang disebabkan oleh peningkatan kadar superoksida. Sebenarnya, sebuah perusahaan Jepang mengidentifikasi fullerene dengan aktivitas antioksidan kuat untuk penggunaan kosmetik pada tahun 2006. Lucente-Schultz et al. menunjukkan bahwa kemampuan pemulung radikal oksigen dari CNT berdinding tunggal yang difungsikan (SWCNTs) hampir 40 kali lebih besar daripada dendritik C60.15−19 Fenoglio et al. mengamati bahwa CNT berdinding banyak (MWCNTs) memiliki kapasitas pemulungan radikal yang luar biasa dalam kontak dengan sumber eksternal radikal hidroksil atau superoksida.20 Perhitungan teori fungsi kepadatan juga mengungkapkan model SWCNT sebagai pemulung radikal bebas. Pada tahun 2004, Novoselov dkk. pertama kali menunjukkan bahwa graphene menunjukkan efek listrik ambipolar yang kuat dan bisa menjanjikan untuk aplikasi elektronik.21 Setelah itu, mereka terus menunjukkan bahwa graphene memiliki sifat elektronik yang khas untuk gas 2D partikel yang dijelaskan oleh persamaan Dirac.22,23 Sejak dua makalah inovatif ini, semakin banyak perhatian diberikan pada penelitian berbasis graphene.24-30 Misalnya, Qiu et al. pada tahun 2014 menunjukkan bahwa graphene oxide dan graphene beberapa lapis menunjukkan aktivitas antioksidan yang signifikan dan dapat melindungi berbagai molekul biomolekuler dari oksidasi.31 Han et al. eksperimental menunjukkan pada tahun 2007 bahwa celah energi GNR dapat dikontrol selama proses litografi dengan mengubah lebar pita.32 Di antara empat nanokarbon, GNR paling sedikit mendapat perhatian. Sepengetahuan kami, ada sedikit penelitian tentang sifat antioksidan graphene oxide nanoribbons (GONRs).31,33 Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami dengan hati-hati menyiapkan MWCNT, MWCNT pendek, GONR, dan GONR pendek dan bertujuan untuk membandingkan sifat antioksidan dan hasil terkait secara sistematis.

2. HASIL DAN PEMBAHASAN

2.1. Morfologi MWCNT dan GONR.

Figure 1a shows the low- and high-magnification transmission electron microscopy (TEM) images of MWCNTs and short MWCNTs. Following acidic cutting under ultrasonication, the length of MWCNTs could be shortened from >10 m hingga 2−3 m. Secara bersamaan, diamati bahwa perlakuan asam nitrat membuat permukaan tabung menjadi kasar. Beberapa takik dan bentuk tidak beraturan ditampilkan dalam gambar perbesaran tinggi. Selanjutnya, menggunakan MWCNT dan MWCNT pendek melalui reaksi gelombang mikro masing-masing memperoleh GONR dan GONR pendek. Kami juga mengilustrasikan gambar TEM perbesaran rendah dan tinggi dari GONR dan GONR pendek. Karena pembukaan ritsleting longitudinal utama dan pemotongan horizontal kecil, tampaknya GONR lebih pendek dari MWCNT. Di sisi lain, gambar perbesaran tinggi menunjukkan diameter yang lebih besar, yaitu, 0.11−0,18 m, dari GONR dibandingkan MWCNT, menunjukkan bahwa proses unzip berhasil. Demikian pula, GONR pendek menunjukkan panjang yang lebih pendek dan diameter yang lebih besar daripada MWCNT pendek. Dalam kompresor udara dari proses membuka ritsleting baru kami, struktur lapisan tipis GONR kurang dari yang kami peroleh dalam laporan awal untuk daya gelombang mikro yang sama 250 W sambil mempertahankan MWCNT pusat yang lebih tebal.12 Ini berarti MWCNT inti-kulit /GONR heterostruktur akan lebih mungkin muncul daripada struktur nanoribbon yang sepenuhnya terbuka melalui semua kekuatan gelombang mikro dalam proses baru. Untuk membandingkan dengan GONR pendek dalam penelitian kami sebelumnya,34 daya gelombang mikro yang lebih tinggi menghasilkan lebih banyak takik di sisi pita dan tidak membentuk tepi pita yang halus dan bagus. Perhatikan bahwa kami menggunakan dua jenis kisi Cu yang berbeda pada Gambar 1a. Untuk MWCNT dan GONR dengan panjang yang cukup, kisi Gu dengan formvar renda yang distabilkan dengan karbon (produk no. 01881-F, Ted Pella, Inc., USA) digunakan. Lubang terbuka dalam film karbon berenda mencegah gambar transmisi yang tumpang tindih antara nanokarbon dan film karbon. Jaringan abu-abu gelap milik film karbon renda. Namun, grid Gu dengan formvar distabilkan dengan karbon (produk no. 01800-F, Ted Pella, Inc., USA) diperlukan untuk MWCNT pendek dan GONR pendek. Ini karena lubang besar pada film karbon berenda menyebabkan masalah untuk menahan MWCNT pendek dan GONR pendek secara efisien. Seperti yang diilustrasikan pada Gambar 1, kontras abu-abu muda di bawah MWCNT pendek dan GONR pendek adalah lapisan karbon yang ringan. Lapisan karbon ini menstabilkan film formvar yang terpapar sinar elektron melalui sifat konduktor panas dan listriknya.

2.2. Konfigurasi Ikatan MWCNT dan GONR.

Spektrum Raman dari empat nanokarbon disajikan pada Gambar 1b; pita D GONR lebih tinggi daripada MWCNT setelah proses unzip. Ini dikaitkan dengan tingkat oksidasi yang lebih tinggi dan jumlah struktur tepi GONR yang lebih banyak dibandingkan dengan MWCNT. Fenomena ini juga serupa dengan apa yang kami amati pada 2011.12 Karena tingkat grafitisasi yang tinggi, pita G dari MWCNT memiliki jumlah lebar-penuh-pada-setengah-maksimum terendah. Rasio ID/IG dari keempat nanokarbon adalah {{10}}.076, 0.502, 0,483, dan 0,700, masing-masing. Secara singkat, penurunan panjang dan oksidasi permukaan meningkatkan tingkat cacat dan dengan demikian membuat rasio ID/IG lebih tinggi. Puncak D′ hadir di semua graphene yang cacat dan dipandang sebagai ukuran kualitas.35 Seperti yang diilustrasikan pada Gambar 1b, puncak D′ dalam empat spektrum menjadi lebih menonjol setelah proses pemotongan atau pembukaan ritsleting, menunjukkan bahwa mereka merusak proses yang memperkenalkan banyak cacat. Gambar 1c,d menampilkan spektrum spektroskopi fotoelektron sinar-X dari empat nanokarbon. Rupanya, puncak D′ adalah yang paling jelas untuk GONR pendek. Seperti ditunjukkan pada Gambar 1c, tingkat O meningkat secara signifikan dari 7,6 persen (MWCNTs) menjadi 19,9 persen (GONRs) karena kemampuan oksidasi KMnO4 yang kuat dalam lingkungan asam. Di sisi lain, tingkat O sedikit meningkat sebesar 0,8 persen dari MWCNT ke MWCNT pendek. Yang penting, tingkat O tertinggi adalah 38,3 persen untuk GONR pendek, menyiratkan bahwa ujung nanoribbon akan lebih mudah untuk melampirkan gugus fungsi oksigen daripada permukaan planar sp2. Jumlah lebar-penuh-pada-setengah-maksimum yang lebih besar dan pergeseran ke energi ikat tinggi dari puncak C1s setelah proses membuka ritsleting MWCNTs dan MWCNTs pendek diilustrasikan pada Gambar 1d. Untuk grafena oksida, puncak terdekonvolusi di sisi energi ikat tinggi dapat ditetapkan ke ikatan C−C(CC), C−O, CO, dan COOH.36 Kami mengkarakterisasi GONR (200 W) pada tahun 2013 ,37 dan hasilnya mirip dengan hasil penelitian ini. Studi ini menyimpulkan fenomena spektrum Raman, yang berarti bahwa lebih banyak gugus fungsi yang mengandung oksigen yang dihasilkan selama transformasi tabung-ke-pita (Gambar 2).

2.3. Sifat Anti-oksidatif MWCNTs dan GONRs.

2.3.1. Penentuan 1,1-Difenil-2-pikrilhidrazil Uji Aktivitas Pemulungan Radikal Bebas.

1,1- Difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) aktivitas pemulungan radikal bebas adalah platform antioksidan yang diterapkan untuk mendeteksi kapasitas anti-oksidasi; hasil untuk empat nanokarbon dijelaskan pada Tabel 2. Dalam uji DPPH, vitamin C pada konsentrasi 100 M digunakan sebagai kontrol positif. Untuk menguji aktivitas anti-oksidatif MWCNT, MWCNT pendek, GONR, dan GONR pendek, dosis 1, 5, dan 10 mg/L diinkubasi ke dalam larutan reaksi untuk mengukur sifat-sifatnya. MWCNT, MWCNT pendek, GONR, dan GONR pendek memiliki kemampuan penghambatan sedang pada 10 mg/L (19,2 ± 0.3, 12,1 ± 0.3, 26,8 ± 0,3, dan 30,0 ± 0,4 persen ), sedangkan vitamin C memiliki kondisi yang sama pada 100 M (93,4 ± 0,1 persen) untuk penekanan.

2.3.2. Uji Aktivitas Pengkelat Ion.

Dalam situasi stres oksidatif, ferrozine dapat mengembangkan kompleks dengan Fe2 plus untuk diukur secara kuantitatif. Dengan adanya mediator pengkhelat, kompleks tersebut rusak, menyebabkan ion besi berkurang dari warna merah tua kompleks Fe2 plus. Kami menggunakan EDTA sebagai kontrol positif. Tabel 2 menunjukkan bahwa MWCNT, MWCNT pendek, GONR, dan GONR pendek memiliki aktivitas pengkelat pada 10 mg/L (29,2 ± {{10}}.8, 28,7 ± 0 0,7, 69,7 ± 0.6, dan 68,9 ± 0,3 persen ), sedangkan kontrol positif memiliki kondisi yang sama pada 100 M (93,4 ± 0,1 persen ).

2.3.3. Pengukuran Daya Antioksidan Pengurang Besi.

Uji potensi pereduksi besi adalah uji sederhana dan andal yang digunakan untuk mengukur sintesis kompleks Fe(III)-ferricyanide. Dalam pengujian ini, daya reduksi dari empat nanokarbon yang menghasilkan kompleks besi Fe(III)−TPTZ dideteksi dengan perubahan warna larutan dari kuning menjadi hijau dan biru. Tabel 2 menunjukkan bahwa daya reduksi MWCNT, MWCNT pendek, GONR, dan GONR pendek adalah kerapatan optik (OD) 1,11, 1,13, 1,15, dan 1,11 pada 10 mg/L.

2.3.4. MWCNT dan GONR Menghambat Akumulasi ROS Intraseluler.

Banyak laporan telah menunjukkan bahwa ROS menghancurkan integritas struktural membran sel, termasuk membran sel dan membran inti untuk menyebabkan kerusakan sel dan hilangnya fungsi normal.38−40 Selain itu, ROS juga merupakan salah satu faktor penting untuk mengkatalisis pembentukan tirosinase melanin, dan penghambatan produksi ROS adalah strategi yang baik untuk menurunkan regulasi sintesis melanin. Dalam penelitian ini, kami menggunakan uji pewarnaan 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) untuk menganalisis tingkat stres oksidatif intraseluler dalam sel perawatan MWCNT dan GONR. Phorbol 12-miristat 13-asetat (PMA) menginduksi stimulasi oksidatif pada kelompok MWCNT dan GONR dan digunakan sebagai kontrol negatif.41 Ketika konsentrasi PMA adalah 20 ng/mL, hal itu menginduksi stres oksidatif, meningkatkan nilainya menjadi 38 persen; setelah mengobati GONR dan MWCNT, tingkat ROS diturunkan ke tingkat normal. Data menunjukkan bahwa kedua bahan menghambat tingkat stres oksidatif, dan efek anti-oksidatif GONR lebih tinggi daripada MWCNT (Gambar 3). Tabel 1 menunjukkan daftar konsekuensi serupa. Kami berpendapat bahwa ada tiga alasan untuk temuan baru kami: pertama, urutan kelarutan bahan-bahan ini adalah sebagai berikut: GONRs pendek> GONRs> MWCNTs pendek> MWCNTs, yang berarti bahwa area kontak GONRs pendek adalah yang terbesar, jadi unggul untuk pemulungan ROS. Kedua, GONR dan MWCNT adalah struktur karbon sp2-yang dapat menghancurkan listrik ROS melalui pembentukan aduk atau transfer elektron.42 Kami menemukan bahwa efek antioksidan dari struktur nanoribbon lebih baik daripada struktur nanotube, jadi nanoribbons membuatnya lebih mudah untuk mentransfer elektron dari nanotube. Akhirnya, pada Gambar 1b, kami mengamati bahwa situs karbon GONR sp2-mengandung lebih banyak gugus fungsi oksigen daripada MWCNT, gugus asam karboksilat dapat mengkelat ion logam, dan gugus hidroksil dapat menjadi donor H untuk mengais ROS dan menghambat produksi melanin.

2.4. Sitotoksisitas MWCNT dan GONR yang Diobati dalam Sel Fibroblas Kulit Manusia.

Metode {{0}}(4,5-Dimethylth-iazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) diterapkan untuk mengevaluasi sifat sitotoksik GONR pada sel Hs68 (Gambar 3), dan sel dikultur pada dosis berbeda 1, 5, dan 10 ug/mL. Kami memeriksa bahwa viabilitas sel MWCNT adalah 100,7 ± 3,7, 99,8 ± 4,9, dan 94,1 ± 4,7 persen pada konsentrasi masing-masing 1, 5, dan 10 mg/L; viabilitas untuk MWCNT pendek dihitung dalam urutan yang sama dan ditemukan 93,9 ± 2,2, 86.4 ± 3,0, dan 98,9 ± 2,1 persen . Kami mengamati bahwa sel B16−F10 diinkubasi dalam konsentrasi tinggi, dan kelangsungan hidup sel sel Hs68 lebih dari 80 persen, menunjukkan bahwa MWCNT dan MWCNT pendek tidak memiliki efek toksik pada sel fibroblas dermal manusia. Viabilitas sel GONR dan GONR pendek adalah 86.24 ± 2.1, 90.87 ± 3.5, 88.58 ± 2.5, 89.03 ± 3.6, 90.71 ± 2.8, dan 90.64 ± 2.5 persen . Juga ditunjukkan pada Gambar 4a bahwa GONR dan GONR pendek tidak memiliki efek sitotoksik yang terlihat pada sel HS68. Dalam laporan sebelumnya, penggunaan bahan nano yang belum diuji untuk tujuan kosmetik dapat dianggap dipertanyakan,43,44 dan biasanya karena serangan DNA setelah nanopartikel memasuki sel. Setelah uji sitotoksisitas, kami menemukan bahwa bahan kami tidak menyebabkan toksisitas pada sel kulit normal. Kami menyimpulkan bahwa setelah nanomaterial memasuki sel, nanomaterial hanya menghambat produksi melanin dengan mengurangi stres oksidatif dan mengkelat ion logam dan tidak merusak mitokondria atau DNA, yang berarti bahwa MWCNT dan GONR aman untuk digunakan.

2.5. Dua Jenis MWCNT dan GONR dalam Aktivitas Tirosinase Seluler B16−F10 dan Konten Melanin.

Dalam jalur sintesis melanin, tirosinase memainkan peran penting. Tirosinase mengoksidasi dan membentuk eumelanin dan pheomelanin melalui serangkaian reaksi biokimia. Untuk menentukan apakah GONR dan MWCNT menghambat aktivitas tirosinase dan menyebabkan penurunan produksi melanin, kami menganalisis aktivitas tirosinase dalam sel B16−F10. Kami menemukan bahwa MWCNT dan MWCNT pendek menghambat aktivitas tirosinase sekitar 17,1 persen dan 23 persen pada 10 mg/L. GONR dan GONR pendek memiliki efek yang lebih baik dalam menekan aktivitas tirosinase pada konsentrasi yang sama dibandingkan dengan GONR lain. Mereka juga bergantung pada dosis dan menghambat 49,8 persen dan 44,7 persen aktivitas tirosinase, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4b.

Melanin adalah pigmen yang sangat diperlukan dalam tubuh manusia, tetapi ekspresi melanin yang berlebihan sering memicu serangkaian penyakit. Dalam penelitian sebelumnya, Xiao et al. menggunakan bahan serupa, Radical Sponge, nanopartikel fullerene, sebagai agen anti-melanin.45 Ada beberapa hasil yang baik; sekitar 20 persen produksi melanin dapat dihambat. Untuk meningkatkan efisiensinya, kami lebih meningkatkan bahan pengujian untuk mengukur tingkat penghambatan melanin dan mekanisme molekulernya, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4c dan 5. MWCNT dan MWCNT pendek menurunkan kandungan melanin sebesar 17,6 ± 5,5 dan 13,2 ± {{ 16}}.2 persen pada 10 mg/L dan dengan cara yang bergantung pada dosis. GONR dan GONR pendek secara kuat menurunkan nilai menjadi 32,0 ± 2,3 dan 35,3 ± 3,4 persen pada 10 mg/L. Hasil eksperimen menunjukkan bahwa keempat jenis dapat menghambat sintesis melanin dan GONR memiliki efek yang lebih kuat. Di sisi lain, kami juga mengamati bahwa GONR pendek memiliki efek yang lebih baik dalam menghambat produksi melanin. Kami menyimpulkan bahwa GONR pendek memiliki lebih banyak kelompok fungsional dan dapat secara efektif mencegah tirosinase yang dikatalisis ion logam, yang selanjutnya menghambat produksi melanin (Gambar 2). Pada Tabel 1, kami mengamati bahwa upaya pengkhelat ion logam tipe pendek lebih tinggi dari tipe normal; ini berarti bahwa GONR pendek ini berpotensi diterapkan di bidang kosmetik sebagai agen perawatan kulit.

2.6. Mekanisme MWCNT dan GONR Menghambat Konten Melanin Seluler B16−F10.

Sel merespon stres oksidatif eksternal dengan mengatur ekspresi protein. Sel B16−F10 meningkatkan ekspresi gen c-myc dan AMPK yang diregulasi untuk menurunkan tingkat oksidatif,46 dan dalam penelitian ini, MITF adalah faktor transkripsi spesifik dari tirosinase untuk mengatur jalur sinyal sintesis melanin molekuler.47−49 Pada Gambar 5a, MWCNT dan GONR menurunkan regulasi faktor transkripsi terkait mikroftalmia dengan mengurangi stres oksidatif, dan kemudian, gen hilir TRP-1 dan TRP-2 juga diturunkan regulasi. Untuk tingkat protein, fenomena serupa ditemukan, di mana MWCNT dan GONR menurunkan regulasi jalur melanogenesis terkait MITF dan akhirnya mengurangi kandungan melanin (Gambar 5b).

3. BAHAN DAN METODE EKSPERIMENTAL

3.1. Persiapan MWCNT dan GONR.

Proses yang relevan untuk membuat GONR telah dilaporkan dalam makalah sebelumnya.12 MWCNT (0.05 g) disuspensikan dalam H2SO4/H3PO4 9:1 dan diolah dengan reaktor gelombang mikro (CEM-Discover) dengan daya yang disetel pada 250 W selama 2 menit. Setelah penambahan KMnO4 (0,25 g) ke dalam larutan, larutan diperlakukan dengan daya gelombang mikro yang sama pada 65 derajat selama 4 menit12 Kami kemudian memodifikasi proses ini menggunakan waktu gelombang mikro tahap kedua yang lebih pendek yaitu 8 menit dengan memanfaatkan kompresor udara. Di sini, kompresor udara digunakan untuk mengontrol suhu reaktor gelombang mikro selama proses berlangsung. Daya gelombang mikro ditetapkan pada 250 W dalam pengujian pendahuluan.

3.2. Persiapan Short MWCNTs dan Short GONRs.

Proses yang relevan untuk membuat GONR pendek dilaporkan dalam makalah kami sebelumnya. 34 Waktu perlakuan asam dipilih sebagai 8 jam. Daya gelombang mikro diatur pada 250 W, yang sama dengan untuk mendapatkan GONR.

3.3. Kegiatan Penanggulangan Radikal DPPH.

DPPH sering digunakan untuk menentukan kapasitas sampel dan sifat antioksidan.50 DPPH adalah reagen ungu yang berubah warna dari ungu menjadi kuning jika radikal bebas ditransfer ke analit. Sampel anti-oksidatif positif dengan konsentrasi yang sesuai ditambahkan ke dalam larutan, dan sampel dianalisis pada 517 nm selama 30 menit. Kami menggunakan persentase DPPH yang tersisa selain sampel pengujian untuk mengukur jumlah antioksidan yang diperlukan untuk mengurangi radikal DPPH sebelumnya. Vitamin C pada 100 M digunakan sebagai kontrol positif. Aktivitas pemulungan ( persen ) diukur sebagai

Kapasitas pemulung ( persen )=(Contoh Kosong) / (Akontrol Kosong) × 100 persen (1)

3.4. Aktivitas Pengetatan Logam.

Ion logam adalah faktor yang menyebabkan oksidasi lipid yang berlebihan, dan Fe2 plus adalah salah satu ion yang paling mempengaruhi.50 Berbagai konsentrasi nanobiomaterial (1 L) dimasukkan ke dalam pelat sumur 96-yang berisi 2 mM FeCl2·4H2O (10 L), dan kemudian dimuat ke dalam ferrozine (5 mM, 20 L). Campuran dicampur sepenuhnya dengan 69 L mentol dan disimpan pada suhu kamar selama 10 menit. Kemudian, larutan reaksi sampel diamati pada 562 nm. EDTA digunakan sebagai kontrol positif pada 100 M, dan rumus perhitungan aktivitas pengkhelat logam didasarkan pada persamaan 1.

3.5. Mengurangi Daya.

Perhitungan daya reduksi didasarkan pada penelitian sebelumnya.50 Pertama, bahan graphene 2,5 L dicampur dengan buffer PBS (67 mM, pH 6,8) dan K3Fe(CN)6 (2,5 L, 20 persen ) kemudian diinkubasi pada suhu 50 derajat. selama 20 menit. Kemudian, 10 persen asam trikloro asetat (160 L) dicampur dengan reagen pada 300g disentrifugasi selama 20 menit. Panjang penyerapan ditentukan pada 700 nm setelah dicampur dengan 25 L FeCl3 (2 persen). Butylated hydroxyanisole (BHA) digunakan pada 100 M.

3.6. Pemeriksaan Proliferasi Sel.

Garis sel fibroblas kulit manusia HS68 digunakan untuk menganalisis rasio proliferasi sel. HS68 diinkubasi dalam medium Elang modifikasi Dulbecco (DMEM) yang mengandung 10 persen serum janin sapi dan 1 persen campuran penisilin dan streptomisin.50,51 Setelah diperlakukan dengan konsentrasi sampel yang berbeda, kami menerapkan MTT untuk mendeteksi rasio proliferasi sel. 8000 sel diunggulkan di 96-piring sumur dan diperlakukan dengan sampel selama 24 jam. Solusi supernatan telah dihapus, dan kami menggunakan solusi MTT untuk kultur selama 2 jam pada 37 derajat. Setelah inkubasi, kami menghapus media yang mengandung MTT dan melarutkannya dengan dimetil sulfoksida (DMSO). Solusinya dibaca pada OD 590 nm dan laju dihitung dengan persamaan 1.

3.7. Penilaian Isi Melanin Seluler.

Kami menggunakan metode dengan sedikit modifikasi berdasarkan pengujian sebelumnya.52,53 Pelet sel B16−F10 dari Bioresource Collection and Research Center (BCRC, CRL 6323, Hsinchu, Taiwan) dilarutkan dalam campuran 2,0 N NaOH dan 10 persen DMSO. Sampel kemudian dipanaskan selama 1 jam pada 90 derajat dan disentrifugasi pada 10,000g selama 10 menit untuk mendapatkan supernatan yang diklarifikasi. Jumlah melanin ditentukan dengan memantau OD supernatan pada 475 nm.

3.8. B16−F10 Aktivitas Tirosinase Seluler.

Untuk aktivitas tirosinase seluler B16−F10, kami merujuk pada pekerjaan sebelumnya dengan beberapa modifikasi.50 Sel dikultur di 12-pelat sumur pada 105 sel setiap sumur. Setelah perawatan dengan sampel, sel dilisiskan dalam 1 persen Triton X-100/PBS dan 2 mM L-tirosin (50 L) selama 3 jam. Setelah inkubasi, media dikeluarkan dan dibaca absorbansinya pada OD 590 nm. Rumus aktivitas tirosinase dihitung dengan persamaan 1.

Cistanche adalah penghambat tirosinase.

3.9. Deteksi ROS dengan Pewarnaan DCFDA.

Mengacu pada penelitian sebelumnya,54 1.2 1.105 Sel B16−F10 diunggulkan dalam pelat sumur 6-dan diperlakukan dengan berbagai konsentrasi sampel. Sel ditangguhkan dalam PBS dan kemudian dimuat dengan DCFDA (5 M) dalam DMEM merah non-fenol selama 30 menit pada 37 derajat. Sitometer aliran (Guava, Merck, Jerman) digunakan untuk mendeteksi sinyal fluoresen DCFDA. Panjang gelombang eksitasi dan emisi DCFDA masing-masing adalah 488 dan 535 nm.

3.10. Reaksi Berantai Polimerase Waktu Nyata Kuantitatif.

Kami mengikuti metode Lin et al. (2018).1 Reaksi rantai transkripsi-polimerase terbalik kuantitatif real-time (qRT-PCR) terdiri dari probe primer eksklusif untuk menghasilkan fluoresensi. Ini menggunakan teknik deteksi fluoresensi yang merasakan setiap siklus menggunakan Sistem 7500 qRT-PCR (Applied Biosystems, USA). Ini mendeteksi siklus berdasarkan jumlah fluoresensi yang dilepaskan, dan kemudian produk dari setiap siklus dihitung untuk konten yang dihasilkan, yang menghasilkan pencapaian tujuan kuantitatif waktu nyata. Trizol (Invitrogen, USA) digunakan untuk mengekstrak RNA lengkap dari jaringan paru-paru, sesuai arahan yang diberikan oleh pabrikan. Selanjutnya, kit transkripsi terbalik (Takara, Jepang) digunakan untuk menghasilkan DNA. Dalam qRT-PCR menggunakan primer, tercantum pada Tabel 1, pertama, sampel dipanaskan untuk membentuk untai tunggal DNA; kemudian pengikatan primer terjadi untuk membentuk DNA untai ganda (dsDNA), setelah itu SYBR Green dsDNA digabungkan, di mana kit reagen SYBR green plus (Roche, Basel, Swiss) digunakan, yang menghasilkan pelepasan fluoresensi. Hasilnya dilewatkan melalui sistem deteksi fluoresensi. Deteksi sinyal fluoresen terjadi selama fase elongasi atau anil dari setiap siklus; setelah deteksi, isi sampel didorong kembali oleh intensitas fluoresensi yang terdeteksi.55 Tingkat ekspresi gen target dinormalisasi ke tingkat -tubulin menggunakan metode 2−ΔΔCt.

myricetin

3.11. Tes Western Blot.

Sel B16−F10 dilisiskan pada suhu 4 derajat semalaman dengan buffer uji radioimmunopresipitasi (Thermo Scientific Co., USA), yang mengandung protease inhibitor. Kit uji protein asam bicinchoninic (BCA, Sigma-Aldrich Corp., USA) digunakan untuk mengukur jumlah protein. Protein sampel dipisahkan pada 10 persen gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida dan dipindahkan ke membran polivinilidena difluorida (PVDF) (PALL Life Science, Ann Arbor, MI, USA). Membran PVDF diblokir dengan buffer pemblokiran (Thermo Scientific) selama 1 jam dan diinkubasi dengan antibodi primer spesifik semalaman pada suhu 4 derajat. Selanjutnya, membran dicuci dengan tris buffer saline-Tween 20 buffer dua kali dan diinkubasi dengan antibodi sekunder selama 1,5 jam. Setelah itu, membran dicelupkan ke dalam reagen pendeteksi chemiluminescence (Thermo Scientific) dan dianalisis oleh imager MiniChemi Chemiluminescence (Beijing Sage Creation Science, China). Sumber antibodi termasuk kelinci anti-MITF, kelinci anti-TRP-1, kelinci anti-TRP-2, dan -aktin (Thermo Scientific).

3.12. Analisis Bahan.

TEM (JEOL JEM-1230, 100 kV) digunakan untuk mengamati morfologi nanokarbon. Spektrometer mikro Raman (PTT, RAMaker) diterapkan untuk memeriksa mode resonansi nanokarbon. Pengukuran spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS, Kratos Axis Ultra DLD) juga dilakukan untuk menentukan analisis komposisi.12,34

3.13. Analisis statistik.

Semua sampel dan percobaan standar diulang setidaknya tiga kali. Kami menerapkan uji-t Student untuk membandingkan dan menyatakan rata-rata nilai rata-rata ± standar deviasi secara statistik.

4. KESIMPULAN

Singkatnya, kami mengamati bahwa GONR pendek adalah bahan potensial untuk produk perawatan kulit karena beberapa sifat biofungsionalnya (Gambar 6). Hasil penelitian menunjukkan bahwa nanokarbon berperan sebagai antioksidan ekstraseluler dan intraseluler. Sementara itu, nanokarbon menghambat aktivitas tirosinase dan kandungan melanin dan tidak menyebabkan cedera serius pada sel pigmen. Karya ini menetapkan fungsi anti-melanogenesis dari empat jenis nanokarbon; studi masa depan akan meneliti mekanisme senyawa ini pada ekspresi gen dan protein tertentu yang terkait dengan pematangan melanin, transportasi, dan akumulasi.

Cistanche meningkatkan pemutihan.

Silahkan klik gambar dan mendapatkan rincian lebih lanjut.