Ekstrak Biji Phoenix Dactylifera L. Menunjukkan Efek Antioksidan Dan Melemahkan Melanogenesis

Huey-Chun Huang1 , Shr-Shiuan Wang2, Tsang-Chi Tsai3, Wang-Ping Ko3 dan Tsong-Min Chang2,*

Abstrak:Latar Belakang: Cara kerja ekstrak biji Phoenix dactylifera dalam perawatan kulit belum pernah diteliti. Metode: Biji P. dactylifera L. diekstraksi dengan ekstraksi ultrasonik. Sifat antioksidan ekstrak ditentukan dengan 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) dan 2,2′-azino-di-(3-etilbenztiazolin asam sulfonat) (ABTS plus ) pengujian dan metode pembilasan. Kandungan total fenolik, kapasitas pereduksi, pengikatan ion besi (II), dan kapasitas pemulung spesies oksigen reaktif (ROS) intraseluler juga diselidiki. Efek ekstrak biji P. dactylifera L. pada melanogenesis dievaluasi secara spektrofotometri dengan uji aktivitas tirosinase jamur, penentuan aktivitas tirosinase intraseluler, dan kandungan melanin. Tingkat ekspresi protein terkait melanogenesis dianalisis dengan Western blotting. Hasil: Hasil mengungkapkan bahwa P.dactylifera L.ekstrak biji memberikan kapasitas antioksidan yang nyata dan secara signifikan menurunkan kandungan ROS intraseluler pada konsentrasi {{0}}.245 dan 0,49 (mg/mL). Selanjutnya, ekstrak menurunkan ekspresi reseptor melanocortin 1 (MC1R), faktor transkripsi terkait mikroftalmia (MITF), tirosinase, protein terkait tirosinase-1 (TRP1), dan protein terkait tirosinase-2 ( TRP2), dan menghambat melanogenesis dalam sel B16F10. Kesimpulan: Hasil kami mengungkapkan bahwa ekstrak biji P. dactylifera L. melemahkan melanogenesis dalam sel B16F10 dengan menurunkan jalur sinyal protein kinase A (PKA). Oleh karena itu, ekstraknya dapat digunakan sebagai salah satu jenis bahan pemutih kulit dalam produk perawatan kulit.

Kata kunci: Phoenix dactylifera;tirosinase; melanin; ROS; PKA

cistanche pharma khususadalah jenis agen pemutih kulit.

1. Perkenalan

Antioksidan telah banyak diterapkan untuk mencegah atau mengobati gangguan terkait stres oksidatif di bidang kosmetik dan dermatologis. Selama beberapa dekade terakhir, antioksidan juga telah digunakan dalam industri kosmetik untuk mencegah atau menunda penuaan kulit. Dilaporkan bahwa radikal bebas dan spesies oksigen reaktif (ROS) dikaitkan dengan beberapa penyakit, seperti penuaan dan penyakit terkait usia [1]. Menariknya, kerusakan radikal bebas pada kulit yang disebabkan oleh stres iradiasi UV dan ROS memainkan peran penting dalam proses photoaging kulit [2,3]. Antioksidan dilaporkan mengganggu proses oksidasi dengan menangkap radikal bebas dan ROS atau dengan mengkhelat logam oksidasi-katalitik [4]. Oleh karena itu, telah terjadi peningkatan dramatis dalam jumlah aplikasi antioksidan atau suplemen nutrisi antioksidan untuk mengurangi stres oksidatif atau kerusakan akibat stres oksidatif dalam tubuh [5,6]. Namun, beberapa antioksidan kimia, termasuk natrium askorbat, tert-butil hidroksianisol (BHA), natrium eritorbat, dan tert-butil hidroksitoluena (BHT), telah terbukti meningkatkan efek karsinogenik pada kesehatan manusia [7]. Oleh karena itu, pertumbuhan pesat studi tentang antioksidan alami yang berasal dari tumbuhan telah terjadi selama beberapa dekade terakhir. Yang penting, ditemukan bahwa peningkatan kadar ROS dapat mempercepat pigmentasi kulit. Di antara ROS yang berasal dari melanosit dan keratinosit, oksida nitrat, NO, merangsang sintesis melanin dengan meningkatkan tingkat ekspresi protein tirosinase dan protein terkait tirosinase 1 (TRP1) [8,9]. Pengaruh ROS terhadap produksi melanin telah dipelajari dengan menggunakan berbagai antioksidan, seperti N-asetil sistein, untuk menghilangkan aksi dari -melanocyte-stimulating hormone (-MSH) yang diinduksi UVB [10].

Melanin diproduksi dan disekresikan oleh melanosit yang didistribusikan di lapisan basal epidermis kulit. Dua langkah pertama dari jalur melanogenesis pada manusia adalah hidroksilasi L-tirosin menjadi 3-4-dihidroksi fenilalanin (L-DOPA) dan oksidasi L-DOPA menjadi o-dopakuinon. Tirosinase (EC 1.14.18.1) adalah enzim pembatas laju yang mengkatalisis kedua dari dua reaksi pertama selama melanogenesis [12]. Melanin memainkan peran penting dalam melindungi kulit dari kerusakan sinar ultraviolet (UV) sinar matahari dan juga bertanggung jawab untuk mewarnai rambut, kulit, dan mata. Telah dilaporkan bahwa berbagai gangguan dermatologis, seperti bintik-bintik penuaan, melasma, melanoderma pasca-inflamasi, bintik-bintik, dan situs kerusakan aktinik, akibat akumulasi tingkat melanin epidermal yang berlebihan [13]. Inhibitor sintesis melanin telah semakin banyak diterapkan dalam produk perawatan kulit untuk pengobatan atau pencegahan gangguan hiperpigmentasi kulit [14,15]. Selain itu, antioksidan, seperti arbutin atau asam kojic [16], telah digunakan dalam pengobatan hiperpigmentasi [17]. Baru-baru ini, kosmetik pemutih kulit telah menyumbang sebagian besar produk kosmetik. Tidak hanya wanita dengan kulit gelap, tetapi juga mereka yang mencoba mengatasi bintik-bintik gelap pada kulit yang timbul dari sinar UV, kehamilan, atau bertambahnya usia banyak menggunakan produk pemutih kulit ini.

Melanogenesis diatur oleh banyak faktor. Misalnya, protein terkait tirosinase-1 (TRP1), faktor transkripsi terkait mikroftalmia (MITF), dan protein terkait tirosinase-2 (TRP2) dilaporkan mengatur produksi melanin [18-20 ]. Reseptor melanokortin 1 (MC1R) juga menonjol dalam sintesis melanin yang diinduksi -MSH [21]. Ada beberapa jalur sinyal yang terlibat dalam produksi melanin. Di antara jalur sinyal yang berbeda yang mengatur produksi melanin, aktivasi cyclic AMP (cAMP)-mediated protein kinase A (PKA) memainkan peran penting dalam regulasi melanogenesis [22]. Dalam jalur pensinyalan cAM-PKA, cAMP menginduksi aktivasi PKA [23], yang diikuti oleh fosforilasi cAMP response element-binding protein (CREB). CREB adalah faktor transkripsi intraseluler yang merangsang ekspresi gen microphthalmia factor (MITF), yang penting dalam melanogenesis. MITF adalah faktor transkripsi yang mengikat ke daerah promotor gen melanogenik tirosinase, TRP1, dan TRP2, meningkatkan ekspresi mereka [24,25]. Setelah itu, kandungan melanin intraseluler meningkat [26]. Telah dilaporkan bahwa -MSH meningkatkan kadar cAMP dan biasanya diterapkan untuk mengaktifkan fosforilasi CREB dan kemudian meningkatkan kadar protein MITF [27].

Ekspresi MITF diatur oleh beberapa jalur pensinyalan. c-Jun N-terminal kinase (JNK) dan p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) terlibat dalam aktivasi ekspresi MITF dan akibatnya meningkatkan ekspresi tirosinase. Sinyal aktivasi ekstraseluler responsif kinase (ERK) juga meningkatkan fosforilasi CREB dan ekspresi MITF berikutnya, yang memodulasi sintesis melanin [28,29]. Oleh karena itu, beberapa agen pemutih kulit dilaporkan menghambat aktivitas transkripsi MITF dengan menurunkan tingkat ekspresi protein tirosinase, TRP1, dan TRP2 melalui penurunan regulasi fosforilasi MITF yang dimediasi p38MAPK. Selain itu, jalur ERK telah dijelaskan terlibat dalam regulasi MITF selama melanogenesis [30,31]. Aktivasi ERK memfosforilasi MITF, menyebabkan degradasi MITF, menghasilkan pengurangan kandungan melanin [32,33].

Stres oksidatif dapat disebabkan oleh kelebihan produksi ROS atau penurunan pertahanan antioksidan [1]. Pencarian dan aplikasi antioksidan alami tetap menjadi fokus banyak tim peneliti di seluruh dunia. Baru-baru ini, minat penelitian dan pengembangan fitokimia, seperti antioksidan alami dan senyawa fenolik dari berbagai sumber alam semakin meningkat, yang dapat digunakan sebagai nutraceuticals, kosmetik anti penuaan, dan produk obat [34]. Phoenix dactylifera L. adalah salah satu tanaman buah utama yang diproduksi di Timur Tengah dan Afrika Utara [35,36]. Penelitian sebelumnya telah melaporkan bahwa buah P. dactylifera L. menunjukkan aktivitas antioksidan, radikal bebas, antimikroba, dan anti-inflamasi [37,38]. Efek fungsional P. dactylifera L. tidak hanya terbatas pada buah itu sendiri tetapi juga pada bijinya, yang merupakan jenis produk sampingan dari buah [39,40]. Karena sifat antioksidannya, ekstrak biji P. dactylifera L. bisa berfungsi sebagai sumber zat antioksidan yang bertindak melawan stres oksidatif [41-43]. Namun, beberapa penelitian telah dilakukan pada aplikasi benih P. dactylifera L. untuk pengembangan produk kosmetik. Biji ini biasanya dibuang sebagai limbah, tetapi signifikansinya sebagai bahan kosmetik fungsional disorot di sini. Sampai saat ini, belum ada laporan mengenai mekanisme kerja ekstrak biji P. dactylifera L. di bidang kosmetik perawatan kulit atau efek ekstrak biji pada produksi melanin. Fokus penelitian ini adalah untuk mengetahui potensi ekstrak biji P. dactylifera L. sebagai inhibitor melanogenesis untuk industri kosmetik.

Mekanisme yang mendasari efek penghambatan ekstrak biji P. dactylifera L. pada melanogenesis belum diselidiki. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki karakteristik antioksidan dan mekanisme potensial aksi ekstrak biji P. dactylifera L. pada melanogenesis dengan memeriksa regulator transkripsi MITF dan fosforilasi regulator jalur pensinyalan MAPK dan PKA.

cistanche segar

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Bahan Kimia dan Reagen

Reagen kimia yang digunakan dalam penelitian ini dibeli dari Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MS, USA). Antibodi berasal dari Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, USA) dan reagen ECL berasal dari Millipore (Billerica, MA, USA).

2.2. Persiapan dan Ekstraksi Ekstrak Biji P. dactylifera

Buah kering P. dactylifera L. dipanen di 2019 dari toko tradisional yang terletak di Medina City, Arab Saudi. Benih P. dactylifera L. dicuci seluruhnya, dijemur di bawah sinar matahari, dijemur selama satu hari, kemudian dikeringkan pada suhu 80 C selama 2 jam dalam oven. Benih yang dikeringkan dihaluskan menjadi bubuk halus (#50 mesh) dengan penggilingan berkomitmen (Penggilingan Sentrifugal Ultra Retsch dan Mesin Pengayak, Tipe ZM1, Haan, Jerman). Serbuk dikumpulkan dalam botol kaca tertutup dan disimpan pada suhu 25 C sampai digunakan. Bubuk biji P. dactylifera L. bubuk kering (2 g) ditempatkan dalam gelas ekstraksi yang berisi 10 mL air suling. Selanjutnya, ekstraksi ultrasonik dilakukan dengan model ULTRAsonikTM 57H (250 W, C, dan A Sales Industrial Supplies, Yucaipa, CA, USA). Frekuensi kerja 45 kHz selama 30 menit. Setelah ekstraksi, sampel disentrifugasi pada 4500 rpm selama 50 menit pada 25 C dengan Centrifuge Eppendorf 5810 R (Hamburg, Jerman). Supernatan dikumpulkan dan disaring dengan filter nilon (ukuran pori: 0,45 m) dan filtrat dipekatkan hingga 9,8 mg/mL.

2.3. Analisis Ultra-Performance Liquid Chromatography (UPLC) Ekstrak Biji P. dactylifera dan Asam Ferulat

Ekstrak biji P. dactylifera dianalisis menggunakan kelas H ACQUITY UPLC dengan detektor array fotodioda (Waters, Milford, MA, USA). Kolom tersebut adalah kolom ACQUITY UPLC BEH C18, 130 , 1,7 m, 2,1 mm × 100 mm. Fase gerak A adalah 0,5 persen asam asetat, dan fase gerak B adalah asetonitril. Untuk titik waktu 0 dan 5 menit, rasio persentase A/B adalah 95/5; selama 20 menit, rasio persentase A/B adalah 5/95; untuk titik waktu 21 dan 25 menit, rasio persentase A/B adalah 95/5. Asam ferulat (1 ppm) digunakan sebagai standar positif.

2.4. Uji Aktivitas Pemulung DPPH

Dalam pengujian ini, vitamin C ({{0}}.5 mg/mL) dan BHA (0.1 mg/mL) digunakan sebagai standar antioksidan. Ekstrak biji P. dactylifera L. pada berbagai konsentrasi (0.0049, 0,0245, dan 0,049 mg/mL) ditambahkan ke dalam 2,9 mL larutan DPPH (60 M). Komponen antioksidan dalam ekstrak biji dapat mendonorkan hidrogen ke DPPH dan mengubah DPPH menjadi bentuk tereduksi. Penurunan absorbansi yang dihasilkan pada 517 nm dicatat menggunakan spektrofotometer UV-Vis [44].

2.5. Uji Kapasitas ABTS plus Scavenging

Kapasitas penyerapan ABTS plus ekstrak biji P. dactylifera L. dibandingkan dengan vitamin C ({{0}}.9 mg/mL) dan BHA ({{10}}. 9mg/mL). Untuk pengujian ini, ABTS plus digunakan. Kation pertama kali diproduksi dengan mereaksikan larutan ABTS (7 mM) dengan kalium persulfat (2,45 mM), dan campuran didiamkan dalam gelap selama minimal 6 jam sebelum digunakan. Absorbansi pada 734 nm diukur 10 menit setelah pencampuran konsentrasi yang berbeda dari ekstrak biji (0,0098, 0,049, dan 0,098 mg/mL) dengan 1 mL larutan ABTS plus [45].

2.6. Penentuan Kandungan Fenolik Total

Kandungan total fenolik ditentukan dengan menggunakan reagen Folin-Ciocalteu [46], dan asam galat (2 ug/mL) digunakan sebagai standar positif. Konsentrasi yang berbeda dari ekstrak biji P. dactylifera L. (0.0196, 0.098, dan 0,196 mg/mL) dibuat dalam 80 persen metanol; 100 L ekstrak dipindahkan ke dalam tabung reaksi dan 0,5 mL reagen Folin-Ciocalteu (sebelumnya diencerkan 10-kali lipat dengan air deionisasi) ditambahkan dan dicampur. Campuran didiamkan pada suhu kamar selama 5 menit; 1,5 mL natrium karbonat 20 persen ditambahkan. Setelah didiamkan pada suhu kamar selama 2 jam, absorbansi dibaca pada 760 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis.

2.7. Penentuan Kapasitas Pengurangan

Vitamin C ({{0}}.008 mg/mL) atau BHA (4,8 mg/mL) digunakan sebagai standar positif dalam pengujian ini. Kapasitas reduksi ekstrak biji ditentukan menurut metode yang dijelaskan oleh Oyaizu [47]. Berbagai konsentrasi ekstrak biji P. dactylifera L. (0.0073, 0,036, 0,073 mg/mL) dicampur dengan buffer fosfat (2,5 mL, 0,2 M, pH 6,6 ) dan kalium ferisianida [K3Fe (CN)6] (2,5 mL, 1 persen b/v). Campuran diinkubasi pada suhu 50 C selama 20 menit. Asam trikloroasetat (2,5 mL, 10 persen b/v) ditambahkan ke dalam campuran, yang kemudian disentrifugasi pada 1000 × g selama 10 menit. Lapisan atas larutan (2,5 mL) dicampur dengan air suling (2,5 mL) dan FeCl3 (0,5 mL, 0,1 persen b/v), dan diukur absorbansinya pada 700 nm.

2.8. Pengukuran Kapasitas Pengkelat Ion Besi (II)

Untuk pengukuran kapasitas kelat Fe2 plus -ion ekstrak biji P. dactylifera L., EDTA (0.02, 0.04, dan { {10}}.08 mg/mL) digunakan sebagai standar positif. Konsentrasi ekstrak biji yang berbeda (0.0196, 0,098, dan 0,196 mg/mL) ditambahkan ke dalam larutan FeCl2 (0,05 mL, 1 mM). Campuran reaksi direaksikan dengan ferrozine (0,1 mL, 1 mM), kemudian campuran dikuantifikasi menjadi 1 mL dengan metanol dan diinkubasi pada suhu 25 C selama 10 menit. Absorbansi campuran reaksi diukur pada 562 nm [48].

2.9. Uji Viabilitas Sel

Uji viabilitas sel dilakukan dengan menggunakan metode MTT [49]. Sel terkena berbagai konsentrasi ekstrak biji P. dactylifera L. (0.049, 0.245, dan 0,49 mg/mL) selama 24 jam pada 37 C dan 5 persen CO2 dalam inkubator yang dilembabkan dan larutan MTT ditambahkan ke dalam sumur. Turunan MTT yang tidak larut dilarutkan dengan etanol-DMSO (larutan campuran 1:1). Absorbansi sumur pada 570 nm diukur menggunakan pembaca lempeng mikro. Sel B16F10 (BCRC60031) diperoleh dari Bioresource Collection and Research Center (BCRC), kota Hsinchu, Taiwan. Sel-sel dipertahankan dalam DMEM (Hyclone, Logan, UT, USA) ditambah dengan 10 persen serum janin sapi dan 1 persen antibiotik. Selain itu, pengaruh benih P. dactylifera L. terhadap viabilitas sel B16F10 juga dievaluasi dengan metode uji eksklusi trypan blue. Setelah perlakuan dengan ekstrak biji, sel-sel ditripsinisasi dan disentrifugasi untuk mengumpulkan pelet. Pelet sel disuspensikan kembali dalam 300 L media kultur sel DMEM. Sebagian kecil suspensi sel (20 L) dicampur perlahan dengan 10 L trypan blue (4 persen dalam PBS). Jumlah sel dihitung (sel yang tidak dapat hidup berwarna biru dan sel yang hidup tidak diwarnai) dengan menggunakan hemositometer di bawah mikroskop.

2.10. Pengukuran Aktivitas Tirosinase Jamur

Larutan tirosinase jamur (10 L, 200 unit) ditambahkan ke 96-mikroplate sumur. Campuran reaksi mengandung 5 mM L-DOPA yang dilarutkan dalam phosphate-buffered saline (PBS) (50 mM, pH 6,8), dan ekstrak biji P. dactylifera L. (0.049, 0.245 , dan 0,49 mg/mL), asam kojic (200 mM; 0,03 mg/mL), atau arbutin (2 mM; 0,54 mg/mL). Campuran uji diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit dan absorbansi dopakrom yang dihasilkan diukur pada 490 nm. Pengukuran aktivitas tirosinase jamur dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [50].

2.11. Penentuan Kandungan Melanin

Sel B16F10 diperlakukan dengan -MSH (100 nM) selama 24 jam dan kemudian diperlakukan dengan ekstrak biji P. dactylifera L. (0,0245–0,147 mg/mL) atau arbutin (0,54 mg/mL) selama 24 jam tambahan. Setelah perlakuan, pelet sel dilarutkan dalam larutan NaOH (1 N) pada suhu 60 C selama 60 menit. Kandungan melanin terdeteksi pada 405 nm, seperti yang dijelaskan sebelumnya oleh Tsuboi [51].

Cistanche menghambat produksi melanin.

2.12. Pengukuran Aktivitas Tirosinase Intraseluler

Aktivitas tirosinase intraseluler ditentukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [52]. Sel diperlakukan dengan -MSH (100 nM) selama 24 jam dan kemudian dengan ekstrak biji P. dactylifera L. (0.0245–0,147 mg /mL) atau arbutin (0,54 mg/mL) selama 24 jam. Setelah perlakuan, ekstrak sel (100 L) dicampur dengan larutan L-DOPA yang baru disiapkan (0,1 persen dalam PBS) dan diinkubasi pada 37 C, dan diukur absorbansinya pada 490 nm.

2.13. Eksperimen Western Blotting

Sel diperlakukan dengan ekstrak biji P. dactylifera L. ({{0}}.0245, 0.0368, 0.{ {14}}49, dan 0.147 mg/mL) atau arbutin (0,54 mg/mL) dan kemudian dilisiskan dalam PBS yang mengandung nondiet P-40 (1 persen ), natrium deoksikolat (0,5 persen ), natrium dodesil sulfat (SDS, 0,1 persen ), aprotinin (5 ug/mL), fenilmetilsulfonil fluorida (100 ug/mL), pepstatin A (1 ug/mL), dan EDTA (1 mM) pada 4 C selama 20 menit. Total lisat dikuantifikasi menggunakan kit mikro BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Protein (30 ug) diselesaikan dengan elektroforesis gel SDS-poliakrilamida dan secara elektroforesis dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida. Membran diblokir dalam 5 persen susu bebas lemak di PBST (PBS dengan 0,05 persen Tween-20) dan diinkubasi pada 4 C semalaman dengan antibodi primer berikut yang diencerkan dalam PBST: MITF Ab (1:1000), TRP1 Ab (1:6000), TRP2 Ab (1:1000), MC1R Ab (1:500), GAPDH Ab (1:1500), tirosinase Ab (1:2000), p-p38 Ab (1:500), p38 Ab (1:500), p-JNK Ab (1:500), JNK Ab (1:500), p-ERK Ab (1:500), ERK Ab (1:500), p-CERB Ab (1: 500), dan CERB Ab (1:200), semuanya dari Santa Cruz Biotech (Dallas, TX, USA)). Antibodi terikat dideteksi oleh antibodi sekunder terkonjugasi peroksidase lobak (Amersham Corp.) diikuti oleh sistem deteksi ECL (Amersham) sesuai dengan instruksi pabrik.

2.14. Uji Inhibitor PKA

Sel-sel diperlakukan dengan -MSH (100 nM) selama 24 jam diikuti dengan penambahan 1 jam 10 M regulator PKA H89. Setelah pengobatan, ekstrak biji P. dactylifera L. (0,147 mg/mL) dan H89 ditambahkan ke dalam sel dan diinkubasi selama 23 jam. Kandungan melanin ditentukan seperti yang dijelaskan di atas.

2.15. Analisis statistik

Analisis statistik dilakukan menggunakan uji post hoc Tukey, yang digunakan untuk perbandingan data terukur, menggunakan Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versi 22.0 perangkat lunak statistik (SPSS Inc., Chicago, IL, AMERIKA SERIKAT). * p < 0.05="" dianggap="" signifikan,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p=""><>

3. Hasil

3.1. Analisis UPLC Ekstrak Biji P. dactylifera L.

Hasil analisis UPLC ditunjukkan pada Gambar 1A, B. Gambar 1A menggambarkan puncak tumpang tindih ekstrak biji P. dactylifera L. dan asam ferulat pada 330 nm. Gambar 1B menunjukkan spektrum pemindaian serupa antara 220 dan 500 nm untuk ekstrak biji P. dactylifera L. dan asam ferulat.

3.2. Karakteristik Antioksidan Ekstrak Biji P. dactylifera L.

Aktivitas antioksidan ekstrak biji P. dactylifera L. secara in vitro mengungkapkan adanya potensi antioksidan. Dalam uji DPPH, vitamin C ({{0}}.05 mM; 0.53 mg/mL) dan tert-butil hidroksianisol (BHA) (0 0,1 mg/mL) digunakan sebagai standar antioksidan positif. Daya serap DPPH ekstrak adalah 49,97 ± 2,9 persen , 81,36 ± 0,56 persen , dan 78,53 ± 3,83 persen kontrol untuk konsentrasi ekstrak 0.0{{ 31}}49, 0,0245, dan 0,049 (mg/mL), masing-masing. Sebagai perbandingan, kapasitas penyerapan vitamin C dan BHA masing-masing adalah 90,12 ± 0,31 persen dan 90,44 ± 0,49 persen (Gambar 2A).

Kation radikal ABTS ini berwarna biru dan reaktif terhadap sebagian besar antioksidan. Selama reaksi ini, kation radikal ABTS biru diubah kembali menjadi bentuk netralnya yang tidak berwarna. Reaksi dipantau secara spektrofotometri. Daya serap ekstrak ABTS plus adalah 5,69 ± 1,36 persen , 18,81 ± 0,68 persen , dan 66,82 ± 8,51 persen kontrol pada konsentrasi 0.0{{16 }}98, 0.{{20}}49, dan 0.098 mg/mL, masing-masing. Sebaliknya, ABTS plus scavenging capacity vitamin C (0,9 mg/mL) dan BHA (0,9 mg/mL) masing-masing adalah 95,52 ± 0,12 persen dan 40,3 ± 0,83 persen . Hasil pada Gambar 2B menunjukkan bahwa ekstrak biji mengais sejumlah besar ABTS plus radikal.

Untuk menentukan kandungan total fenolik ekstrak biji P. dactylifera L., asam galat (2 ug/mL) digunakan sebagai standar positif. Hasil pada Gambar 2C menunjukkan bahwa kandungan total fenol pada 0.0196, 0.{{20}}98, dan 0. 196 (mg/mL) ekstrak berturut-turut adalah 33,43 ± 2,33 persen , 117,22 ± 7,81 persen , dan 195.4 ± 10.91 persen . Setara asam galat (GAE) dari konsentrasi ekstrak biji yang disebutkan di atas adalah 0.068 ± 0,01, 0,365 ± 0,01, dan 0,642 ± 0,03, masing-masing (Gambar 2C).

3.3. Efek Penghambatan Ekstrak Biji P. dactylifera L. pada Melanogenesis

Hasil yang ditunjukkan pada Gambar 4A menunjukkan bahwa 0.049 mg/mL ekstrak biji P. dactylifera L.tidak memberikan efek penghambatan pada aktivitas tirosinase jamur. Di sisi lain, persentase penghambatan enzim adalah 8,34 ± 2,67 persen dan 33 ± 2,36 persen kontrol untuk 0.245 dan 0.49 mg/mLPerlakuan ekstrak biji P. dactylifera L. masing-masing. Selain itu, persentase penghambatan tirosinase asam kojic (200 μM; 0.03 mg/mL) dan arbutin (2 mM; 0,54 mg/mL ) berturut-turut adalah 56,26 ± 5,06 persen dan 64,56 ± 2,88 persen (Gambar 4A). Dengan demikian, semakin tinggi konsentrasi ekstrak biji P. dactylifera L. (0,245 dan 0,49 mg/mL) dapat mewakili tingkat penghambatan tirosinase jamur.

Pada Gambar 4B, hasilnya menunjukkan bahwa hanya 0.147 mg/mL ekstrak biji P. dactylifera L. yang dapat secara signifikan menurunkan kandungan melanin dalam sel melanoma B16F10. Setelah perawatan, kandungan melanin dalam sel B16F10 adalah 80,66 ± 5,43 persen dari kontrol. Untuk standar positif, arbutin (0.54 mg/mL), kandungan melanin intraseluler yang tersisa adalah 61,19 ± 8,17 persen dari kontrol. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak biji P. dactylifera L. 0,147 mg/mL menunjukkan efek yang lebih kecil dibandingkan arbutin. Nilai aktivitas tirosinase intraseluler yang tersisa masing-masing adalah 85,1 ± 8,1 persen dan 73,7 ± 11,9 persen untuk 0,098 dan 0,147 mg/mL ekstrak biji P. dactylifera L.. Aktivitas tirosinase intraseluler yang tersisa adalah 64,3 ± 14,9 persen dari kontrol setelah sel diobati dengan arbutin (Gambar 4C). Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi ekstrak biji P. dactylifera L. yang lebih tinggi masih menunjukkan efek penghambatan yang lebih kecil pada aktivitas tirosinase yang diinduksi -MSH dalam sel B16F10 daripada arbutin.

3.4. Ekstrak biji P. dactylifera L. Menghambat Tingkat Ekspresi Protein yang Terlibat dalam Melaninogenesis

Western blot digunakan untuk memeriksa tingkat ekspresi protein terkait melanogenesis dalam sel B16F10 (Gambar 5A). Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan dengan berbagai konsentrasi ekstrak biji P. dactylifera L. menyebabkan penurunan kadar MC1R, MITF, tirosinase, TRP1, dan TRP2. Efek penghambatan ekstrak pada ekspresi protein terlihat pada konsentrasi {{10}}.147 mg/mL. Perubahan lipat tingkat ekspresi protein untuk MC1R adalah 0.74 ± 0.02; untuk MITF adalah {{20}}.51 ± 0.03; untuk tirosinase adalah 0.54 ± 0.26; untuk TRP-1 adalah 0,57 ± 0,15; dan untuk TRP-2 adalah 0,49 ± 0,1 (Gambar 5B).

Tingkat ekspresi protein pensinyalan terkait melanogenesis diperiksa menggunakan Western blots (Gambar 5C). Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan ekstrak biji P. dactylifera L. sebesar 0.147 mg/mL ternyata menyebabkan penurunan kadar p-p38, p-JNK, p-ERK, dan p-CREB. Perubahan lipat tingkat ekspresi protein untuk p-p38 adalah 0.88 ± 0.15; untuk p-JNK adalah 0.68 ± 0.39; untuk p-ERK adalah 0.65 ± 0.23; dan untuk p-CREB adalah 0.44 ± 0.07 (Gambar 5D).

3.5. Ekstrak Biji P. dactylifera L. Tidak Mempengaruhi Ekspresi Gen Tirosinase, TRP1, TRP2, atau MITF

Tingkat ekspresi gen protein terkait melanogenesis, seperti tirosinase, TRP1, TRP2, dan MITF diperiksa dengan reaksi rantai polimerase waktu nyata kuantitatif (RT-PCR). Tingkat ekspresi relatif normal tirosinase/GAPDH untuk 0.0367, 0.049, dan 0.147 mg/mL P. Perlakuan ekstrak biji dactylifera L. berturut-turut adalah 3,51 ± 0.52, 2.38 ± 0.24, dan 1.64 ± 0.55. Untuk TRP-1/GAPDH, tingkat ekspresi ternormalisasi relatif untuk 0.0367, 0.049, dan {{4{{43} }}}.147 mg/mL ekstrak biji P. dactylifera L. perlakuan adalah 1,64 ± 0.2, 1,15 ± 0.02, dan 0. 89 ± 0.07, masing-masing. Tingkat ekspresi relatif ternormalisasi dari TRP-2/GAPDH untuk 0.0367, 0.049, dan 0.147 mg /mL ekstrak biji P. dactylifera L. berturut-turut adalah 1,08 ± 0.13, 0.85 ± 0,01, dan 0,7 ± 0,05. Untuk MITF/GAPDH, tingkat ekspresi relatif ternormalisasi untuk 0,0367, 0,049, dan 0,147 mg/mL perlakuan ekstrak biji P. dactylifera L. berturut-turut adalah 1,48 ± 0,19, 1,03 ± 0,02, dan 0,74 ± 0,05 (Gambar 6).

4. Diskusi

Telah dilaporkan bahwa melanogenesis meningkatkan stres oksidatif seluler. Selain itu, beberapa antioksidan, ROS scavengers, inhibitor scavengers, dan inhibitors dapat menghambat sintesis melanin yang dimediasi UV [54]. Oleh karena itu, antioksidan, pemulung ROS, dan penghambat melanogenesis telah semakin banyak diterapkan pada kosmetik pemutih kulit untuk pencegahan hiperpigmentasi kulit yang tidak diinginkan [14]. Ditemukan juga bahwa stimulasi metallothionein, antioksidan endogen dapat menekan melanogenesis pada melanosit [55]. Kulit manusia sering terpapar polutan pengoksidasi lingkungan atau sinar UV dan rusak oleh faktor lingkungan ekstrinsik. Secara khusus, iradiasi UV telah dilaporkan menginduksi pembentukan ROS di kulit dan meningkatkan peroksidasi lipid membran sel [56]. Untuk melawan stres oksidatif, kulit dilengkapi dengan sistem antioksidan tertentu [57].

Untuk menjelaskan aktivitas antioksidan ekstrak biji P. dactylifera L., DPPH dan ABTS ditambah aktivitas radikal, kandungan fenolik total, kapasitas pereduksi, dan kapasitas pengikatan ion logam dari ekstrak ditentukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [47,48]. Ekstrak biji P. dactylifera L. memberikan aktivitas antioksidan yang cukup besar dalam semua studi analitik yang disebutkan di atas. Hasil penelitian menunjukkan potensi antioksidan ekstrak biji P. dactylifera L. pada rentang yang berbeda dengan efisiensi yang berbeda. Aktivitas pemulungan DPPH dari ekstrak biji ditunjukkan pada Gambar 2A berbeda dari ABTS plus yang ditunjukkan pada Gambar 2B, yang mungkin dihasilkan dari mekanisme yang berbeda dari interaksi antioksidan-radikal. Selain itu, stoikiometri reaksi antara komponen antioksidan dalam ekstrak biji dapat bervariasi, yang menghasilkan perbedaan kapasitas penangkal radikal bebas [58]. Potensi antioksidan dalam ekstrak biji P. dactylifera L. dapat mengubah kompleks Fe3 plus /ferricyanide menjadi bentuk besi, dan kapasitas pereduksi berfungsi sebagai indikator aktivitas antioksidan ekstrak biji yang ditunjukkan pada Gambar 2D. Ditemukan bahwa asam kojic [59] bertindak sebagai inhibitor tirosinase karena asam kojic bertindak sebagai chelator logam untuk mengkhelat ion tembaga dan menghambat ion memasuki situs aktif tirosinase. Oleh karena itu, antioksidan dalam ekstrak biji dapat membentuk kompleks logam yang tidak larut dengan ion besi dan kemudian menghambat interaksi antara ion logam dan lipid. Kapasitas pengkelat ion logam yang lebih tinggi dari ekstrak biji menunjukkan aktivitas antioksidan potensial dan kemungkinan efek penghambatan pada aktivitas tirosinase (Gambar 2E).

Prinsip pengujian ROS intraseluler adalah bahwa DCFH-DA berdifusi melalui membran sel dan dihidrolisis secara enzimatik menjadi DCFH oleh esterase; kemudian DCFH bereaksi dengan ROS (seperti H2O2) untuk menghasilkan DCF. Peningkatan DCF yang cepat menunjukkan oksidasi DCFH oleh radikal intraseluler [60]. Ide di balik pencarian antioksidan baru untuk aktivitas pemutihan kulit terletak pada hipotesis bahwa stres oksidatif yang dihasilkan dari penyinaran UV dapat berkontribusi pada stimulasi sintesis melanin. Iradiasi UV telah dilaporkan menghasilkan ROS di jaringan kulit yang dapat menginduksi produksi melanin dengan mengaktifkan tirosinase [61]. Selain itu, dilaporkan bahwa beberapa agen pemutih kulit dapat menghambat melanogenesis dengan berinteraksi dengan ion tembaga di situs aktif tirosinase atau dengan o-kuinon untuk memblokir polimerisasi zat antara dalam jalur sintetis melanin [62]. Selain itu, vitamin C atau vitamin E dapat mengurangi oksidasi partikel melanin yang sudah ada sebelumnya. Oleh karena itu, vitamin ini telah banyak digunakan dalam produk pemutih kulit [63]. Menariknya, hasil kami menunjukkan karakteristik antioksidan ekstrak biji P. dactylifera L., menunjukkan bahwa ekstrak biji P. dactylifera L. dapat bertindak sebagai bahan pemutih kulit dalam kosmetik.

Uji MTT adalah uji kolorimetri terkenal yang mengukur aktivitas enzim oksidoreduktase yang bergantung pada NADH/NADPH seluler yang mereduksi MTT menjadi pewarna formazan berwarna ungu. Uji ini dapat diterapkan untuk menguji potensi sitotoksisitas bahan obat dan bahan beracun, karena bahan ini meningkatkan atau menghambat viabilitas sel. Hasil yang ditunjukkan pada Gambar 3A sesuai dengan uji eksklusi Trypan blue pada Gambar 3B, yang menunjukkan bahwa ekstrak biji P. dactylifera L. tidak memiliki efek sitotoksik pada viabilitas sel melanoma B16F10.

Tirosinase jamur umumnya digunakan sebagai enzim target untuk menyaring penghambat potensial melanogenesis. Pertama kali ditemukan bahwa kisaran dosis ({{0}}.049–0,49 mg/mL) ekstrak biji P. dactylifera L. dapat menghambat aktivitas tirosinase jamur. Hasil yang ditunjukkan pada Gambar 4A menunjukkan bahwa ekstrak biji menunjukkan dampak penghambatan yang lebih rendah pada aktivitas tirosinase jamur daripada asam kojic. Tirosinase memainkan peran utama dalam dua langkah pertama dari jalur melanogenesis. Untuk menjelaskan efek penghambatan sebenarnya dari ekstrak biji P. dactylifera L. pada produksi melanin, kandungan melanin B16F10 dan aktivitas tirosinase intraseluler ditentukan. Hasil yang disajikan pada Gambar 4B menunjukkan bahwa konsentrasi yang lebih tinggi dari ekstrak biji P. dactylifera L. memberikan efek penghambatan yang jelas pada pembentukan melanin. Data menunjukkan bahwa ekstrak biji P. dactylifera L. benar-benar menghambat melanogenesis pada sel melanoma. Dengan ini, hasil yang ditampilkan pada Gambar 4C sesuai dengan hasil yang ditunjukkan pada Gambar 4B. Dalam percobaan seluler tersebut, -MSH digunakan sebagai penginduksi untuk merangsang sintesis melanin. -MSH dilaporkan mengikat reseptor melanocortin 1 (MC1R) dan mengaktifkan adenilat siklase intraseluler, yang pada gilirannya mengkatalisis ATP menjadi cAMP dan mengaktifkan PKA yang bergantung pada cAMP. Hasil pada Gambar 5A mengungkapkan bahwa ekstrak biji P. dactylifera L. menghambat ekspresi MC1R, sehingga menghalangi produksi melanin yang diinduksi oleh upregulasi cAMP intraseluler yang dimediasi -MSH. Selanjutnya, jalur pensinyalan PKA yang dimediasi cAMP tidak aktif dan melanogenesis dihambat. Untuk mengkonfirmasi kesimpulan, kami telah melakukan percobaan inhibitor PKA, dan data yang ditunjukkan pada Gambar 4D menunjukkan efek penghambatan ekstrak biji P. dactylifera L. (0,147 mg/mL) pada melanogenesis dalam sel B16F10 ditekan oleh H{{ 24}}pengobatan. H89 (N-[2-p-bromocinnamylamino-ethyl]-5-isoquinolinesulphonamide) adalah penghambat PKA yang selektif dan poten. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pensinyalan PKA yang dimediasi cAMP dipengaruhi oleh ekstrak biji P. dactylifera L..

Tirosinase, TRP1, dan TRP2 adalah tiga enzim utama yang mengatur sintesis melanin dalam sel mamalia [64]. Selanjutnya, MITF adalah pengatur transkripsi utama tirosinase, TRP1, dan TRP2, dan merupakan pengatur pigmentasi melanosit yang paling penting [65]. Hasil pada Gambar 5A menunjukkan bahwa ekstrak biji P. dactylifera L. menurunkan tingkat ekspresi protein dari protein yang berhubungan dengan melanogenesis ini, menghambat aktivitas tirosinase, dan menurunkan kandungan melanin dalam sel B16F10.

Dalam penelitian ini, ekstrak biji P. dactylifera L. menekan fosforilasi CREB dan aktivasi PKA. Data ini menunjukkan bahwa jalur cAMP-PKA mungkin bertanggung jawab untuk anti-melanogenesis yang diinduksi ekstrak biji P. dactylifera L. (Gambar 5C).

MAPK telah dilaporkan memodulasi melanogenesis [66]. Keluarga MAPK terdiri dari tiga jenis protein kinase, termasuk extracellular responsive kinase (ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK), dan p38 MAPK. MAPK p38 dapat mengaktifkan protein pengikat elemen respons cAMP (CREB dan CREB mengaktifkan ekspresi MITF, yang secara positif berkontribusi pada sintesis melanin [67]. Hasil pada Gambar 5C memberikan bukti bahwa ekstrak biji P. dactylifera L. dapat menonaktifkan CREB, JNK, dan p38, pada gilirannya menghambat ekspresi MITF (Gambar 5A). Hasil ini menunjukkan bahwa efek antimelanogenik yang diinduksi ekstrak biji dactylifera L. dapat dimediasi oleh downregulasi jalur PKA. Selain itu, iradiasi sinar UV telah dilaporkan berperan fitur menonjol dalam inisiasi beberapa gangguan kulit, termasuk scaling, kerutan, dan hiperpigmentasi [68].Hasil menunjukkan bahwa ekstrak biji P. dactylifera L. menurunkan produksi melanin, yang mungkin dikaitkan dengan penipisan ROS intraseluler.

Untuk menilai pengaruh ekstrak biji P. dactylifera L. pada produksi melanin seluler, kami menentukan kadar mRNA dalam sel B16F10 yang diberi ekstrak biji -MSH dan P. dactylifera L.. Sel yang diobati dengan -MSH menunjukkan peningkatan kadar MITF, tirosinase, TRP-1, dan TRP-2, seperti yang diharapkan. Menariknya, sel-sel yang diberi ekstrak biji P. dactylifera L. menunjukkan penurunan ekspresi mRNA dari gen-gen yang berhubungan dengan melanogenesis ini. Namun, tidak ada perbedaan yang signifikan secara statistik antara kolom, yang menunjukkan bahwa ekstrak biji P. dactylifera L. tidak mempengaruhi tingkat ekspresi gen MITF, tirosinase, TRP1, dan TRP2.

Ini adalah produk kami.

Untuk informasi lebih lanjut, silakan klik di sini.

Telah dilaporkan bahwa asam fenolik utama yang ditemukan dalam biji P. dactylifera L. adalah asam ferulat [69]. Asam ferulat telah terbukti efektif menghambat sintesis melanin dalam sel melanoma B16 dengan menghambat kasein kinase 2- yang diinduksi fosforilasi tirosinase dengan cara yang bergantung pada dosis [70]. Laporan ini mendukung hasil kami yang ditunjukkan pada Gambar 1—asam ferulat dalam ekstrak air biji P. dactylifera L. berkontribusi pada penghambatan melanogenesis dalam sel B16F10. Tentu saja, komponen fungsional lain dalam ekstrak biji harus diselidiki dalam waktu dekat.

Hasil kami menunjukkan bahwa ekstrak biji P. dactylifera L. menghambat melanogenesis dalam sel B16F10 dengan menurunkan regulasi jalur pensinyalan PKA. Oleh karena itu, ekstrak biji P. dactylifera L. dapat digunakan sebagai bahan pemutih kulit yang efektif.

5. Kesimpulan

Ini adalah laporan pertama tentang mekanisme kerja ekstrak air biji P. dactylifera L. dalam sintesis melanin. Penelitian ini menunjukkan keterlibatan jalur cAMP/PKA/CREB dalam efek depigmentasi ekstrak biji P. dactylifera L.. Hasil kami menunjukkan bahwa ekstrak biji P. dactylifera L. menghambat melanogenesis dalam sel B16F10 dengan menurunkan regulasi jalur pensinyalan PKA. Oleh karena itu, ekstrak biji P. dactylifera L. dapat digunakan sebagai agen antitimelanogenesis dermatologis baru dan agen pemutih kulit yang efektif.