Prinsip Anti-Inflamasi Dari Jarum Pinus Taiwanensis Hayata Dan Dalam Studi Silico Potensi Efek Anti-Penuaan Mereka

Abstrak:Pinusteh jarum sangat populer di negara-negara Timur seperti Jepang, Rusia, Korea, dan Cina. Teh jarum pinus diklaim memiliki khasiatefek anti-penuaan,tetapi tidak ada bukti jelas yang mendukung hal ini sampai sekarang. Dalam penelitian ini, lima belas senyawa yang belum terdeskripsikan (1–5), serta tujuh puluh dua senyawa yang diketahui, dimurnikan dan dikarakterisasi dari fraksi bioaktif ekstrak metanolP. taiwanensisjarum.

Produk Cistanche Herbal Anti Penuaan Terbaik

Sebagian besar isolat diperiksa untuk merekabioaktivitas anti-inflamasioleh model neutrofil seluler dan enam senyawa (45, 47, 48, 49, 50, Dan51) dipamerkan apenghambatan yang signifikan pada pembentukan anion superoksidadan pelepasan elastase dengan nilai IC50 mulai dari 3,3± 0.9 hingga 8.3± 0.8 µM.Inibahan anti inflamasimenjadi sasaran komputasi docking untuk mengevaluasi afinitas pengikatan mereka pada reseptor ghrelin, yang memainkan peran penting dalam mengatur metabolisme, denganefek anti-penuaan. Senyawa49, 50, Dan51 membentuk kompleks yang stabil dengan reseptor ghrelin melalui ikatan hidrogen dan berbagai jenis interaksi.

1. Perkenalan

Pinusgenus (Pinaceae), yang terdiri dari lebih dari 100 spesies dan terutama tersebar di belahan bumi utara, umumnya merupakan pohon yang selalu hijau sementara beberapa semak [1]. Kayu pinus ringan dan sering digunakan untuk furnitur. Namun, berbagai efek farmakologis jarum pada pucuk pinus telah dicatat dalam buku kuno pengobatan tradisional Tiongkok. Dalam "The Divine Husbandman's Herbal Foundation Canon", jarum pinus meningkatkan pertumbuhan rambut, memperpanjang umur, dan memuaskan dahaga. Dalam "Taiping Shenghui Fang", tercatat bahwa jarum pinus dapat dimasak dengan alkohol dan menunjukkan efek anti-penuaan. Saat ini, daun pinus diolah menjadi teh dan populer di Asia. Di Korea, konstituen dariP. densiflorajarum teh serta nyabioaktivitas antioksidan dan anti-bakteri diselidiki secara ekstensif.2,3]. Sejak awal abad lalu, lebih dari tujuh ratus senyawa telah diidentifikasiJarum Pinus. Sebagian besar literatur yang dilaporkan terkait dengan minyak atsiriP. densiflflora[4,5], P.halepensis[6,7], P.nigra[4,8], DanP. sylvestris[4,9]. Komponen yang dicirikan dariPinusjarum kebanyakan benzenoid, diterpenoid, flavonoid, lignan, monoterpenoid, dan seskuiterpenoid [10]. Jarum dariP. densifloraDanP. morrisonicolatelah dilaporkan untuk bioaktivitas antioksidan mereka [11–14]. Selain itu, ekstrak etil asetat dari jarumP. morrisonicolamenghambat ekspresi protein dan mRNA dari NO daniNOS dalam makrofag RAW 264.7 yang diinduksi LPS, menunjukkan bioaktivitas antiinflamasi yang signifikan [13]. Ekstrak fluida superkritis dariP. densiflorajarum menunjukkan efek penghambatan pada produksi NO yang diinduksi LPS dengan menurunkan regulasi ekspresiiNOS, dan mengurangi ekspresi IL-6 dan IL-1 dan aktivasi protein STAT1 dan STAT3 dalam makrofag yang diinduksi oleh LPS [15]. Ekstrak etanol dariP. thunbergiijarum menunjukkan efek antiinflamasi yang signifikan pada makrofag dan menekan edema telinga yang diinduksi asam arakidonat dan menghambat aktivitas enzimatik myeloperoxidase [16]. Apalagi difermentasiP. morrisonicolajarum menunjukkan bioaktivitas antioksidan dan anti-inflamasi yang sangat baik dengan memodulasi NF-κJalur pensinyalan B [17]. 

Ghrelin adalah hormon peptida yang terdiri dari dua puluh delapan asam amino dan awalnya ditemukan di perut [18,19]. Ini adalah ligan endogen untuk secretagogue hormon pertumbuhan (GHSR), yang merupakan anggota dari -cabang di GPCR kelas A (G Protein Coupled Receptors) [18,19]. Ghrelin adalah satu-satunya hormon peptida yang menyebabkan rasa lapar untuk meningkatkan nafsu makan.20]. Banyak penelitian menunjukkan bahwa ghrelin memainkan peran penting dalam mengatur metabolisme, keseimbangan energi, memori, kardiovaskular, dan fungsi gastrointestinal dalam tubuh manusia.21–23]. Ghrelin juga terlibat dalam berbagai mekanisme fisiologis dan patofisiologis pada tubuh manusia seperti penuaan.24,25], dan mungkin terkait dengan aktivitas antiinflamasi [26,27]. Pada tahun 2014, flflavonoid tetra glikosida unik bernama teaghrelins, pertama kali diidentifikasi dalam teh oolong Chin-shin oleh kelompok kami dan menunjukkan aktivitas promosi mereka dalam pelepasan hormon pertumbuhan (GH).28]. Dua senyawa serupa lainnya dimurnikan dalam teh oolong Shy-jih-chuen dan bioaktivitasnya pada reseptor ghrelin juga diverifikasi [29]. Keempat teaghrelin menginduksi rasa lapar melalui jalur pengaturan yang sama dengan ghrelin. Tidak terbatas pada teh, senyawa dengan struktur atau bioaktivitas yang mirip dengan teaghrelin juga telah dieksplorasiPolygonum multiflorum(Dia houwu) [30], Ginkgo Biloba[31], Morus alba[32], DanCistanche tubulosa [33]. Hasil ini mendukung kami dalam mencari prinsip anti-penuaan alami dengan menyaring senyawa mirip ghrelin teh yang memiliki efek antiperadangan. Selain secara langsung melakukan aktivitas promosi dalam pelepasan hormon pertumbuhan dalam model seluler, pemodelan molekul dari beberapa senyawa potensial akan lebih efisien dalam menjajaki kandidat yang mungkin [34]. Metode komputasi telah diterapkan untuk pengembangan dan evaluasi hipotesis farmakologis. Molecular docking adalah salah satu teknik yang paling umum digunakan dan mengantisipasi konformasi dan afinitas pengikatan ligan ke kantong aktif dengan akurasi tinggi [35,36]. Metode docking secara efektif mencari ruang berdimensi tinggi untuk kemungkinan interaksi dan menggunakan fungsi penilaian yang memeringkat kandidat dengan benar [37]. 

Pada tahun 2018, tiga senyawa dimurnikan dari jarumP. morrisonicoladan menunjukkan aktivitas vasorelaksan yang signifikan, dan di antara konstituen ini, satu dilaporkan dengan struktur seperti ghrelin teh [38]. Di Taiwan,P. taiwanensisjarum biasanya dikeringkan dan dipanggang lalu diolah sebagai teh karena bioaktivitasnya yang terkenal.P. taiwanensisHayata adalah salah satu spesies asli dan endemik di Taiwan. Ini juga disebut pinus merah Taiwan, atau pinus huangshan. Ada dua jarum dalam jilid dengan panjang 8–11 cm dan agak kaku dan lurus, dan tumbuh di seluruh pulau dari dataran rendah hingga tinggi dan sering membentuk hutan murni [39]. Pada pemeriksaan pendahuluan, lapisan etil asetat dari ekstrak metanolP. taiwanensisjarum menunjukkan penghambatan yang signifikan pada pembentukan anion superoksida dan pelepasan elastase dengan IC50 nilai 0.8± {{0}}.2 dan 1.0± 0.1 µg/mL, masing-masing (Tabel S1). Oleh karena itu, dalam penelitian ini, konstituen bioaktif dariP. taiwanensisjarum diselidiki dan senyawa yang dimurnikan dievaluasi untuk anti-inflamasinya bioaktivitas pada model neutrofil seluler. Selain itu, isolat dariP. taiwanensisjarum dengan bioaktivitas antiinflamasi menjadi sasaran komputasi docking dandiselidiki untuk interaksi mereka dengan reseptor ghrelin.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Prosedur Eksperimental Umum

spektrum ultraviolet (UV) diperoleh dengan Hitachi U-2001 UV/V adalah spektrometer. Ituspektrum inframerah (IR) diperiksa dengan spektrofotometer Jasco FT/IR-4100.1H-, 13C-, dan spektra resonansi magnetik nuklir (NMR) 2D direkam pada Bruker AV-400spektrometer NMR. Pergeseran kimia ditunjukkan padaδ nilai (ppm) dengan tetramethylsilanesebagai standar internal. ItuδH DanδC nilai adalah untuk pergeseran kimia dari sinyal,masing-masing. Spektrometri massa ionisasi elektrospray resolusi tinggi (HR-ESI-MS).dilakukan dengan spektrometer JEOL JMS-700 (dioperasikan dalam mode ion negatif).

2.2. Bahan Tumbuhan

Jarum dariP. taiwanensisdikumpulkan di Puli, Nantou, Taiwan dan diidentifikasioleh Prof. Sheng-Yang Wang (Departemen Kehutanan, National Chung-Hsing University,Taichung, Taiwan). Spesimen voucher (PCKuo_2016003) disimpan di bar herbalium Sekolah Farmasi, Universitas Nasional Cheng Kung, Tainan, Taiwan.

2.3. Ekstraksi dan Isolasi

2.4. Data Spektral dan Fisik 1–5

2.4.2. 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -Dihidroksi-70 -(4-hidroksi-3-metoksifenil)propan-80 -iloksi]-2-Asam hidroksibenzoat (2)Sirup tidak berwarna; [ ]25 D ditambah 5,3 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH)λmaks(catatanε) 284 (3.59), 253 (3,80) nm; PAUD (c 3.51 × 10−4 M, MeOH)λmaks(∆ε) 248 ( ditambah 1,33), 224 ( ditambah 1,03),214( ditambah 1,10) nm; IR (rapi)νmaks3425, 2927, 1541, 1384, 1271 cm−1;1Tangan13C NMR; HRESIMSm/z 349.0936 ([M − H]− calcd untuk C17H17O8, 349.0923).

2.4.3. (13E,12R)-12-Asam Hidroksiagatik (3)

bubuk tidak berwarna; mp: 263◦C (des.); [ ]25 D ditambah 30,8 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH)λmaks(catatanε) 225 (sh) (3,83) nm; IR (rapi)νmaks3450, 2937, 1648, 1252 cm−1;1H-NMR (CD3OD,400 MHz) δ 0.63 (3H, s, CH3-20), 1,09 (1H, ddd,J = 13.6, 13.6, 3.6 Hz, H-3a), 1.21 (3H, s, CH3-18), 1.21 (1H, m, H-1a), 1.42 (1H, m, H-5), 1.51 (1H, m, H-2a), 1.59 (2H, m, H-11),1.79 (1H, m, H-1b), 1.91 (1H, m, H-2b), 1.91 (1H, m, H-6a), 1.98 (1H, m, H-7a), 2.01 (1H, m,H-6b), 2,08 (3H, s, CH3-16), 2.12 (1H, m, H-9), 2.14 (1H, m, H-3b), 2.43 (1H, m, H-7b), 4.03 (1H, hh,J = 9.2, 2,8 Hz, H-12), 4,53 (1H, s, H-17a), 4,91 (1H, s, H-17b), 5,88 (1H, br s, H-14);13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ 13.5 (CH3-20), 14.9 (CH3-16), 21.2 (C-2), 27.6 (C-6), 29.6 (CH3-18), 31.5 (C-11), 39.4 (C-3), 40.0 (C-7), 40.3 (C-1), 41.2 (C-10), 45.3 (C-4), 53.1 (C-9), 57.6 (C-5), 75.5 (C-12), 106.9 (C-17), 117.8 (C-14), 150.2 (C-8), 159.5 (C-13), 167.2 (C-15), 181.5 (C-19); HRESIMSm/z 349.2024 ([M − H]− calcd untuk C20H29O5, 349.2015).

2.4.4. 5-Isopropil-3-oksosikloheks-1-ena-1-asam karboksilat (4)

kristal tabular tidak berwarna; mp: 235◦C (des.); [ ]25 D ditambah 28,6 (c 0.3, MeOH); UV (MeOH)λmaks(catatanε) 237 (sh) (3,40) nm; IR (rapi)νmaks3456, 2925, 1635, 1395 cm-1;1H-NMR (CD3OD,400 MHz) 0,88 (3H, d,J = 6.8 Hz, CH3-9), 0.98 (3H, d, J = 6.8 Hz, CH3-10), 1.84 (1H, m, H-4a), 2,02 (1H, m, H-4b), 2,09 (1H, m, H-5), 2,31 (1H, hept,J = 6.8 Hz, H-8), 2,50 (1H, dddd,J = 19.2, 9.2, 4.8, 2.4 Hz, H-6a), 2.70 (1H, dddd,J = 19.2, 5.2, 5.2, 1.2 Hz, H-6b), 6.32 (1H, dd,J = 2.4, 1,2 Hz, H-2);13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ 19.0 (C-9), 20.9 (C-10), 24.3 (C-4), 27.0 (C-6), 27.1 (C-8), 53.7 (C-5), 128.7 (C-2), 160.6 (C-1), 174.8 (C-7), 205.7 (C-3); HRESIMSm/z 181.0855 ([M − H]− calcd untuk C10H13O3, 181.0865).

2.4.5. Asam Stiraksinolat (5)

Sirup tidak berwarna; UV (MeOH)λmaks(catatanε) 308 (2.89), 237 (sh) (3.37), 222 (sh) (3.70) nm;IR (rapi)νmaks3421, 2926, 1572, 1395, 1268 cm-1;1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) 1,82 (2H, tt,J {{0}.0, 6,8 Hz, H-8), 2,61 (2H, t,J {{0}.0 Hz, H-7), 3,56 (2H, t,J = 6.8 Hz, H-9), 3.83 (3H, s, OCH3-3), 6.86 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-4), 7.31 (1H, d,J = 2.4 Hz, H-6);13C-NMR (CD3OD,100 MHz)δ 32,7 (C-7), 35,6 (C-8), 56,6 (OCH3-3), 62.3 (C-9), 116.3 (C-4), 120.1 (C-1), 122.8 (C-6), 131,9 (C-5), 149,2 (C-3), 150,7 (C-2), 176,2 (C-10); HRESIMSm/z 225.0767 ([M − H]−calcd untuk C11H13O5, 225.0763).

2.5. Pemeriksaan Bioaktivitas Anti Inflamasi

2.5.1. Persiapan Neutrofil Manusia

Studi dilakukan dengan persetujuan Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital (IRB No. 201800369A3). Sampel darah diambil dari donor manusia yang sehat (20 hingga 30 tahun), dan neutrofil diisolasi dan dimurnikan sesuai dengan protokol yang dijelaskan sebelumnya [40]. 

2.5.2. Generasi Anion Superoksida

Pengukuran Pengujian untuk mengukur pembentukan anion superoksida didasarkan pada reduksi ferisitokrom yang dapat dihambat oleh SODc seperti yang dijelaskan sebelumnya [40].

2.5.3. Uji Rilis Elastase

Degranulasi butiran azurofilik ditentukan dengan mengukur pelepasan elastase seperti yang dijelaskan sebelumnya [40]. 

2.5.4. Analisis Statistik Hasilnya dinyatakan sebagai rata-rata± kesalahan standar rata-rata (SEM). Perhitungan konsentrasi penghambatan 50 persen (IC50) dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak PHARM/PCS v.4.2. Perbandingan statistik dibuat antar kelompok menggunakan Student'st-tes. Nilai darip < 0.05 were considered to be statistically significant. 

2.6. Studi Docking Molekuler

Itusecara silikodilakukan evaluasi terhadap software AutoDock Vina [41]. Struktur kristal reseptor ghrelin telah dikarakterisasi [42], dan . File PDB diunduh dari Protein Databank (PDB ID: 6KO5). Struktur 3D ligan dibangun dalam program Chem3D. Suplemen hidrogen, pengukuran muatan Gasteiger untuk atom protein, dan pemilihan torsi fleksibel untuk ligan dilakukan oleh AutodockTools (ADT versi 1.5.6). Ukuran grid dirancang sebesar 18,5 Å× 18.5 Å × 18,5 Å dan pusat kisi pada dimensi (x, y, dan z, masing-masing): 9,7, –19,2, 14,6 ditentukan. Energi afinitas pengikatan diberikan sebagai skor docking dan ditunjukkan dalam kkal/mol. Interaksi terbaik hanya dianggap sebagai pose dengan skor tertinggi. Visualisasi interaksi docking terbaik dianalisis di klien Biovia Discovery Studio 2020 [43].