Biomaterial Antioksidan Alami Baru Dari Daun Cinnamomum Osmophloeum Kanehira Menekan Melanogenesis Dan Melindungi Dari Kerusakan DNA

Kontak: ali.ma@wecistanche.com

Yung-Shu Ho 1, Jane-Yii Wu 1,* dan Chi-Yue Chang 2

Abstrak:Cinnamomoum ​​osmophloeum Kanehira (COK) adalah spesies pohon asli di Taiwan.Komposisi kimia,antioksidanaktivitas, jamurtirosinasepenghambatan, sintesis melanin, dan perlindungan terhadap kerusakan DNA hidrosol dari daun COK dengan destilasi uap diperiksa. Kami melakukan 1,1-difenil-2-pemulungan radikal pikrilhidrazil, pengkelat ion logam, daya pereduksi, dan uji kapasitas antioksidan setara Trolox (TEAC) dan menentukan korelasi antara kandungan total fenolik dan aktivitas antioksidan. Temuan menunjukkan bahwa sifat anti-oksidatif hidrosol COK berkorelasi erat dengan kandungan fenolnya. Selain itu, konstituen utama hidrosol, yaitu, sinamaldehida dan benzaldehida, memiliki efek anti-tirosinase yang bergantung pada dosis terhadap aktivitas monofenolase dan difenolase. Analisis GC-MS mengungkapkan bahwa komponen bioaktif utama hidrosol adalah trans-sinamaldehida (87,7 persen), benzaldehida (7,0 persen ), dan cinnamyl asetat (5,3 persen). Selain itu, kami menemukan bahwa hidrosol dengan adanya benzaldehida lebih kuat daripada cinnamaldehyde murni, dan meningkatkantirosinaseaktivitas penghambatan hidrosol. Dalam analisis kinetik, plot dan plot Lineweaver-Burk menunjukkan bahwa COK hidrosol adalah inhibitor tipe campuran. Selain itu, kami menemukan bahwa COK hidrosol dosis sangat rendah menekan sintesis -melanocyte-stimulating hormone-induced dari faktor transkripsi terkait mikroftalmia, yang menyebabkan penurunan sintesis melanin dalam sel melanoma B16-F10. Hasil ini menunjukkan bahwa produksi hidrosol dari daun COK menggunakan destilasi uap dapat memberikan sumber yang aman dan berkhasiatkulit-pemutihagen untuk aplikasi kosmetik dan farmasi, denganantioksidan, anti-tirosinase, anti-melanogenesis, dan aktivitas pelindung DNA.

Kata kunci: antioksidanaktivitas; Cinnamomoum ​​osmofloeum; hidrosol;tirosinaseaktivitas penghambatan;pemutih; Efek perlindungan kerusakan DNA

Klik untukBentengbatang dan produk untuk memutihkan kulit

1. Perkenalan

Gangguan kulit manusia seperti lentigo, bintik-bintik penuaan, melasma, dan melanoma maligna telah dikaitkan dengan pembentukan dan akumulasi melanin [1]. Penghambatan tirosinase dan melanogenesis dapat memperbaiki kelainan dermatologis dan sindrom hiperpigmentasi. Selain itu, pasar global untuk bahan pemutih kulit dan produk kosmetik telah berkembang baru-baru ini karena warna kulit yang lebih terang lebih disukai oleh banyak orang yang berkulit lebih gelap [2]. Oleh karena itu, efektif dan amantirosinasedan penghambat sintesis melanin dianggap penting untuk pencegahan penyakit pigmentasi dan masalah kesehatan manusia terkait melanin lainnya [3,4]. Selain itu, racun lingkungan menyebabkan berbagai tekanan oksidatif pada manusia, dan dapat menghasilkan spesies nitrogen reaktif atau spesies oksigen reaktif (ROS) [5]. Radikal bebas dan ROS yang berlebihan dikaitkan dengan jalur sinyal inflamasi, yang pada akhirnya menyebabkan kerusakan sel, penuaan, gangguan saraf, diabetes, aterosklerosis, inflamasi, penyakit kardiovaskular, kanker, dan melanogenesis [6,7]. Beberapa penelitian menunjukkan bahwaantioksidandapat menghambat kerusakan tekanan oksidatif dengan bertindak sebagai pemulung radikal bebas atau ROSscavengers [7,8]. Selain itu, baik penghambat pembentukan ROS dan pemulung ROS dapat mengurangi produksi pigmen melanin [9]. Secara khusus,tirosinaseadalah enzim kunci yang mengkatalisis langkah pembatas kecepatan pada dua langkah pertama selama proses sintesis melanin [10], dan regulasi tirosinase merupakan tujuan penting untuk pencegahan penyakit kulit dan produksipemutih kulitagen [11]. Oleh karena itu, pengembangan antioksidan alami yang efektif menghambat tirosinase untuk pencegahan atau pengobatan hiperpigmentasi kulit yang tidak diinginkan dan perlindungan terhadap kerusakan DNA sangat penting.

Cinnamomum osmophloeum Kanehira (COK) adalah spesies kayu manis asli Taiwan yang banyak digunakan sebagai obat herbal Cina. Senyawa aktif minyak atsiri COK menunjukkan potensi yang sangat baik sebagai antibakteri farmakologis [12]. Meskipun penelitian sebelumnya tentang ekstrak alkohol daun COK menunjukkan aktivitas anti-tirosinase, hampir semua penelitian ini berfokus pada ekstrak etanol atau minyak esensial dari COK. Selain itu, tidak ada penelitian kuantitatif dan sistematis yang melaporkanantioksidanproperti,tirosinaseaktivitas penghambatan dan represi sintesis melanin oleh ekstrak air (hidrosol) daun COK. Oleh karena itu, penelitian ini dilakukan untuk menyelidiki efek hidrosol COK pada stres oksidatif dan melanogenesis pada sel melanoma B16F10 dan melindungi terhadap kerusakan DNA. Studi ini adalah laporan rinci pertama dari komposisi kimia danantioksidan, penghambatan tirosinase, represif melanogenesis, dan aktivitas pelindung kerusakan DNA hidrosol dari daun COK.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Bahan Kimia dan Antibodi

Jamurtirosinase, butylated hydroxytoluene (BHT), -tokoferol, 6-hidroksi-2,5,7,8-tetramethylcroman-2-asam karboksilat (Trolox), asam trikloroasetat (TCA), galat asam, potassiumferricyanide, ferric chloride, ferrous chloride, ferrozine, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH),2,20-azino-bis-3-ethylbenzthiazoline{{14} } asam sulfonat (ABTS), reagen Folin–Ciocalteu, L-tirosin, dan L-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA) diperoleh dari Merck Co. (Darmstadt, Jerman). Semua bahan kimia dan pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah kelas analitik atau kromatografi cair kinerja tinggi. Antibodi terhadap microphthalmia-associated transcription factor (MITF) dan -aktin diperoleh dari Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) dan Sigma Chemical Co.(St. Louis, USA), masing-masing.

2.2. Pembuatan Hidrosol: Ekstraksi Daun COK Menggunakan Destilasi Uap

Daun dari pohon COK berumur 13-tahun di Taiwan (No.186, Yongping Road, Zhongliao Township, Nantou County, Taiwan) dikeringkan dengan udara. Menggunakan penggiling stainless steel, daun kemudian digiling menjadi bubuk halus (kurang dari < 10="" mesh)="" dan="" kemudian="" disimpan="" pada="" suhu="" kamar.="" selanjutnya,="" 3,5="" kg="" serbuk="" daun="" cok="" kering="" diekstraksi="" menggunakan="" destilasi="" uap="" selama="" 4="" jam.="" proses="" ini="" diulang="" empat="" kali.="" menggunakan="" vakum,="" ekstrak="" disaring="" dan="" kemudian,="" menggunakan="" rotary="" evaporator,="" ekstrak="" kering="" diperoleh="" (gambar="" 1).="" ekstrak="" akhirnya="" diuapkan="" untuk="" mendapatkan="" bobot="">

2.3. Analisis Kromatografi Gas/Spektrometri Massa (GC/MS) Hidrosol

Instrumen Thermo-GC/MS dengan kolom kapiler THERMO WaxMS 5 persen fenil- 95 persen methylpolysiloxane (60 m × 0.25 mm id, ketebalan film {{1 0}}.25 m) digunakan dengan helium sebagai gas pembawa pada laju aliran konstan 1,0 mL/menit. Kolom dipertahankan pada 200 C selama 5 menit setelah injeksi dan kemudian dipanaskan pada 5 C/menit hingga 260 C. Minyak atsiri murni (1,0 mL) disuntikkan dengan rasio split 1:100. Suhu injektor, saluran transfer dan sumber ion masing-masing adalah 250 C, 250 C, dan 200 C. Deteksi MS dilakukan dalam mode tumbukan elektron pada energi 70 eVionisasi dan arus ionisasi 60 A; instrumen dioperasikan dalam mode akuisisi pindaian penuh dalam kisaran 50–350 amu. Senyawa diidentifikasi dengan membandingkan waktu retensi dan indeks puncak kromatografi dengan standar referensi otentik, disuntikkan di bawah kondisi yang sama. Pola fragmentasi MS dibandingkan dengan senyawa murni, dan database spektrum massa dicari menggunakan database MSspectral National Institute of Standards and Technology (NIST) [13].

2.4.Kandungan Fenolik Total

Kandungan total fenolik (TPC) dari ekstrak ditentukan dengan menggunakan assayas Folin-Ciocalteu yang dijelaskan sebelumnya [14]. Secara singkat, sampel hidrosol (100 L) dicampur dengan 100 L alikuot reagen Folin–Ciocalteu (pengenceran 10-kali lipat) dan 10 L alikuot natrium karbonat (10 persen , b/v). Setelah disimpan selama 30 menit, absorbansi diukur pada 735 nm. TPC dinyatakan sebagai gallic acidequivalents (GAE) dalam mg per 100 g bahan segar.

2.5. Tes Pemulungan Radikal Bebas DPPH

Seperti yang dijelaskan sebelumnya, menggunakan uji DPPH, aktivitas pemulungan radikal hidrosol ditentukan [15], dengan modifikasi. Secara singkat, berbagai pengenceran sampel hidrosol (75 L dalam rangkap tiga) ditambahkan ke 150 L alikuot DPPH (0.02 g/100 mL) dan absorbansi diukur pada 517 nm setelah 30 menit. BHT digunakan sebagai kontrol positif (0,5 mg/mL etanol). Aktivitas penangkapan radikal dinyatakan sebagai rasio penghambatan ( persen ) dengan menggunakan persamaan berikut:

Rasio penghambatan( persen )=[1 (A/B)] × 100 persen

dimana A adalah absorbansi sampel hidrosol dan B adalah absorbansi blanko.

2.6. Konsentrasi Penghambatan Pecahan

Tes konsentrasi penghambatan fraksional (FIC) dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [16], dengan modifikasi. Secara singkat, FeSO4 (20 L; 2 mM) dicampur dengan berbagai pengenceran sampel hidrosol (200 L). Setelah menambahkan ferrozine (40 L; 5 mM), reaksi dibiarkan berlangsung selama 10 menit dan kemudian absorbansi diukur pada 562 nm. Selanjutnya, 0,5 mg/mL asam etilen diamin tetraasetat (EDTA) digunakan sebagai kontrol positif. Persentase penghambatan pembentukan ferrozine-Fe2 plus kompleks dihitung dengan menggunakan rumus berikut:

Efek pengkelat logam ( persen )=[1 (A/B)] × 100 persen

dimana A adalah absorbansi sampel hidrosol dan B adalah absorbansi blanko.

2.7. Mengurangi Tes Daya

Daya reduksi COK hidrosol ditentukan dengan memantau reduksi Fe3 plus menjadi Fe2 plus seperti yang dijelaskan sebelumnya [17], dengan modifikasi. Secara singkat, untuk 50 L pengenceran hidrosol, 50-µLalikuot dapar fosfat (pH 6,6, 200 mM) dan 50-µL alikuot kalium ferisianida (1 persen , b/v) adalah ditambahkan. Setelah inkubasi pada 50 C selama 20 menit, 50 L TCA (10 persen, b/v) ditambahkan; dan campuran disentrifugasi pada 9,000 rpm selama 3 menit. Akhirnya, 50 L supernatan dicampur dengan 50 L air suling dan 50 L besi klorida dalam air (0,1 persen, b/v), dan absorbansi diukur pada 700 nm terhadap blanko setelah 10 menit waktu reaksi. Kontrol positif yang digunakan adalah butil hidroksitoluena (BHT) dan -tokoferol.

2.8. Uji Kapasitas Antioksidan Setara Trolox (TEAC)

Antioksidanaktivitas COK hidrosol dinilai menurut metode yang dijelaskan sebelumnya [15,18], dengan modifikasi. Secara singkat, larutan kation radikal ABTS (ABTS• plus ) pekat diencerkan dalam larutan salin dapar fosfat (pH 7,4) hingga absorbansi akhir 0.80 ± 0.05 pada 734 nm. Setelah mencampur (0,02 mL) sampel dengan 1 mL ABTS plus larutan, terjadi penurunan absorbansi pada 734 nm setelah 5 menit. Trolox digunakan sebagai standar, dan aktivitas hidrosol dinyatakan sebagai TEAC dengan memplot kurva kalibrasi Trolox. Nilai TEAC setara molar dari sampel hidrosol dihitung sesuai dengan penurunan absorbansi larutan Trolox. BHT dan -tokoferol digunakan sebagai kontrol positif.

2.9. Pengaruh Hidrosol terhadap Penghambatan Tirosinase Jamur

Jamurtirosinaseaktivitas diukur menggunakan analisis spektrofotometri seperti yang dijelaskan sebelumnya, dengan modifikasi [19]. Secara singkat, 20 L L-tirosin atau 20 L L-DOPA dalam PBS (pH 6,8; 80 L) dan 80 L PBS dengan atau tanpa hidrosol uji ditambahkan ke dalam 96-pelat mikro sumur, dan kemudian 20 L jamur tirosinase (100 U/ mL) ditambahkan. Setelah pencampuran dan inkubasi pada 37 C selama 20 menit, produksi dopakrom (atau konsumsi) dalam campuran reaksi ditentukan pada absorbansi 475 nm. Asam kojic, yang menghambat tirosinase, digunakan sebagai kontrol positif. Persentase penghambatan tirosinase dihitung sebagai berikut:

Inhibisi ( persen ) {[(A B) (C D)]/(A B)} × 100 persen

dimana A menunjukkan absorbansi dengan enzim tanpa adanya sampel hidrosol, B menunjukkan absorbansi tanpa enzim atau sampel hidrosol, C menunjukkan absorbansi dengan enzim, dan hidrosol dan Diindikasikan absorbansi tanpa enzim tetapi dengan hidrosol. Kami juga menghitung 50 persentirosinasekonsentrasi penghambatan (IC50) sampel sebagai yang menghambat aktivitas tirosinase sebesar 50 persen .

2.10. Analisis Kinetik Penghambatan Tirosinase Jamur

Campuran reaksi mengandung 20 L L-tirosin atau L-DOPA (0.25 mg/mL) sebagai substrat, 100 Lof tirosinase jamur (20 unit/mL) dalam 0,2 M buffer natrium fosfat ( pH 6,8) dan 80 L masing-masing sampel hidrosol dalam volume total 200 L. Pengujian dilakukan pada 25 C, dan kinetika penghambatan setiap sampel hidrosol dengantirosinasedianalisis menggunakan plot Lineweaver-Burk. Persamaan timbal balik digunakan untuk keseimbangan cepat dari penghambatan nonkompetitif tipe campuran, seperti yang dinyatakan dalam Persamaan (1) [20]. Nilai Ki untuk sampel hidrosol diperkirakan dari plot kemiringan (Persamaan (2)). Nilai Ki untuk hidrosol dihitung dari plot intersep sumbu 1/v (Persamaan (3)),

di mana Vmax adalah kecepatan maksimum daritirosinaseaktivitas, Ksis konstanta disosiasi substrat (S) dari kompleks enzim-substrat (ES), Ki adalah konstanta disosiasi inhibitor[I] dari kompleks enzim-inhibitor dan Ki adalah konstanta disosiasi inhibitor dari enzim-substrat - kompleks penghambat (ESI).

2.11. Kultur Sel dan Uji Viabilitas Sel

Sel melanoma B16-F10 (BCRC60031) diperoleh dari Bioresource Collection and ResearchCenter (BCRC), Taiwan. Sel-sel B16-F10 dikultur dalam medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (Gibco, California, USA) yang mengandung 10 persen FBS pada 37 C dalam 5 persen CO2. Dengan tripsinisasi, sel dipanen. Viabilitas sel diukur dengan menggunakan 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) assay seperti yang dijelaskan oleh Lee [15 ].

2.12. Isi Melanin Seluler

Kandungan melanin diukur menggunakan metode yang dijelaskan oleh Lee. [15]. Secara singkat, sel B16-F10 dikultur dalam pelat sumur 6-dengan kepadatan 0.8 × 105 sel per sumur dan kemudian diinkubasi selama 24 jam. Sel kemudian diobati dengan 100-nM -melanocyte-stimulating hormone ( -MSH), asam kojic (kontrol positif) dan hidrosol pada berbagai konsentrasi selama 24 jam. Setelah dicuci dua kali dengan PBS, sel dilisiskan dalam buffer yang mengandung 100 mM natrium fosfat (pH 6,8), 1 persen Triton X-100 dan 0,1 mM fenilmetanasulfonil fluorida dan disimpan pada suhu -80 C selama 30 menit. Setelah mengumpulkan sel, pelet sel dilarutkan dalam NaOH 1N yang mengandung 10 persen DMSO pada 65 C selama 1 jam. Setelah itu, absorbansi diukur pada 405 nm.

2.13. Western Blot

Sel dilisiskan seperti yang dijelaskan dalam Bagian 2.11 dan menjadi sasaran Western blotting untuk protein MITF menggunakan antibodi Anti-MITF.

2.14. Tes Perlindungan DNA

Kerusakan DNA oksidatif ditentukan sesuai dengan konversi DNA neo plasmid supercoiledpCI melingkar menjadi bentuk sirkular atau terdegradasi lebih lanjut menggunakan metode yang dijelaskan sebelumnya [21,22] dengan sedikit modifikasi. Campuran reaksi 20 L mengandung 2,5 L supercoiledpCI neo (150 ng/µL), 10 L larutan reaksi Fenton yang mengandung 30 mM hidrogen peroksida, 100-µMferrik klorida dan 100 M asam askorbat dalam 20 mM buffer Tris-HCl (pH 7,6), dan 5µL hidrosol (0,3325-5,32 mg/mL) atau quercetin (kontrol positif; 250 g/mL). Campuran reaksi diinkubasi pada suhu 37 C selama 30 menit dan bentuk DNA plasmid dipisahkan pada gel agarosa 0,7 persen dan diwarnai menggunakan SafeView™ (Bahan Biologi Terapan (ABM) Inc., Richmond, Kanada).

Untuk semi-kuantifikasiantioksidanaktivitas ekstrak, jumlah bentuk supercoiled dan nicked dari pCI neo dikuantifikasi menggunakan instrumen AlphaImager Mini (proteinsimple), dan intensitas pita pada gel agarosa dikuantifikasi menggunakan perangkat lunak Gelpro. Sebagai kontrol negatif dan positif, neoplasmid pcI diinkubasi sendiri dan dengan campuran reagen Fenton, masing-masing. Data dinyatakan sebagai jumlah DNA superkoil relatif terhadap itu (100 persen) dalam kontrol negatif. Aktivitas protektif ekstrak dihitung dari jumlah DNA plasmid superkoil dan nicked menggunakan persamaan berikut [23]:

Perlindungan plasmid superkoil ( persen ) =intensitas bentuk superkoil pCI intensitas pita neo DNA × 100

Perlindungan nicked plasmid( persen ) =intensitas nicked formpCI intensitas pita neo DNA × 100

2.15. Analisis statistik

Semua data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Perbedaan antar perlakuan diidentifikasi menggunakan uji-t Student atau ANOVA dilanjutkan dengan uji Scheffe. Perbedaan dianggap signifikan jika p <>

3. Hasil dan Pembahasan

3.1. Identifikasi Senyawa Volatile dalam Hidrosol

Kandungan hidrosol dianalisis menggunakan GC/MS. Komponen diidentifikasi menurut waktu retensi standar dan kuantitas ditentukan dari area puncak eluen (Gambar 2). Sebagaimana diuraikan dalam Gambar 2A-D, trans-cinnamaldehyde, benzaldehyde, dan cinnamyl acetate adalah senyawa utama dalam COK hidrosol dan hadir di 87,7 persen , 7,0 persen , dan 5,3 persen . Eugenol sebelumnya ditemukan dalam minyak esensial dari C. verum sebesar 7,29 persen [24] tetapi tidak terdeteksi dalam hidrosol COK saat ini (Gambar 2). Perbedaan dalam proses ekstraksi dan metode pengujian dapat menyebabkan perbedaan kandungan cinnamaldehyde dari minyak esensial C. cassia [25].

3.2. Sifat Antioksidan Hidrosol dari Daun COK

3.2.1. Kegiatan Pemulungan Radikal DPPH

Pada Gambar 3A, aktivitas penangkapan radikal DPPH hidrosol dari 1,06×10−2 hingga 5,32×10−1 mg/mL berada di antara 5.04 persen ± 0,96 persen dan 41,76 persen ± 2,50 persen . Data ini menunjukkan pembilasan radikal tergantung dosis oleh hidrosol COK. Sebagai perbandingan, kontrol positif BHT dan -tocopherolscavenged 94,32 persen ± 0,08 persen dan 93,82 persen ± 0,13 persen radikal reaktif DPPH, masing-masing, pada 0,5 mg/mL. Aktivitas penangkapan radikal COK hidrosol kemungkinan besar disebabkan oleh sinamaldehida (Gambar 2). ). Banyak penelitian menunjukkan bahwa fenolat dan flavonoid mencegah pembentukan radikal DPPH dengan menyumbangkan atom hidrogen. Oleh karena itu, aktivitas scavenging radikal DPPH dari spesies Cinnamomum juga dapat mencerminkan tindakan sebagai donor hidrogen [26,27].

3.2.2. Khelasi Ion Logam

Kami menilai Fe2 plus kapasitas pengikatan hidrosol pada 1,06 × 10−3 dan 5,32 × 10−1 mg/mL, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3A. Khelasi logam oleh komponen hidrosol sedikit meningkat dengan konsentrasi, tetapi pada 6 mg/mL, hanya memiliki 37,3 persen aktivitas pengkelat EDTA (Gambar 3A).

3.2.3. Mengurangi Daya

Seperti ditunjukkan pada Gambar 3A, daya pereduksi komponen hidrosol bergantung pada konsentrasi dan lebih tinggi daripada BHT dan -tokoferol (0.22 ± 0.01 dan {{9 }}.33 ± 0.15, masing-masing) pada 0,5 mg/mL. Pada penelitian sebelumnya, daya reduksi ekstrak kasar dari ranting C. osmophloeum pada fraksi BuOH adalah yang tertinggi di antara semua fraksi dan meningkat secara linier dengan konsentrasi [28].antioksidanpotensi berbeda antara senyawa dalam ekstrak, aktivitas antioksidan keseluruhan ekstrak sangat bergantung pada pelarut ekstraksi. Namun, daya pereduksi (nilai OD {{0}}.7) ekstrak air dari ranting C. osmophloeum serupa (nilai OD=0.66 ± 0,01) dengan C. sekarang. osmophloeum hydrosols (Gambar 3A), yang diproduksi menggunakan distilasi uap. Daya pereduksi umumnya dikaitkan dengan adanya zat pereduksi dan aktivitas antioksidan, yang mencerminkan penghentian reaksi berantai radikal bebas dengan pemberian atom hidrogen pereduksi. Daya pereduksi C. osmophloeum mungkin karena adanya gugus hidroksil dalam senyawa fenolik (Gambar 2), yang mungkin bertindak sebagai donor elektron.

3.2.4. Tes TEAC

Nilai TEAC dari hidrosol ini meningkat pada konsentrasi yang lebih tinggi dari 5,32 × 10−3 mg/mL dan lebih besar daripada senyawa referensi -tokoferol dan BHT, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3A. Aksesibilitas sterik ke situs radikal ABTS plus adalah kriteria utama untuk aktivitas dalam pengujian TEAC. Dengan demikian, gugus fenil dari konstituen hidrosol ini sedikit kurang terhalang daripada Trolox.

3.2.5. Korelasi antara TPC dan Aktivitas Antioksidan

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3B, ada korelasi yang sangat signifikan antara TPC dan aktivitas pemulungan radikal bebas DPPH di GAE dari 1,75 ± 0.438 hingga 100.41 ± 1,581 mg/g . Koefisien korelasi TPC dengan aktivitas penangkap radikal bebas DPPH, aktivitas FIC, daya pereduksi dan TEAC berturut-turut adalah 0.980, 0.925, 0.967 dan 0.902 (Gambar 3B). Secara kolektif, data ini menunjukkan bahwaantioksidanaktivitas hidrosol COK berkorelasi erat dengan kandungan fenol.

3.3. Pengaruh Konsentrasi Hidrosol COK Terhadap Aktivitas Tirosinase

Kami menentukan efek konsentrasi hidrosol COK pada oksidasi L-tirosin dan L-DOPA oleh jamurtirosinasedan membuat perbandingan dengan aktivitas asam kojic, yang merupakan inhibitor tirosinase yang terkenal (Gambar 3C,D). Hidrosol ini secara potensial dan tergantung dosis menghambat aktivitas L-tirosin dan L-DOPA oksidase dari tirosinase jamur (Gambar 3C) tetapi memiliki aktivitas penghambatan tirosinase yang lebih tinggi dengan adanya substrat L-tirosin (aktivitas monofenolase) daripada L-DOPA (aktivitas difenolase). Nilai IC5{{10}} asam kojic terhadap aktivitas monofenolase dan difenolase adalah 4.0 × 10−5 dan 7,8 × 10−3 mg/mL (Gambar 3C), masing-masing, secara signifikan lebih dari hidrosol ini (7,96 × 10−4 mg/mL dan 0,35 mg/mL, masing-masing; Gambar 3D). Oleh karena itu, untuk mencapai aktivitas penghambatan tirosinase 90 persen (aktivitas monofenolase), hidrosol dan asam kojic diperlukan masing-masing pada 0,52 mg/mL dan 4,0 × 10−3 mg/mL, ketika L-tirosin digunakan sebagai substrat (Gambar 3C, D ). Meskipun efek penghambatan tirosinase memerlukan konsentrasi COK hidrosol daripada asam kojic yang lebih tinggi, aktivitas penghambatan tirosinase yang kuat terbukti dalam percobaan ini.

Berbagaitirosinasepersiapan, metode uji aktivitas, dan kemurnian inhibitor dan komponen dapat berkontribusi pada perbedaan kinetika penghambatan enzim [29]. Namun, aktivitas biologis ekstrak tumbuhan disumbangkan oleh komponen bioaktifnya, yang mungkin dipengaruhi oleh spesies tanaman, waktu panen, musim, asal geografis, praktik agronomi, dan metode ekstraksi. Inhibitor telah diidentifikasi dan dikarakterisasi dari sumber alami dalam banyak penelitian baru-baru ini, dan hubungan antara aktivitas penghambatan dan bahan alami telah diketahui dengan baik (Tabel 1). Secara khusus, banyak aldehida dan senyawa lain telah diisolasi dan dikarakterisasi sebagai inhibitor tirosinase. Ini termasuk cinnamaldehyde, 2-hidroksi-4-methoxy benzaldehyde, anisaldehyde,cuminaldehyde, cumic acid, flavonols, flavones, dan isoflavans [4,19,30–37]. Hidrosol saat ini terdiri dari 87,7 persen sinamaldehida dan 7,0 persen benzaldehida, menunjukkan bahwa sinamaldehida, diikuti oleh benzaldehida, adalah zat utama yang bertanggung jawab atas aktivitas penghambatan tirosinase hidrosol. Sejalan dengan Tabel 1, kami menemukan bahwa hidrosol dengan adanya benzaldehida lebih kuat daripada cinnamaldehyde murni, dan meningkatkantirosinaseaktivitas penghambatan hidrosol. Benzaldehida juga dikonfirmasi untuk menghambat aktivitas difenolase dan aktivitas monofenolase dari jamur tirosinase [38]. Mekanisme penghambatan tirosinase dari inhibitor tipe benzaldehida diduga berasal dari kemampuannya untuk membentuk basa Schiff dengan gugus amino primer pada enzim [33,39]. Penambahan gugus pendonor elektron pada posisi para benzaldehida meningkatkan aktivitas penghambatan tirosinase, mungkin menstabilkan basis Schiff.

3.4. Mode Kinetik Penghambatan Tirosinase Jamur oleh COK Hydrosol

Perilaku kinetik hidrosol, pada monofenolase dan aktivitas difenolase dari tirosinase menggunakan L-tirosin dan L-DOPA sebagai substrat dipelajari, masing-masing. Itutirosinasekinetika penghambatan hidrosol dianalisis menggunakan plot timbal balik ganda Lineweaver-Burk, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4. Pada Gambar 4A, B, empat baris mewakili enzim tanpa hambatan (Jalur 1) dan penghambatan oleh tiga konsentrasi (Jalur 2 – Jalur 4) hidrosol, dan garis-garis ini berpotongan di sebelah kiri sumbu 1/v di atas sumbu 1/S. Di bawah kondisi eksperimental tanpa hambatan, kecepatan maksimum (Vmax) reaksi oksidasi L-tirosin dan L-DOPA yang dikatalisis oleh tirosinase adalah {{10}}.055 OD475/menit dan 0,096 OD475/menit tanpa mengandung hidrosol (Garis 1 pada Gambar 4A, B), masing-masing. Parameter kinetik Km (konstanta Michael) untuk jamurtirosinasediperoleh dari plot Lineweaver–Burk menggunakan L-tirosin dan L-DOPA sebagai substrat, masing-masing, menunjukkan bahwa Km adalah 0.534 mg/mL dan0.511 mg/mL tanpa mengandung hidrosol (Garis 1 pada Gambar 4A, B).

Empat garis, diperoleh dari enzim yang tidak dihambat dan dari tiga konsentrasi hidrosol yang berbeda, berpotongan di sebelah kiri sumbu 1/v di atas sumbu 1/S. Peningkatan konsentrasi hidrosol mengakibatkan penurunan Vmax dan peningkatan Km. Secara khusus, ketika L-tirosin digunakan sebagai substrat, peningkatan konsentrasi hidrosol menghasilkan beberapa garis dengan berbagai kemiringan dan perpotongan, tetapi ini berpotongan satu sama lain di kuadran kedua (Garis 1-4 pada Gambar 4A). Hasil serupa diperoleh ketika L-DOPA digunakan sebagai substrat (Garis 1-4 pada Gambar 4B), mendukung pernyataan bahwa hidrosol membawa inhibitor tirosinase tipe campuran. Sesuai dengan penghambatan tipe campuran, komponen hidrosol cenderung mengikat enzim bebas dan kompleks enzim-substrat. Penghambatan tipe campuran dapat muncul dalam banyak cara: penghambatan hidrosol dapat timbul karena mereka berinteraksi dengan zat antara selanjutnya dalam pola reaksi tetapi tidak dengan kompleks enzim-substrat awal [40]. Dengan demikian, kami menentukan konstanta disosiasi (Ki dan Ki, masing-masing) untuk inhibitor yang mengikat enzim bebas (E) dan kompleks enzim-substrat menggunakan plot timbal balik ganda dan plot kemiringan dan intersep vertikal versus konsentrasi hidrosol dengan adanya L-tirosin (Gambar 4C, D) atau L- DOPA sebagai substrat (Gambar 4E, F). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4A, B, nilai Ki ketika L-tirosin digunakan sebagai substrat kira-kira 1,28 kali lebih rendah daripada dengan adanya L-DOPA, menunjukkan pengikatan enzim penghambat yang lebih efektif dengan L-tirosin daripada dengan L-DOPA. Selain itu, nilai Ki 1,71 kali lebih besar dari nilai Ki untuk oksidasi L-DOPA, menunjukkan bahwa afinitas komponen hidrosol untuk enzim bebas lebih kuat daripada untuk kompleks enzim-substrat. Data ini menunjukkan bahwa hidrosol mempengaruhi afinitas enzim untuk L-DOPA tetapi tidak mengikat situs aktif. Selain itu, nilai Ki hampir sama dengan Ki untuk oksidasi L-tirosin, menunjukkan bahwa inhibitor campuran adalah inhibitor non-kompetitif, yang mengikat enzim bebas dan kompleks enzim-substrat dengan konstanta kesetimbangan yang sama menggunakan L- tirosin sebagai substrat (Gambar 4A). Namun, konstanta pengikatan kesetimbangan untuk enzim bebas dan kompleks enzim-substrat, masing-masing, berbeda dengan menggunakan L-DOPA sebagai substrat (Gambar 4B), menunjukkan bahwa inhibitor tipe campuran (campuran kompetitif dan non-kompetitif) dapat mengikat tidak hanya dengan enzim bebas tetapi juga dengan kompleks enzim-substrat menggunakan L-DOPA sebagai substrat. Penelitian sebelumnya juga mengungkapkan bahwa minyak atsiri C. cassia dan cinnamaldehyde adalah inhibitor tipe campuran [19]. Sebaliknya, trans-cinnamaldehyde yang diisolasi dari kulit C. cassia menunjukkan penghambatan kompetitif untuk oksidasi L-DOPA oleh jamur.tirosinase[32], sedangkan sinamaldehida diisolasi dari akar P. cernua adalah penghambatan nonkompetitif [35].

3.5. Efek Konsentrasi-Tergantung Konsentrasi Hidrosol pada Melanogenesis

Untuk menguji efek hidrosol pada viabilitas sel dan melanogenesis pada berbagai konsentrasi ({{{0}}.0035-10.64 mg/mL), kami menginduksi melanogenesis pada sel melanoma B16-F10 menggunakan -MSH dan membandingkan efek menggunakan asam kojic sebagai kontrol positif (Gambar 5). Hasil uji viabilitas sel ini menunjukkan bahwa hidrosol tidak memiliki sitotoksisitas pada konsentrasi 0,0035-1,064 mg/mL dalam sel melanoma B16F10 (Gambar 5a). Saat penghambat melanogenesis sedang dikembangkan, keamanan dan efektivitas harus menjadi pertimbangan paling penting untuk banyak aplikasi. Namun, pengobatan sel melanoma B16F10 dengan hidrosol menghasilkan penurunan yang nyata dari viabilitas sel pada konsentrasi 5,32-10,64 mg/mL. Menurut hasil dari studi skrining keamanan dan kemanjuranpemutih kulitproduk dalam kultur sel B16F10, 1,064 mg/mL adalah konsentrasi ambang batas untuk skrining primer berbasis sel. Oleh karena itu, konsentrasi 0,1064-1,064 mg/mL digunakan untuk menguji mekanisme anti-tirosinase dalam sel melanoma B16F10 dengan hidrosol.

Represi melanogenesis dengan perlakuan hidrosol pada berbagai konsentrasi ditentukan sebagai persentase kandungan melanin dalam sel (Gambar 5b). Kami juga menganalisis level ekspresi MITF menggunakan Western blotting (Gambar 5c). Dalam percobaan ini, kandungan melanin dan tingkat ekspresi MITF ditekan secara tergantung dosis oleh COK hidrosol, menunjukkan bahwa COK hidrosol menurunkan kandungan melanin dalam sel dengan menekan sintesis MITF.

3.6. Tes Perlindungan DNA

Spesies oksigen reaktif diketahui merusak DNA dan menyebabkan penuaan sel dan kanker. Tes DNAnicking menawarkan sistem model bebas sel yang nyaman untuk secara sensitif menentukan produksi radikal perusak DNA [41]. Dalam percobaan ini, reaksi Fenton menghasilkan radikal hidroksil yang membelah DNA plasmid superkoil dan mengubahnya menjadi bentuk DNA yang terpotong, yang telah menurunkan mobilitas elektroforesis. [42,43]. Jadi, untuk mengevaluasi aktivitas pelindung DNA hidrosol, kami menginkubasi pCI neo DNA dengan reaktan Fenton [44]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6, bentuk plasmid superkoil dan terpotong jelas dibedakan oleh tingkat mobilitas elektroforesis relatifnya pada gel agarosa; supercoiledDNA bergerak paling cepat, dan nicked DNA bergerak paling lambat. Setelah perawatan dengan hidrosol, kerusakan DNA sedikit berkurang pada konsentrasi hidrosol 1,33-5,32 mg/mL, dengan perlindungan 28-58 persen dari bentuk superkoil, masing-masing (jalur 6-8). Pada konsentrasi hidrosol 0.3325–0.665 mg/mL, tidak ada perlindungan yang diamati relatif terhadap kontrol negatif (jalur 4 dan 5). Sebaliknya, quercetin secara efektif melindungi DNA plasmid dari radikal hidroksil- fragmentasi dimediasi, seperti yang ditunjukkan sebelumnya [45]. Ini adalah data pertama yang menunjukkan efek perlindungan ekstrak hidrosol dari C. osmophloeum Kanehira meninggalkan kerusakan DNA oleh reaksi Fenton. Efek ini kemungkinan karena adanya senyawa polifenol.

4. Kesimpulan

COK telah lama digunakan sebagai tanaman obat di Taiwan. Namun, sepengetahuan kami, ini adalah laporan pertama yang menunjukkan bahwa hidrosol yang dibuat dengan destilasi uap dari daun COK memiliki aktivitas antioksidan, seperti yang diamati dalam pengujian kadarantioksidanaktivitas dan kerusakan DNA. Kami juga menunjukkan bahwa hidrosol ini menekan melanogenesis. Dalam analisis GC/MS, senyawa utama dalam hidrosol COK ditemukan menjadi sinamaldehida dan benzaldehida, dan agen ini berpotensi menghambat aktivitas monofenolase dan difenolase dari tirosinase. Dalam penilaian kami tentang kinetika penghambatan tirosinase, hidrosol COK menunjukkan penghambatan tergantung dosis tipe campuran dari aktivitas L-tirosin dan L-DOPA oksidase daritirosinase. Senyawa hidrosol saat ini juga menekan ekspresi protein MITF, yang mengarah pada penurunan sintesis melanin yang diinduksi -MSH.

Akhirnya, keamanan merupakan pertimbangan utama untuk inhibitor tirosinase, terutama untuk produk kosmetik dan makanan yang digunakan, yang dapat digunakan dalam jumlah yang diatur. COK sudah menjadi bahan tambahan alami yang dapat dimakan dan banyak digunakan untuk makanan dan kosmetik. Selain itu, cinnamaldehyde umumnya diakui sebagai aman untuk dikonsumsi manusia. COK hidrosol adalah biomaterial alami yang sangat baik dengan efektif dan amantirosinasedan aktivitas penghambatan sintesis melanin dan potensi untuk melindungi terhadap kerusakan DNA. Oleh karena itu, kami percaya bahwa COK hidrosol dapat digunakan sebagai agen depigmentasi yang aman dan efektif untuk banyak aplikasi.