Minyak Atsiri yang Mengandung Citral Sebagai Potensi Inhibitor Tirosinase: Pendekatan Fraksinasi Bio-Guided

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

Abstrak:

Produksi melanin yang berlebihan menyebabkan kondisi dermatologis yang serius serta masalah estetika minor (yaitu, bintik-bintik dan solar lentigo). Downregulation tirosinase adalah pendekatan luas untuk pengobatan gangguan tersebut, dan ekstrak tumbuhan sering terbukti menjadi sumber berhargatirosinaseinhibitor. Citral (campuran neral dan geranial) adalah bahan pewangi penting yang telah menunjukkan potensi anti-tirosinase. Hal ini sangat terkonsentrasi dalam minyak esensial (EO) dari Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L., dan Verbenaofficinalis L. Namun, hanya L. cubeba EO telah diselidiki untuk digunakan sebagai agen pemutih kulit yang potensial. Karya ini mengevaluasi in vitrotirosinaseaktivitas penghambatan EO ini dan studi, menggunakan fraksinasi berorientasi bio-assay, apakah komposisi kimianya yang berbeda mempengaruhi aktivitas penghambatan EO secara keseluruhan melalui kemungkinan interaksi sinergis, aditif, dan/atau kompetitif antara komponen EO. Aktivitas penghambatan C. schoenanthus EO dan M. officinalis EOs, dengan jumlah ( plus )-sitronelal yang dapat diabaikan, sejalan dengan kandungan citralnya. Di sisi lain, L. cubeba dan V. officinalis EOs menghambattirosinaseke tingkat yang jauh lebih besar karena mengandung -myrcene, yang berkontribusi pada keseluruhan aktivitas EO. Pengamatan serupa dilakukan untuk M. officinalis EO, yang memiliki kandungan sitronelal tinggi ( plus ) yang meningkatkan aktivitas citral.

Kata kunci:tirosinaseinhibisi; minyak esensial; citral

cistanche memiliki fungsi pemutih

pengantar

Tirosinaseadalah enzim kunci dalam biosintesis pigmen melanin pada beberapa bakteri, jamur, tumbuhan, hewan, dan manusia. Pada manusia, tirosinase mengkatalisis langkah-langkah yang membatasi laju dalam jalur biosintesis melanin. Biosintesis ini ditandai dengan beberapa reaksi enzimatik dan kimia yang mengarah pada pembentukan melanin dari asam amino L-tirosin, dengan tirosinase mengkatalisis hidroksilasinya menjadi o-dopakuinon melalui aktivitas mikofenolat dan difenolnya. Meskipun ada enzim lain yang terlibat dalam melanogenesis, hanya reaksi yang dikatalisis tirosinase yang tidak dapat terjadi secara spontan, sedangkan langkah-langkah selanjutnya dapat berlangsung tanpa aktivitas enzim pada pH fisiologis [1]. Oleh karena itu, penurunan regulasi tirosinase merupakan pendekatan yang sangat luas untuk pengurangan melanin yang berlebihan. produksi, dan penggunaan inhibitor tirosinase sebagai agen pemutih kulit telah menunjukkan keunggulan klinis dan kosmetik yang signifikan [2].

Di pasar UE,tirosinaseinhibitor yang digunakan sebagai agen pemutih kulit dapat dikelompokkan ke dalam dua kategori utama: yang dilarang menurut peraturan kosmetik UE 1223/2009 (yaitu, hidrokuinon dan mono benzil eter hidrokuinon) karena efek sampingnya yang parah, tetapi masih digunakan untuk mengobati hiperpigmentasi di bawah standar medis. pengawasan; dan inhibitor tirosinase yang diizinkan untuk digunakan dalam produk kosmetik (yaitu, arbutin, aloesin, asam kojic) [2,3]. Namun, kelompok kedua ini masih dicirikan oleh efek samping yang berpotensi signifikan; studi klinis pada asam kojic memang menyoroti kasus eritema, sensasi menyengat, dan eksim kontak setelah aplikasi. Demikian pula, Komite Ilmiah Eropa tentang Keselamatan Konsumen telah menyuarakan keprihatinan mengenai penggunaan arbutina sebagai bahan kosmetik [2], karena potensi hidrolisis ikatan glikosidiknya yang melepaskan hidrokuinon. Oleh karena itu ada kebutuhan untuk template molekul baru dan/atau campuran senyawa bioaktif untuk mengobati hiperpigmentasi.

Tumbuhan telah menjadi sumber zat pemutih kulit yang berharga, dan tiga dari lima zat yang paling banyak digunakan, baik secara medis maupun kosmetik, merupakan metabolit khusus tumbuhan (yaitu, hidrokuinon, -arbutin, aloesin). Sampai saat ini, senyawa fenolik pada prinsipnya telah diselidiki sebagai senyawa potensialtirosinaseinhibitor, dan ini termasuk flavonoid (misalnya, quercetin [4]), stilbenes (misalnya, resveratrol [1]), fenilpropanoid (misalnya, cinnamaldehyde [5], dan eugenol [6]), dan asam fenolik (misalnya, asam anisat dan asam benzoat [7]). Minat forterpenoid telah jauh lebih rendah dan mereka relatif kurang diselidiki sebagai agen anti-tirosinase.

Citral adalah salah satu turunan terpenoid yang jumlahnya terbatas dengan sifat anti-tirosinase yang telah dipelajari. Ini adalah campuran dari dua isomer, cis- dan trans-3,7-dimetil-2,6-oktadienal (yaitu, neral dan geranial), yang telah terbukti memblokir aktivitas enzimatik in vitro jamurtirosinase[8]. Selain pentingnya sebagai bahan bau dalam minuman, makanan, dan kosmetik, citral telah menunjukkan aktivitas biologis in vitro yang menjanjikan termasuk efek anti-jamur, anti-bakteri, antioksidan, dan anti-inflamasi [9-11]. menyoroti bahwa citral memiliki signifikansi terapeutik potensial sebagai relaksan otot polos dan anestesi lokal, karena mempromosikan relaksasi pada otot polos trakea, rahim, dan aorta dan menghambat rangsangan saraf pada model hewan [12-15].

Citral diperoleh dari minyak atsiri (EO) dari beberapa spesies botani, termasuk Cymbopogon schoenanthus (L.) Spreng., Litsea cubeba (Lour.) Pers., Melissa officinalis L., dan Verbena officinalis L. Untuk yang terbaik dari penulis' pengetahuan, hanya L. cubeba EO yang telah diselidiki untuk itutirosinaseaktivitas penghambatan [16]. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi aktivitas penghambatan tirosinase C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis, dan V.officinalis EOs, menggunakan uji kolorimetri in vitro, untuk menilai apakah komposisi kimia yang berbeda mempengaruhi aktivitas penghambatan EO secara keseluruhan melalui kemungkinan interaksi sinergis, aditif dan/atau kompetitif antara komponen-komponennya. Studi ini menggunakan pendekatan fraksinasi terpandu abioassay untuk mengevaluasi secara komprehensif konstituen EO dan enansiomernya, ketika kiral, yang berkontribusi pada aktivitas penghambatan EO terhadap sumber jamur tirosinase, yang merupakan sistem model yang baik untuk penyaringan awal.tirosinasepenghambat [17].

2. Hasil dan Pembahasan

2.1. Komposisi Kimia dan Kandungan Citral dari Minyak Atsiri yang Diselidiki

Dalam upaya kami untuk mengkarakterisasi secara komprehensif semua komponen EO potensial yang berkontribusi pada aktivitas biologis yang dipertimbangkan, EO yang diselidiki dianalisis oleh GC, dengan deteksi FID dan MS. Kelimpahan persentase relatif yang dinormalisasi (dihitung dari area absolut yang dinormalisasi ke standar internal C13 dengan menggunakan faktor respons [18,19]) dari semua senyawa yang terdeteksi ditentukan dan digunakan untuk membandingkan komposisi EO. Gambar 1 melaporkan profil GC-MS dari EO yang diselidiki yang dianalisis dengan kolom konvensional. Tabel 1 mencantumkan, untuk setiap EO yang diselidiki, senyawa yang menampilkan persentase kelimpahan yang dinormalisasi di atas 0.1, sedangkan komposisi kimia EO lengkap dilaporkan dalam Bahan Tambahan (Tabel S1–S5).

Semua EO yang diteliti kaya akan neral (cis{{0}},7-dimetil-2,6-oktadienal) dan geranial (trans-3,{ {5}}dimetil-2,6-oktadienal), yang merupakan senyawa yang paling melimpah. Rasio theneral/geranial sangat mirip di semua EO yang diselidiki dan berhubungan dengan 0,74 ± 0,05. EO C. schoenanthus dan L. cubeba menampilkan konten neral dan geranial tertinggi, yang rata-rata menyumbang 60 persen dari seluruh komposisi EO mereka, dan 15-kali lebih besar daripada di V. officinalis EO dan di tiga EO M. officinalis (yaitu, Sampel 1, 2, dan 3). Senyawa teroksigenasi tambahan yang umum untuk semua EO adalah6-metil-5-hepten-1-satu, linalool dan sitronelal. Yang terakhir ini secara signifikan lebih melimpah di M. officinalis EO 1 daripada di EO lain yang diselidiki, termasuk M. officinalis EO2 dan 3.

Kelimpahan fraksi hidrokarbon bervariasi secara signifikan di EO yang berbeda. officinalis EO 1 hanya mengandung trans- -caryophyllene dan -humulene sebagai sesquiterpenehydrocarbons, yang masing-masing menyumbang 2,7 persen dan 0,13 persen dari total EO. C.schoenanthus EO menyajikan fraksi hidrokarbon yang sedikit lebih kaya daripada M. officinalis EO 1 (yaitu,7,0 persen ), yang mengandung kedua monoterpen (yaitu, camphene, cis{{1{{2{0} }}}}ocimene, limonene, -pinene,trans- -ocimene, -thujene) dan sesquiterpenes (yaitu, trans- -caryophyllene, -cadinene,δ-cadinene, germacrene D, -elemene) dalam kadar sedang jumlah. Dalam L. cubeba dan V.officinalis EOs, fraksi hidrokarbon menyumbang 20 persen dari total EO dan limonene adalah senyawa yang paling melimpah (yaitu, 15,0 dan 10,9 persen, masing-masing), diikuti oleh -pinene, pinene , sabinena, trans- -caryophyllene, -myrcene, camphene, dan -copaene. Terakhir, M.officinalis EO 2 dan 3 dicirikan oleh kandungan fraksi hidrokarbon tertinggi (masing-masing 38,8 persen dan 31,8 persen dari total EO). Pada kedua sampel, fraksi hidrokarbon terutama mengandung seskuiterpen, yaitu trans- -caryophyllene (masing-masing 27,8 persen dan 20,0 persen ), dan -humulene (3,0 persen dan 2,6 persen ), dan fraksi monoterpen tereduksi yang terutama dicirikan oleh limonen ( masing-masing 4,2 persen dan 3,2 persen).

Tiga sampel L. cubeba, V. officinalis, dan C. schoenanthus Eos yang diproduksi pada tahun yang berbeda serta tiga sampel M. officinalis EO dari pabrik yang berbeda diselidiki. Analisis GC-MS C. schoenanthus, L. cubeba, M. officinalis, dan V. officinalis tidak menunjukkan perbedaan kualitatif dan kuantitatif yang signifikan dalam komposisi kimia dari tiga sampel tahun produksi yang berbeda. Hal ini dapat dianggap berasal dari kondisi penyimpanan yang optimal, yaitu, dalam wadah kaca kuning pada 4 C dalam gelap dengan ruang kepala yang dapat diabaikan. Di sisi lain, analisis GC-MS menunjukkan perbedaan yang signifikan dalam kelimpahan sitronelal dan trans{{4 }}caryophyllene dalam tiga EO M. officinalis yang diselidiki. Serai wangi masing-masing sebesar 19,6 persen , 0,26 persen , dan 0,31 persen pada M. officinalis EO 1, 2, dan 3. Sebaliknya, seperti yang dijelaskan sebelumnya, trans- -caryophyllene jauh lebih berlimpah di M. officinalis EOs 2 dan 3 daripada di M. officinalis EO 1. Hasil ini sesuai dengan temuan yang dilaporkan oleh Seidler-Lozykawska et al., yang menyoroti perbedaan signifikan dalam kelimpahan citral, sitronelal, dan trans- -caryophyllene dalam EO yang diperoleh dari 22 genotipe M. officinalis terpilih yang berasal dari kebun raya Eropa [20].

Kuantisasi yang benar dilakukan oleh kalibrasi standar eksternal untuk secara akurat mengevaluasi kelimpahan senyawa khusus bioaktif potensial (yaitu, neral, geranial, limonene, -mirsen, dan sitronelal. Tabel 2 dan 3 melaporkan ion diagnostik (m/z) yang digunakan untuk SIM- Kuantisasi MS dari senyawa penanda yang diteliti bersama-sama dengan rentang kalibrasi, persamaan kurva kalibrasi, nilai korelasi, dan kesalahan standar regresi masing-masing analit dan hasil kuantisasi.

2.2. Aktivitas Penghambatan In Vitro Minyak Atsiri yang Diselidiki terhadap Tirosinase Jamur

Seperti dijelaskan sebelumnya, EO dari C. schoenanthus, M. officinalis, L. cubeba, dan V.officinalis menghadirkan citral tingkat tinggi, yang ditandai dengan aktivitas penghambatan non-kompetitif terhadap sumber jamur tirosinase [8,16,21] . Penelitian ini bertujuan untuk menguji secara in vitrotirosinaseaktivitas penghambatan EO ini untuk mengeksplorasi apakah aktivitas penghambatan mereka dapat dianggap berasal dari konten citral mereka saja, atau apakah ada senyawa bioaktif lain yang mempengaruhi efek penghambatan EO.

Jamurtirosinasediadopsi di sini karena homologinya yang tinggi terhadap humantirosinase, biayanya yang relatif rendah dan ketersediaannya yang siap pakai, yang menjadikannya sistem model yang baik untuk penyaringan awal inhibitor tirosinase [17]. Ketepatan in vitrotirosinaseuji penghambatan dievaluasi dalam hal pengulangan (dengan melakukan uji penghambatan enzimatik lima kali dalam hari yang sama) dan presisi menengah (dengan mengulangi uji penghambatan enzimatik lima kali setiap empat minggu selama periode enam bulan). Tabel 4 melaporkan koefisien variasi (CV) untuk uji penghambatan yang dilakukan dengan asam kojic, yang digunakan sebagai kontrol positif, dan dengan L. cubeba EO. Hasilnya memuaskan karena CV tidak pernah melebihi 7 persen untuk pengulangan dan 10 persen untuk presisi menengah. Tabel 4 melaporkan koefisien variasi untuk uji inhibisi yang dilakukan dengan asam kojic, digunakan sebagai kontrol positif, dan dengan L. cubeba EO. Nilai presisi serupa diperoleh untuk semua EO yang diuji.

Kurva konsentrasi-respon citral dipelajari dengan memplot aktivitas penghambatan yang diamati sebagai fungsi konsentrasinya dalam campuran reaksi. Semua EO diuji pada konsentrasi 166,7 g/mL, yang memberikan, terlepas dari EO, konsentrasi citral yang dihasilkan dalam rentang linearitas kurva respons konsentrasi (y=0,3956x ditambah 1,8094,R{{7} }.9951, kesalahan regresi: 2.08448, rentang linieritas: 6,7–166,7 g/mL) dan tidak menimbulkan masalah kelarutan dalam campuran reaksi.

Plot kotak yang dilaporkan pada Gambar 2 menyajikan persentasetirosinasehambatan untuk setiap EO. Untuk L. cubeba, V. officinalis, dan C. schoenanthus EO, hasil yang dilaporkan pada Gambar 2 sesuai dengan aktivitas penghambatan tirosinase jamur dari EO 2020karena analisis varians mengungkapkan tidak ada perbedaan yang signifikan secara statistik di antara EO yang berbeda tahun produksi (p > 0,05). Berkenaan dengan L. cubeba dan C. schoenanthus EO, hasil ini sesuai dengan hasil yang diperoleh dari analisis GCMS kuantitatif yang mengungkapkan jumlah citral yang hampir identik dalam EO dari tahun produksi yang berbeda. V. officinalis EO batch 2020 mengandung jumlah citral yang sedikit lebih tinggi daripada batch 2019 dan 2018. Namun, menurut kurva konsentrasi-respon citral, kelebihan citral pada batch 2020 tidak cukup untuk menentukan persentase inhibisi enzimatik yang lebih tinggi secara signifikan secara statistik. kesalahan yang terkait dengan pengukuran. Untuk detail tambahan, lihat Gambar S1 di Materi Tambahan. Di sisi lain, analisis varians (ANOVA) yang diikuti oleh post-hoctest Tukey-Kramer mengungkapkan bahwa tiga EO M. officinalis yang diuji, yang disediakan oleh produsen yang berbeda, menghambat pertumbuhan jamur.tirosinaseuntuk tingkat yang berbeda, yang akan dijelaskan lebih lanjut dalam paragraf berikut. Aktivitas penghambatan terbesar diamati untuk EO L.cubeba, M. officinalis 1, dan V. officinalis, yang menghambat 59 ± 6 persen , 55 ± 7 persen , dan 52 ± 6 persen daritirosinaseaktivitas, masing-masing, ketika diuji pada konsentrasi 166,7 g/mL. Aktivitas yang lebih rendah signifikan secara statistik (p < 0.05)="" diamati="" untuk="" eo="" c.="" schoenanthus="" dan="" m.officinalis="" 2="" dan="" 3="" yang="" aktivitas="" penghambatan="" enzimnya="" adalah="" 42="" ±="" 5="" persen="" ,="" 40="" ±="" 5="" persen="" ,="" dan="" 38="" ±="" 6="" persen,="" masing-masing.="" tabel="" 5="" memberikan="" konsentrasi="" inhibitor="" yang="" mengurangi="" separuh="" aktivitas="" enzim="" dalam="" kondisi="" eksperimental="" yang="" diberikan="" (ic50)="" untuk="" setiap="" inhibitor="" yang="" diselidiki="" (yaitu,="" eo,="" senyawa="" tunggal,="" dan="" asam="" kojic).="" semua="" eo="" secara="" efektif="" menghambat="" tirosinase="" jamur="" dan="" menunjukkan="" aktivitas="" penghambatan="" yang="" rata-rata="" 100-kali="" lebih="" rendah="" daripada="" kojicacid,="" yang="" digunakan="" sebagai="" kontrol="">

2.3. Identifikasi Komponen Bioaktif Tambahan, Selain Citral, dengan Fraksinasi Terpandu Bioassay Histogram yang dilaporkan pada Gambar 3 membandingkan persentase penghambatan enzimatik yang diukur secara eksperimental dengan nilai yang diharapkan jika neral dan geranial (dianggap sebagai jumlah, yaitu, citral) adalah hanya senyawa aktif dalam EO yang diselidiki. Nilai-nilai ini diukur melalui interpolasi dari kurva konsentrasi-respon citral. Seperti diketahui, C. schoenanthus, M. officinalis 2, dan M. officinalis 3 menunjukkan aktivitas penghambatan yang sejalan dengan kandungan citralnya, sedangkan L. cubeba, M. officinalis 1, dan V. officinalis EOs menghambat pertumbuhan jamur. tirosinase ke tingkat yang lebih besar dari yang diharapkan. Pendekatan bio-dipandu diadopsi untuk mengidentifikasi senyawa tambahan yang berkontribusi terhadap aktivitas citral. Fraksi teroksigenasi dan hidrokarbon dari L. cubeba, M. officinalis 1, dan V. officinalis EO diisolasi dengan kromatografi flash dan diuji secara individual untuk jamurnyatirosinasekegiatan penghambatan. Fraksi phytohemical diuji aktivitas penghambatan tirosinase jamur mereka. Fraksi fraksi fitohemik diuji pada konsentrasi yang sama dengan konsentrasi yang dihasilkan saat pengujian pada 166,7 g/mL masing-masing EO (lihat bagian Bahan dan Metode pada Bagian 3.2). Tabel 6 melaporkan konsentrasi neral, geranial, sitronelal, limonen, dan -mirsen dalam fraksi teroksigenasi dan hidrokarbon dari EO yang difraksinasi.

Adapun L. cubeba dan V. officinalis EOs, baik fraksi oksigen dan hidrokarbon menghambat tirosinase jamur, meskipun untuk luasan yang berbeda. Aktivitas fraksi teroksigenasi (53 ± 3 persen dan 44 ± 5, masing-masing) menyumbang sebagian besar EOanti-tirosinasepotensial dan sejalan dengan kandungan citral masing-masing, menunjukkan bahwa senyawa yang berkontribusi terhadap aktivitas citral milik fraksi hidrokarbon. Fraksi hidrokarbon dari L. cubeba dan V. officinalis EO menyajikan komposisi kimia yang sangat mirip. Limonene (masing-masing 68,4 dan 50.3 persen), trans- -caryophyllene (12.0 dan 7,8 persen), -pinene (masing-masing 1,7 dan 7,5 persen), -pinena (masing-masing 2,5 dan 12,9 persen), sabinena (masing-masing 2,7 dan 3,8), dan -mirsen (masing-masing 2,0 dan 2,4 persen) adalah senyawa yang paling melimpah di kedua fraksi dan hadir dalam jumlah yang agak mirip, kecuali untuk -pinene dan -pinene, yang berlaku dalam fraksi hidro karbon V. officinalis EO.

The chiral recognition revealed high enantiomeric purities in favor of the (-)-configured enantiomers for trans-β-caryophyllene (>99 persen di kedua EO), limonene (97 dan 94 persen di L. cubeba dan V. officinalis EO, masing-masing) dan sabinene (87 persen di kedua EO), sementara kelebihan enansiomer yang berbeda diamati untuk -pinene ((-)- enansiomer: 38 persen di L. cubebaEO dan 73 persen di V. officinalis EO) dan -pinene ((-)-enantiomer: 67 persen di L. cubeba EO dan 88 persen di V. officinalis EO). Di kedua EO, (-)-limonene menyumbang lebih dari 50 persen dari seluruh fraksi. Namun, meskipun penelitian sebelumnya telah melaporkan aktivitas penghambatan terhadap tirosinase jamur karena kelimpahannya yang tinggi [22,23], (-)-limonene di sini tidak menunjukkan aktivitas penghambatan tirosinase. Hasil yang sama diperoleh untuk ( plus )-limonene, campuran rasemat, dan senyawa (-)-trans- -caryophyllene, (±)- -pinene, dan (±)- -pinene . Sabinene tidak diuji karena telah terbukti memiliki jamur yang dapat diabaikantirosinaseefek penghambatan [8]. Sesuai dengan temuan sebelumnya [8], myrcene mengurangi aktivitas tirosinase jamur. Ketika diuji pada konsentrasi yang diamati pada 166,7 g/mL L. cubeba dan V. officinalis EOs, aktivitas -myrcene menjembatani kesenjangan antara efek penghambatan yang diharapkan EO jika citral adalah satu-satunya senyawa aktif dan hasil eksperimen. Bertentangan dengan pengamatan Matsuura et al. [8], -myrcene terbukti menjadi penghambat tirosinase jamur yang lebih kuat daripada citral, karena IC50-nya hampir sepuluh kali lebih rendah (13,3 g/mL vs. 121,8 g/mL). Perbedaan ini dapat dianggap berasal dari substrat yang berbeda yang digunakan; Matsuura dkk. menyelidiki aktivitas tirosinase difenolase jamur saja, karena mereka menggunakan L-DOPA sebagai substrat, sedangkan, dalam penelitian ini, L-tirosin digunakan. Temuan saat ini menunjukkan bahwa -myrcene mungkin lebih efektif dalam menghambat aktivitas tirosinase monofenolase jamur daripada yang difenolase.

M. officinalis EO 1 menampilkan fraksi hidrokarbon kecil yang menyumbang kurang dari 3 persen dari total, dan tidak memiliki aktivitas penghambatan tirosinase. Namun, fraksi teroksigenasi M. officinalisEO 1 menghambat tirosinase jamur ke tingkat yang lebih besar daripada yang diharapkan dari kandungan citralnya (Gambar 3). Fraksi ini mengandung sejumlah besar sitronelal selain neral dan geranial dan analisis kiral mengungkapkan kemurnian enansiomer yang tinggi dari sitronelal yang mendukung enansiomer ( plus ) (98,3 persen). Ketika diuji secara independen, pada konsentrasi 166,7 g/mL, ( plus )-sitronelal menghambat jamur tirosinase hingga tingkat yang dapat diabaikan, meskipun aktivitasnya meningkat secara signifikan ketika diuji dalam kombinasi dengan citral. Hasil ini dapat menjelaskan perbedaan yang diamati dalam persentase jamurtirosinasepenghambatan di berbagai M. officinalis EOs. M.officinalis EO 2 dan 3 memiliki kandungan sitronelal yang sangat rendah, yang mungkin menjadi alasan mengapa aktivitas penghambatannya secara signifikan lebih rendah daripada M. officinalis EO 1.

3. Bahan dan Metode

3.1. Reagen

Dimetil sulfoksida (DMSO), tirosinase jamur dari Agaricus bisporus (JE Lange)Imbach, L-tirosin, asam kojic, citral, sitronelal, -mirsen, ( plus )-limonen, (-)-limonen,(±)-limonen, ( ±)- , dan pinene dibeli dari Merck Life Science Srl (Milan, Italia). Litsea cubeba, Verbena officinalis, dan Cymbopogon schoenanthus EO dipasok oleh Erboristeria Magentina Srl (Poirino, Italia). Tiga batch tahun yang berbeda (yaitu, 2020,2019, 2018) diuji untuk masing-masing. Tiga sampel Melissa officinalis EO diselidiki; satu disediakan oleh Agronatura (Spigno Monferrato, Alessandria), satu oleh ErboristeriaMagentina Srl, sedangkan yang terakhir dibeli dari toko lokal dan dari SpecchiasolS.rl (Bussolengo, Italia). Dalam teks, penulis merujuk pada EO Melissaofficinalis yang berbeda sebagai M. officinalis EOs 1, 2, dan 3, masing-masing. EO yang disediakan diperoleh mengikuti prosedur yang dijelaskan dalam Farmakope Eropa [24]. Melissa officinalis dan Verbena officinalis EOs masing-masing diproduksi dengan hidrodistilasi dari daun dan bagian tanaman; sama, Litsea cubeba dan Cymbopogon schoenanthus EOs diperoleh dengan distilasi uap dari buah-buahan segar dan bagian udara segar, masing-masing. Setiap EO dianalisis secara individual oleh GC-MS segera setelah dibeli/disediakan oleh produsen terkait, setiap tahun penyimpanan, dan tepat sebelum studi aktivitas penghambatan tirosinase jamurnya.

3.2. Uji Inhibisi Tirosinase In Vitro

Itutirosinaseaktivitas penghambatan EO dan senyawa terisolasi diselidiki secara in vitro menggunakan uji enzim berbasis pembacaan kolorimetri yang dioptimalkan oleh Zengh et al. [25], dengan sedikit modifikasi. Aktivitas penghambatan tirosinase dari EO, serta masing-masing fraksi hidrokarbon dan teroksigenasi dan senyawa murni diselidiki secara in vitro menggunakan uji enzim berbasis pembacaan kolorimetri yang dioptimalkan oleh Zengh et al. [25], dengan sedikit modifikasi: pengujian dilakukan pada suhu kamar dantirosinasepenghambatan diukur dengan mempertimbangkan kontrol dan absorbansi sampel setelah 6 menit inkubasi, bukan setelah 20 menit, sehingga dapat beroperasi di bawah bagian linier dari reaksi enzimatik, yang memberikan hasil penghambatan yang lebih akurat [26,27]. Tirosinase jamur dari Agaricus bisporus (JE Lange) Imbach dipilih untuk penelitian ini. L-Tirosin digunakan sebagai substrat, yang berarti bahwa aktivitas penghambatan tirosinase keseluruhan diselidiki tanpa membedakan antara aktivitas tirosinase monofenolase dan difenolase. Pengukuran fotometrik pada 475 nm dilakukan pada Thermo spectronic Genesys6 dan asam kojic digunakan sebagai inhibitor kontrol positif. Solusi dari inhibitor potensial yang diselidiki (EO, fraksi terisolasi EO, senyawa individu EO, dan kojicacid) disiapkan dalam DMSO. Tabel 7 melaporkan konsentrasi yang diuji untuk setiap inhibitor potensial yang diselidiki. Jamurtirosinaselarutan 200 U/mL (27,9 g/mL) disiapkan dalam buffer natrium fosfat (pH 6,8) dan alikuot dari 9 mL disimpan pada 18 C dan dicairkan sesaat sebelum percobaan. Larutan tirosin 0.1 mg/mL disiapkan dalam buffer natrium fosfat (pH 6,8) dan diperbarui setiap hari. Komponen campuran reaksi ditempatkan dalam botol dengan urutan sebagai berikut: 1 mL larutan tirosinase jamur 200 U/mL; 1 mL larutan buffer natrium fosfat; 10 L EO/larutan com pon/asam kojic; dan, akhirnya, 1 mL larutan tirosin 0,1 mg/mL. Persentase DMSO akhir dalam campuran reaksi adalah 0,3 persen. Pengujian dilakukan dalam botol 4 mL yang disegel untuk menghindari hilangnya komponen EO ke lingkungan sekitar dan untuk meminimalkan pelepasannya ke ruang kepala di atas campuran reaksi. Campuran reaksi diinkubasi dalam penangas air termostatik pada 25 C selama 6 menit. Selanjutnya, absorbansi pada 475 nm didaftarkan, karena panjang gelombang ini memungkinkan identifikasi dopakrom. Absorbansi yang sesuai dengan 100 persen aktivitas tirosinase diukur dengan mengganti EOs/senyawa individu/larutan asam kojic dengan 10 L DMSO murni. Larutan kosong disiapkan sebagai berikut: 2 mL larutan buffer natrium fosfat, 10 L EO/senyawa individu /kojic acid/larutan DMSO, dan 1 mL larutan tirosin 0,1 mg/mL. Persentase penghambatan tirosinase diukur menurut persamaan di bawah ini: persen Penghambatan=A (Kontrol) A (Sampel) / A (Kontrol) × 100,∆A (Kontrol) atau (Sampel) {{ 33}} A475 (Kontrol) atau (Contoh) A475 (Kontrol Kosong) atau (Kosong Sampel).

3.3. Kromatografi Kolom Flash

Fraksinasi EO dilakukan pada sistem kromatografi kolom flash PuriFlash450 oleh Sepachrom (Rho, Milan, Italia), dilengkapi dengan detektor UV dan ELSD. Jumlah EO yang difraksinasi: 900,0 mg. Fase diam: partikel silika gel bulat, 50 m, 25 mg (Purezza®-Sphera Cartridge Stationary) berasal dari Sepachrom; fase gerak: bensin (A) dan etil asetat (B); laju alir 25 mL/menit. Elusi gradien linier diadopsi dari 100 persen A hingga 80 persen A dan 20 persen B selama 20 menit.

3.4. Kondisi Analisis

Solusi EO dan fraksinya masing-masing disiapkan dalam sikloheksana dengan konsentrasi 5.0 mg/mL dan dianalisis dengan GC-MS. Citral, sitronelal, -mirsen, dan limonen dikuantifikasi di setiap EO dan fraksi terisolasi yang sesuai menggunakan metode kalibrasi standar eksternal. Tingkat kalibrasi yang sesuai disiapkan insikloheksana dan dianalisis dengan GC-MS. Tridecane (C13) 1.0 mg/mL digunakan sebagai standar internal untuk menormalkan sinyal analit. Tabel 2 merangkum kisaran konsentrasi yang dipertimbangkan untuk setiap senyawa terukur.

Analisis GC-MS dilakukan menggunakan sampler serbaguna Gerstel MPS-2 (Mülheim an der Ruhr, Jerman) yang dipasang pada Agilent 6890 N GC yang digabungkan ke 5975 MSDdan dilengkapi dengan ChemStation Versi E. 02.02.1431 sistem pemrosesan data (AgilentTechnologies, Santa Clara, CA, USA). Kondisi GC: suhu injektor: 250 C; mode injeksi: split; rasio: 1/20; gas pembawa: helium; laju aliran konstan: 1 mL/menit; kolom: Mega5 (95 persen polydimethylsiloxane, 5 persen fenil) df 0,25 m, dc 0,25 mm, panjang 25 m, dari MEGA(Legnano, Italia). Program suhu: 50 C//3 C/mnt//180 C//10 C/mnt//250 C(5 mnt). Kondisi MSD: MS dioperasikan dalam mode EI (70 eV); rentang pemindaian: 35 hingga 350 amu; waktu tinggal 40 ms; suhu sumber ion: 230 C; suhu quadrupole: 150 C; suhu saluran transfer: 280 C. Penanda EO diidentifikasi dengan membandingkan indeks retensi linier (ITs), dihitung versus campuran hidrokarbon C9-C25, dan spektrum massanya baik terhadap sampel asli, atau dari perpustakaan spektral massa yang tersedia secara komersial (Adams, 2007). Analisis kiral EO dilakukan dengan mengadopsi kondisi analisis yang sama pada 2,3-di-O-methyl-6-Ot-butyldimethylsilyl- -CD (2,3DM6TBDMS -CD) df 0,25 m, dc 0,25 mm, panjang 25 m dari MEGA. Program suhu: 40 C(1 mnt)//2 C/mnt//220 C (5 mnt).

Analisis GC-FID dilakukan pada instrumen yang sama. Kondisi GC: suhu injektor: 250 C; mode injeksi: split; rasio: 1/20; gas pembawa: hidrogen; laju aliran: 1 mL / menit. Program suhu: 40 C (1 mnt)//2 C/mnt//220 C (5 mnt).

4. Kesimpulan

Tujuan dari penelitian ini adalah (1) untuk mengkaji jamur in vitro secara komprehensiftirosinaseaktivitas penghambatan Cymbopogon schoenanthus, Litsea cubeba, Melissa officinalis, dan Verbena officinalis EOs dan (2) untuk menentukan apakah aktivitas biologisnya berasal dari kandungan citralnya saja atau jika ada monoterpen bioaktif tambahan yang berkontribusi pada aktivitas biologis yang diselidiki dengan menggunakan a pendekatan fraksinasi yang dipandu bioassay. Studi ini telah mengidentifikasi bahwa dalam EO L. cubeba dan V. officinalis, -myrcene berkontribusi pada aktivitas penghambatan EO meskipun jumlahnya sedikit dan telah terbukti memiliki kekuatan penghambatan yang lebih besar terhadap citral. Temuan utama kedua adalah bahwa ( plus ) -sitronelal meningkatkan jamur citraltirosinasedaya hambat, berpotensi melalui interaksi sinergis karena tidak menunjukkan aktivitas sendiri. Temuan terakhir menjelaskan mengapa pada EO M. officinalis yang memiliki jumlah ( plus )-sitronelal yang dapat diabaikan, aktivitas penghambatannya sejalan dengan kandungan citralnya sedangkan sebaliknya berlaku untuk EO M. officinalis dengan kelimpahan yang relatif tinggi ( plus )-sitronelal. Bahkan meskipun penelitian lebih lanjut masih diperlukan untuk secara akurat menentukan jenis interaksi yang terjadi di antara -mirsen dan citral dan di antara sitronelal dan citral, dan untuk menilai aktivitas penghambatan EO ini dan senyawa individu pada manusiatirosinase, hasil penelitian ini dapat membantu untuk merancang campuran EO atau EO yang diperkaya secara rasional yang meningkatkan kemanjuran biologisnya dan meningkatkan potensinya sebagai bahan pembantu dalam pengobatan hiperpigmentasi.

Referensi

1. Pillaiyar, T.; Manickam, M.; Namasivayam, V. Agen pemutih kulit: Perspektif kimia obat dari inhibitor tirosinase.J. enzim. inhib. Med. Kimia 2017, 32, 403–425. [CrossRef]

2. Desmedt, B.; Courselle, P.; De Beer, JO; Rogiers, V.; Grosber, M.; Deconinck, E.; De Paepe, K. Tinjauan agen pemutih kulit dengan wawasan tentang pasar kosmetik ilegal di Eropa. J.Eur. akad. Dermatologi. Venerol. 2016, 30, 943–950. [CrossRef] [PubMed]

3. Desmedt, B.; Van Hoeck, E.; Rogiers, V.; Courselle, P.; De Beer, JO; De Paepe, K.; Deconinck, E. Karakterisasi kosmetik pemutih kulit yang dicurigai ilegal. J. Farmasi. Bioma. dubur. 2014, 90, 85-91. [CrossRef] [PubMed]

4. Kubo, aku.; Ikuyo, KH Flavonol dari bunga saffron: Aktivitas penghambatan tirosinase dan mekanisme penghambatannya. J. Pertanian. Kimia Makanan.1999, 47, 4121-4125. [CrossRef]

5. Chang, C.-TT; Chang, W.-LL; Hsu, J.-CC; Shih, Y.; Chou, S.-TT Komposisi kimia dan aktivitas penghambatan tirosinase dari minyak esensial kayu manis. Bot. pejantan 2013, 54, 2–8. [CrossRef]

6. Garcia-Molina, MDM; Muñoz-Muñoz, JL; Garcia-Molina, F.; Garcia-Ruiz, PA; Garcia-Canovas, F. Aksi tirosinase onorto-tersubstitusi fenol: Kemungkinan pengaruh pada pencoklatan dan melanogenesis. J. Pertanian. Kimia Makanan. 2012, 60, 6447–6453. [CrossRef]

7. Kubo, aku.; Kinst-Hori, I. Inhibitor Tirosinase dari Jinten. J. Pertanian. Kimia Makanan. 1998, 46, 5338–5341. [CrossRef]

8. Matsuura, R.; Ukeda, H.; Sawamura, aktivitas penghambatan M. Tyrosinase minyak esensial jeruk. J. Pertanian. Kimia Makanan. 2006,54, 2309–2313. [CrossRef]

9. Lertsatitthanakorn, P.; Taweechaisupapong, S.; Aromdee, C.; Khunkitti, W. Bioaktivitas in vitro minyak esensial yang digunakan untuk pengendalian jerawat. Int. J. Aromater. 2006, 16, 43–49. [CrossRef]

10. Bouzenna, H.; Hfaiedh, N.; Giroux-Metges, M.-A.; Elfeki, A.; Talarmin, H. Sifat biologis citral dan efek perlindungan potensialnya terhadap sitotoksisitas yang disebabkan oleh aspirin dalam sel IEC-6. Bioma. apoteker. 2017, 87, 653–660. [CrossRef]

11. Lee, HJ; Jung, HS; Kim, DJ; Tidak, YH; Yuk, DY; Hong, JT Efek penghambatan citral pada produksi NO dengan menekan ekspresi iNOS dan aktivasi NF-κB dalam sel RAW264.7. Lengkungan. Farmasi. Res. 2008, 31, 342–349. [CrossRef]

12. Carvalho, PMM; Macdo, CAF; Ribeiro, TF; Silva, AA; Da Silva, RER; de Morais, LP; Kerntopf, MR; Menezes, IRA;Barbosa, R. Pengaruh minyak esensial Lippia alba (Mill.) NE Brown dan konstituen utamanya, citral dan limonene, pada otot polos trakea tikus. Bioteknologi. Rep. 2018, 17, 31–34. [CrossRef] [PubMed]

13. Pereira-de-Morais, L.; Silva, Ada; da Silva, RER; Costa, RHSd; Monteiro, .B.; Barbosa, CRdS; Amorim, TdS; deMenezes, IRA; Kerntopf, MR; Barbosa, aktivitas R. Tokolitik minyak esensial Lippia alba dan konstituen utamanya, citral andlimonene, pada rahim tikus yang terisolasi. Kimia Biol. Berinteraksi. 2019, 297, 155–159. [CrossRef]

14. Da Silva, RER; de Morais, LP; Silva, AA; Bastos, CMS; Pereira-Gonçalves, .; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso,JH; Barbosa, efek R. Vasorelaksan dari minyak esensial Lippia alba dan konstituen utamanya, citral, pada kontraktilitas aorta tikus yang diisolasi. Bioma. apoteker. 2018, 108, 792–798. [CrossRef] [PubMed]

15. Sousa, Ditjen; Sousa, SDG; Silva, RER; Silva-Alves, KS; Ferreira-da-Silva, FW; Kerntopf, MR; Menezes, IRA; Leal-Cardoso,JH; Barbosa, R. Minyak esensial Lippia alba dan konstituen utamanya citral memblokir rangsangan saraf siatik tikus. braz. J. Med.Biol. Res. 2015, 48, 697–702. [CrossRef] [PubMed]

16. Huang, X.-W.; Feng, Y.-C.; Huang, Y.; Li, H.-L. Aplikasi kosmetik potensial dari minyak atsiri yang diekstraksi dari buah Litsea cubeba dari Cina. J. Esensi. Minyak Res. 2013, 25, 112–119. [CrossRef]

17. Zolghadri, S.; Bahrami, A.; Hasan Khan, MT; Munoz-Munoz, J.; Garcia-Molina, F.; Garcia-Canovas, F.; Saboury, AA Ulasan komprehensif tentang inhibitor tirosinase. J. Enzim. inhib. Med. Kimia 2019, 34, 279–309. [CrossRef]

18. Bicchi, C.; Liberto, E.; Matteo, M.; Sgorbini, B.; Mondello, L.; Zellner, Bd; Kosta, R.; Rubiolo, P. Analisis kuantitatif minyak esensial: Sebuah tugas yang kompleks. Aroma Rasa J. 2008, 23, 382–391. [CrossRef]

19. Rubiolo, P.; Sgorbini, B.; Liberto, E.; Cordero, C.; Bicchi, C. Minyak atsiri dan volatil: Persiapan dan analisis sampel. Sebuah ulasan.Flavour Fragr. J. 2010, 25, 282–290. [CrossRef]

20. Seidler-Łozykowska, K.; Bocianowski, J.; Król, D. Evaluasi keragaman morfologi dan sifat kimiawi genotipe lemon balm (Melissa officinalis L.) terpilih. Produk Tanaman Ind. 2013, 49, 515–520. [CrossRef]

21. Kubo, aku.; Kinst-Hori, I. Aktivitas penghambatan tirosinase dari senyawa rasa minyak zaitun. J. Pertanian. Kimia Makanan. 1999, 47, 4574–4578.[CrossRef] [PubMed]

22. Fiocco, D.; Arciuli, M.; Arena, MP; Benvenuti, S.; Gallone, A. Komposisi kimia dan potensi anti-melanogenik dari minyak esensial yang berbeda. Aroma Rasa J. 2016, 31, 255–261. [CrossRef]

23. Hu, JJ; Li, X.; Liu, XH; Zhang, WP Efek penghambatan minyak esensial lemon pada aktivitas tirosinase jamur in vitro. Mod. Ilmu Makanan teknologi. 2015, 31, 97–105. [CrossRef]

24. Dewan Eropa. Farmakope Eropa, edisi ke-10; Dewan Eropa: Strasburg, Prancis, 2020; ISBN 978-92-871-8921-9.

25. Zheng, ZP; Tan, HY; Chen, J.; Wang, M. Karakterisasi inhibitor tirosinase di ranting Cudrania tricuspidata dan studi hubungan struktur-aktivitasnya. Fitoterapia 2013, 84, 242–247. [CrossRef] [PubMed]

26. Williams, KP; Scott, Desain Uji Enzim JE untuk Penyaringan Hasil Tinggi. Dalam Penyaringan Throughput Tinggi. Metode dalam Biologi Molekuler (Metode dan Protokol); Janzen, WP, Paul, B., Eds.; Humana Press: Clifton, NJ, AS, 2009; Jilid 565, hal. 107–126.

27. Brooks, HB; Geeganage, S.; Kahl, SD; Montrose, C.; Sittampalam, S.; Smith, MC; Weidner, JR Basics of Enzymatic Assays for HTS. Dalam Panduan Panduan Pengujian; Markossian, S., Sittampalam, S., Grossman, A., Eds.; Eli Lilly & Company dan Pusat Nasional untuk Memajukan Ilmu Penerjemahan: Bethesda, MD, AS, 2004