Bagaimana Kalsium mengobati kerusakan ginjal yang disebabkan oleh luoride?
Mar 16, 2022
Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}
Kata kunci: Kalsium, Ginjal, Apoptosis
ABSTRAK
Asupan fluoride (F) yang berlebihan dalam jangka panjang dapat menyebabkan kerusakan osseous dan non-osseous. Ituginjaladalah organ ekskresi fluoride utama tubuh. Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi apakah dietkalsiumsuplemen dapat meringankanginjalkerusakan yang disebabkan oleh fluorosis dan untuk menyelidiki lebih lanjut efek dariKalsiumtentang mekanisme mitigasiginjalselapoptosisdipicu oleh F. Kami mengevaluasi struktur histopatologi,ginjalindikator fungsi, dan tingkat ekspresi gen dan protein dari kematian yang dimediasi reseptorapoptosisjalur pada tikus Sprague Dawley (SD) yang diobati dengan natrium fluorida (NaF) dan/ataukalsiumkarbonat (CaCO3) selama 120 hari. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 100 mg/L NaF terinduksiginjalcedera histopatologis danapoptosis, meningkatkan konsentrasi Kreatinin (CRE), asam urat (UA), nitrogen urea darah (BUN), kalium (K), fosfor (P), dan F (p < {{0}}.05)="" ,="" dan="" menurunkan="" kadar="" magnesium="" serum="" (mg)="" (p=""><0,05). selain="" itu,="" naf="" meningkatkan="" tingkat="" ekspresi="" mrna="" dan="" protein="" dari="" reseptor="" kematian="" permukaan="" sel="" fas="" (fas),="" faktor="" nekrosis="" tumor="" (tnf),="" terkait="">apoptosis-inducing ligand (TRAIL), Caspase 8, Caspase 3, dan poly ADP-ribose polymerase (PARP) (p < 0.01),="" yang="" akhirnya="" mengaktifkan="" jalur="" reseptor="" kematian.="">Kalsiumsuplementasi membalikkan penurunan kadar CRE, BUN, UA, F, dan P yang diinduksi oleh F, mengurangi kerusakan histopatologis danapoptosis, dan mengurangi tingkat ekspresi gen dan protein penanda terkait jalur reseptor kematian. Kesimpulannya, 1 persenKalsiummengurangi F-diinduksiginjalapoptosismelalui jalur pensinyalan FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL.
pengantar
Fluor banyak terdapat di tanah, air, dan makanan. Namun, beberapa faktor alam (pelapukan mineral dan batuan, pembentukankalsiumdan garam magnesium, infiltrasi air tanah, dll.) dan aktivitas manusia (air limbah industri, bahan kimia pertanian, produk rumah tangga, dll.) menyebabkan pencemaran fluor di lingkungan (Daiwile et al., 2019). Saat ini, faktor terbesar dari paparan fluoride (F) adalah air minum, dan konsentrasi F yang direkomendasikan dalam air minum oleh Organisasi Kesehatan Dunia adalah kurang dari 1,5 mg/L (Guidelines for Drink-Water Quality, 2017). Bukti epidemiologis menunjukkan bahwa lebih tinggi dari konsentrasi ini meningkatkan risiko fluorosis gigi, dan peningkatan konsentrasi akan meningkatkan risiko fluorosis tulang (Pedoman untuk Kualitas Air Minum, 2017; Dewan Riset Nasional, 2006). Paparan jangka panjang terhadap konsentrasi fluoride yang tinggi dapat meningkatkan penyerapan fluor oleh tubuh melalui saluran pernapasan
dan saluran pencernaan. Asupan F yang berlebihan dapat menyebabkan kerusakan pada organ tubuh yang bertulang dan tidak bertulang. Kerusakan jaringan lunak di luar tulang umumnya disebut sebagai kerusakan non-tulang. Saat ini telah ditemukan kerusakan jaringan non tulang yang disebabkan oleh F melibatkan saluran pencernaan, hati,ginjal, otak, dll. (Jha et al., 2011; Perumal et al., 2013).
Ituginjal, organ ekskresi utama tubuh, bertanggung jawab untuk metabolisme zat beracun dan racun eksogen dalam tubuh. Penelitian telah melaporkan bahwa sekitar 50-80 persen dari fluoride yang tertelan oleh tubuh disaring dan diserap kembali oleh tubuh.ginjal, dan sisa fluor terakumulasi di jaringan dan organ lain (Chen et al., 2013; Dharmaratne, 2019). Berbagai literatur telah menunjukkan bahwa paparan 50 dan 100 mg/LF dapat menyebabkan pembesaran rongga kapsul ginjal, atrofiginjaltubulus, susunan sel papiler yang tidak teratur, penyempitan lumen, mengakibatkanapoptosisdariginjalsel dan penurunan fungsi biokimia seperti kreatinin (CRE), asam urat (UA),kalsium(Ca), dan fosfor (P) (Song et al., 2014; HW Wang et al., 2020; Wei et al., 2018a).
Apoptosis, semacam kematian sel yang dikendalikan oleh gen, yang dibagi menjadi endogenapoptosisdan eksogenapoptosis. Laporan terbaru menunjukkan bahwaapoptosisdisebabkan oleh F tinggi terutama mencakup jalur yang dimediasi mitokondria, retikulum endoplasma yang dimediasi stres, dan jalur yang dimediasi reseptor kematian (Wei et al., 2018a). Eksperimen sebelumnya dalam kelompok kami menunjukkan bahwa NaF menginduksi tulang dan hatiapoptosismelalui jalur retikulum endoplasma (ER) intraseluler dan jalur mitokondria (Li et al., 2021; J. Wang et al., 2020; Wang et al., 2019). Selain itu, penelitian juga menunjukkan bahwa jalur mitokondria terlibat dalam NaF-inducedapoptosisdari tikusginjal(Wei et al., 2018b). Namun, tidak ada studi sistematis tentang jalur yang dimediasi reseptor kematian pada F-inducedginjalapoptosis. Jalur reseptor kematian mendominasi setiap tahap eksogenapoptosis, termasuk jalur reseptor kematian permukaan sel (FAS) Fas, jalur faktor nekrosis tumor (TNF), dan jalur terkait TNFapoptosis-inducing ligand (TRAIL) jalur (Grunert et al., 2012; Lu et al., 2017; Wang dan Su, 2018). Jalur FAS adalah sistem transduksi sinyal primitif yang memediasiapoptosis. FAS memiliki karakteristik reseptor membran dan membentuk trimer setelah berikatan dengan ligan FAS (FAS-L). Kemudian domain spesifik trimer berikatan dengan domain kematian (DD) dari protein domain kematian terkait FAS (FADD) molekul connexin yang sesuai untuk membentuk kompleks sinyal yang diinduksi kematian (DISC) (Wang dan Su, 2018). Dalam proses transduksi sinyal biologis berikut, FADD dapat mengaktifkan Caspase 8 dan keluarga Caspase secara bersamaan, dan pada akhirnya menyebabkanapoptosismelalui partisipasi efek Caspase 3 dan poli ADP-ribosa polimerase (PARP) (Kischkel et al., 2000; Meynier dan Rieux-Laucat, 2019). Studi terbaru menunjukkan bahwa jalur FAS memediasiapoptosisdalam sel T dan selamaginjalkegagalan yang disebabkan oleh cisplatin (Djiadeu et al., 2017; Linkermann et al., 2011). Selain itu, sebuah penelitian juga melaporkan bahwa NaF menginduksiapoptosispada tikus melalui jalur FAS (Sun et al., 2017). TRAIL adalah sitokin yang diakui dalam superfamili TNF. Ini mengikat reseptor agonis homolognya, yaitu reseptor kematian (DR4 dan DR5). Ada DD di wilayah selulernya. DD diperlukan untuk perekrutan FADD protein adaptif. FADD pada gilirannya menginduksi pelepasan Caspases ke dalam sitoplasma, mengaktifkan Caspase 3 memotong PARP, dan menghambat potensi perbaikan DNA, menghasilkanapoptosis(Bodmer et al., 2000; Michael, 2018). Telah tersirat bahwa jalur TRAIL/DR5 terlibat dalam induksi NaFapoptosispada tikus (Song et al., 2021). Osteoprotegerin (OPG) adalah reseptor larut bebas yang tidak memiliki domain transmembran. Itu dapat menahan TRAIL-dimediasiapoptosisdengan menghambat pengikatan TRAIL dan reseptor kematian lainnya (Duiker et al., 2006; Kiraz et al., 2016; Micheau, 2018). Pengikatan reseptor TNF dan TNF (TNF-R1) dapat mengaktifkan rekrutmen protein TNFR-associated death domain (TRADD) melalui DD-nya. Setelah itu, TRADD berinteraksi dengan FADD, mengarah pada perekrutan pro-Caspase 8, yang dipecah menjadi Caspase 8 aktif oleh enzim proteolitik. Caspase 8 kemudian mengaktifkan Caspase 3, yang bertanggung jawab untuk selapoptosis(Kiraz et al., 2016; Sedger dan McDermott, 2014). Dilaporkan bahwa NaF menginduksi hepatositapoptosispada tikus melalui jalur sinyal TNF-R1 (Lu et al., 2017)
Kalsiummemainkan berbagai peran dalam komposisi tulang dan gigi, dan juga dapat mengontrol transmisi saraf dan pelepasan material (Cao et al., 2016), berpartisipasi dalam sistemikkalsiumhomeostasis (Carmeliet et al., 2003; Yang et al., 2016), mengubah permeabilitas membran (Lappe et al., 2017), mengaktifkan sekresi berbagai enzim dan hormon (Kim et al., 2012), dll. Banyak penelitian sebelumnya menemukan bahwa F dan Ca memiliki efek antagonis dalam biologi (Dure-Smith et al., 1996; Nobrega et al., 2019). Setelah F diserap oleh tubuh, ia akan masuk ke dalam darah membentuk endapan CaF2 yang tidak larut. Jika suplai makanan Ca tidak mencukupi dan Ca darah tidak mencapai tingkat yang seharusnya, akan terjadi perubahan patologis seperti hipokalsemia dan osteolisis, sehingga suplemen makanan Ca berperan penting dalam mencegah dan memperbaiki fluorosis (Dure-Smith et al., 1996; Li dkk., 2021; Yang dkk., 2021). Grup kami telah mengkonfirmasi diet itukalsiumdapat meringankanapoptosistulang dan hati melalui jalur sinyal PI3K-AKT, jalur ER, dan jalur mitokondria (Li et al., 2021; J. Wang et al., 2020; Wang et al., 2019; Yang et al., 2021). Untuk lebih membuktikan apakahKalsiummelemahkan nefrotoksisitas F melalui kematian yang dimediasi reseptorapoptosisjalur, kami membuat model tikus diet fluoride tinggikalsiumdan mengevaluasiginjalindeks cedera, derajatapoptosis, dan perubahan gen penanda dan ekspresi protein di mediasi reseptor kematianapoptosisjalan.
Bahan dan metode
Bahan kimia dan instrumen
Air suling disiapkan oleh Heal Force Water Purification System (Shanghai, China). Radio immunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer dan Sodium fluoride (NaF) disediakan oleh Sigma-Aldrich (Shanghai, China). 10 persen formalin, Glycine, sodium dodecyl sulfate (SDS), TRIS, Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), CaCO3, membran nitroselulosa (NC), Kit Bicinchoninic Acid (BCA) dan kit pewarnaan hematoxylin-eosin (H&E) diperoleh dari Solarbio Technology Co ., Ltd. (Beijing, Cina). Reagen trizol diperoleh dari Takara Biological Engineering Company (Dalian, China). Kit CRE, UA, nitrogen urea darah (BUN), magnesium (Mg), P, dan kalium (K) dibeli dari Institut Bioteknologi Nanjing Jiancheng (Nanjing, Cina). Di tempatapoptosiskit deteksi, antibodi Poliklonal Kelinci FAS (BA0484), dan antibodi Poliklonal Kelinci FAS-L (PB0042) dibeli dari Boster Biotechnology (Wuhan, China). -actin Rabbit Polyclonal antibody (20536-1-AP), FADD Rabbit Polyclonal antibody (14906-1-AP), Caspase 8 Rabbit Polyclonal antibody (13423-1-AP), Caspase 3 Rabbit Polyclonal antibodi ({{9 }}AP), dan HRPconjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H plus L) (SA00001–2) diperoleh dari Proteintech Group (Wuhan, Cina). TRAL Rabbit Polyclonal Antibody (bs-1214R), TNF alpha Rabbit Polyclonal antibody (bs2081R), PARP Rabbit Polyclonal Antibody (bs-55164R) dibeli dari Bioss (Beijing, China). Pendaran elektrokimia (ECL) dan 3,3′-diaminobenzidine (DAB) dibeli dari KeyGen Biotech (Jiangsu, Cina). PrimeScript® RT Master Mix dan SYBR® Premix Ex Taq™ II Kit disediakan oleh Promega Biotechnology (Beijing, China).
Hewan dan perawatan
Empat puluh tikus jantan Sprague-Dawley (SD) jantan berumur {{{0}}berumur seminggu (120 ± 20 g) diperoleh dari Pusat Hewan Eksperimental Universitas Kedokteran Shanxi (Shanxi, Cina). Tikus diaklimatisasi selama satu minggu, dibagi secara acak menjadi empat kelompok (10 ekor per kelompok): Kelompok kontrol (C), kelompok NaF (F), kelompok NaF ditambah 0,5 persen CaCO3 (F ditambah 0,5 persen Ca), NaF ditambah 1 persen Gugus CaCO3 (F ditambah 1 persenKalsium) dan diperlakukan seperti Tabel 1. Semua tikus ditempatkan di kandang plastik pada suhu 22-25 C (kelembaban 55 ± 5 persen, siklus terang/gelap 12 jam), makanan dan air minum dapat diakses secara bebas.
Setelah 17 minggu pemeliharaan, tikus dipuasakan selama 24 jam, dan air minum gratis. Kemudian tikus dibius dengan natrium pentobarbital dan dikorbankan dengan cara dislokasi serviks setelah darah diambil dari bola mata. Beberapa darah dikumpulkan dengan tabung yang mengandung natrium heparin antikoagulan untuk tes BUN. Sebagian darah dimasukkan ke dalam tabung reaksi biasa, ditempatkan pada suhu kamar selama 2 jam, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm/menit selama 10 menit untuk memisahkan serum. Serum dipisahkan untuk uji CRE, UA, Mg, P, K, dan F. Delapan sampel dariginjaldari masing-masing kelompok dipilih secara acak dan dengan cepat dibekukan dalam nitrogen cair, dan kemudian disimpan pada suhu -80 C untuk percobaan qRT-PCR dan western blotting. Sampel lainnya dariginjaldifiksasi dalam formalin 10 persen untuk pemeriksaan histopatologi dan percobaan terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). Semua operasi eksperimental yang berhubungan dengan hewan dilaksanakan secara ketat di bawah peraturan Lembaga Perawatan Hewan dan Komite Penggunaan Universitas Pertanian Shanxi, Shanxi, Cina.
Ginjalkoefisien
Tikus ditimbang terlebih dahulu; laluginjaljaringan diangkat dan ditimbang. Ituginjalkoefisien diperoleh dengan rumus berikut.
Ginjalkoefisien=[ginjalberat basah (g) / berat badan (g)] ×100 persen .
Pemeriksaan histopatologi
Ginjalspesimen tertanam dalam parafin. Bagian (ketebalan 5 m) dariginjaldiwarnai oleh H&E. Kemudian, slide diamati menggunakan mikroskop cahaya (Olympus, Tokyo, Jepang). Tingkat keparahanginjalcedera dinilai dengan skor histopatologi.Ginjalcedera tubulus didefinisikan sebagaiginjalsel-sel menjadi atrofi dan cacat,ginjalrongga kapsul melebar,ginjaltubulus membentuk gips, dan sel-sel epitel jatuh. Pada pembesaran 200 kali, kriteria berikut digunakan untuk mengevaluasi derajat kerusakan hati. 1: 0–25 persen kerusakan; 2: 25–50 persen kerusakan; 3: 50–75 persen kerusakan; 4: 75–100 persen kerusakan (Baranova et al., 2016).
Penentuanginjal-indikator terkait
Kadar F diukur dengan elektroda spesifik ion F (Quadri et al., 2018). Tingkat CRE, UA, BUN, Mg, P, dan K diukur dengan menggunakan kit yang tersedia secara komersial. Semua prosedur terkait dilakukan sesuai dengan instruksi pabrik.
Deteksi dariapoptosistingkat oleh TUNEL
Untuk mengukurapoptosisdiginjalsel, analisis eksperimental dilakukan dengan menggunakanapoptosisalat pendeteksi. Ituginjalbagian dideparafinisasi dan kemudian mengalami pencernaan dengan menggunakan Proteinase K. Terminal Deoxynucleotidyl Transferase dapat menandai digoxin-labeled dUTP (DIG-dUTP) ke ujung 3′-OH, dan DIG-dUTP mengikat breakpoint DNA setelah bereaksi dengan biomarker anti -dig-Biotin. Dikombinasikan dengan DAB ditambahkan ke tampilan. Untuk memvisualisasikan
semua inti, bagian-bagian itu diwarnai dengan hematoxylin. Sinyal coklat tua menunjukkan sel positif dan biru menunjukkan sel tidak responsif. Ituapoptosisindeks dihitung menurut rumus berikut.
Proporsi sel apoptosis=(jumlah sel apoptosis per node / jumlah total sel per node) ×100 persen .
PCR waktu-nyata kuantitatif (qRT-PCR)
RNA total dariginjaldiekstraksi dengan menggunakan reagen Trizol. Kami menggunakan spektrofotometer ND{{{0}} (nano-drop, USA) dan elektroforesis gel agarosa untuk memeriksa kualitas dan kuantitas RNA. Transkripsi terbalik (RT) dilakukan pada RNA total 500 ng dengan menggunakan PrimeScript® RT Master Mix. Primer spesifik untuk -aktin dan FAS, TRAIL, TNF, dan gen lainnya dirancang oleh perangkat lunak Primer Premier 7.0 (Tabel 2) dan disintesis oleh Sangon Biotech (Shanghai, Cina). Quantstudio 7 flex real-time PCR system (thermo-fisher, USA) dan SYBR® Premix Ex Taq™ II Kit digunakan untuk RT-PCR. Volume reaksi PCR adalah 20 L, dan kondisi RT-PCR adalah: 95 C 10
menit, 40 siklus 95 C 15 s, 55 C 30 s, 72 C 30 s, dan akhirnya satu siklus 95 C 15 s, 60 C 15 s, 95 C 15 s. Semua reaksi diulang tiga kali. Metode 2-ΔΔCt relatif digunakan untuk menghitung tingkat ekspresi mRNA relatif, dan -aktin digunakan sebagai kalibrator. Dalam prosesnya, perbedaan efisiensi kurang dari 5 persen.
Ekstraksi protein total dan analisis western blotting
Ituginjaljaringan dicuci dengan PBS, dikeringkan dengan kertas saring, dan didekomposisi dalam lisis RIPA (mengandung PMSF), pada kecepatan 12,000 rpm/menit, 4◦C selama 10 menit. Konsentrasi protein ditentukan dengan menggunakan Kit Bicinchoninic Acid (BCA) (Solarbio Science & Technology, Beijing, China). Sampel protein 35 ng berhasil diekstraksi dan dipisahkan pada 8 persen gel SDS-poliakrilamida dengan elektroforesis. Protein target dipindahkan ke membran NC, dan membran NC diblokir dengan 5 persen susu non-lemak pada suhu kamar selama 2 jam. Setelah itu, membran NC diinkubasi dengan antibodi primer -aktin (1:1000), TRAIL (1:500), FAS (1:500), FAS-L (1:100), TNF (1:500), FADD (1:500), Caspase 8 (1:500), Caspase 3 (1:500) dan PARP (1:1000) pada 4 derajat semalam. Setelah dicuci 3 kali dengan PBST, membran NC diinkubasi dengan antibodi IgG anti-kelinci kambing sekunder terkonjugasi HRP (1:2000) pada suhu kamar selama 2 jam. ECL digunakan untuk memvisualisasikan pita protein target. Densitas optik dihitung dengan perangkat lunak AlphaView (versi: 3.2.2.0) pada sistem FluorChem Q (Alpha Innotech, CA, USA).
Analisis statistik
Perangkat lunak GraphPadPrism{{0}} digunakan untuk mengatur dan menganalisis data eksperimen, dan setiap data diwakili oleh mean ± SEM. Signifikansi perbedaan antara mean ditentukan dengan analisis varians (ANOVA) diikuti dengan uji Tukey dengan P < 0,05="" dianggap="">
Hasil
Perubahan dalamginjalkoefisien dan indikator fungsi biokimia
Ituginjalkoefisien dan kadar F, CRE, BUN, UA, Mg, P, K ditunjukkan pada Gambar. 1. Dibandingkan dengan kelompok C,ginjalkoefisien menurun secara signifikan pada kelompok F (p < 0.05).="" namun,="" koefisien="" ginjal="" dalam="" f="" ditambah="" 1="">Kalsiumkelompok menunjukkan peningkatan yang signifikan dibandingkan dengan kelompok F (p < {{0}}.05).="" tingkat="" f="" pada="" kelompok="" f="" secara="" nyata="" lebih="" tinggi="" dari="" pada="" kelompok="" c="" (p=""><0,001). menariknya,="" dibandingkan="" dengan="" kelompok="" f,="" kadar="" f="" pada="" kelompok="" f="" ditambah="" 1="" persen="" ca="" menurun="" secara="" signifikan="" (p=""><>
CRE, BUN, dan UA dievaluasi untuk mencerminkan derajatginjalkerusakan dan perubahan fungsi. Tingkat CRE, BUN, dan UA secara jelas meningkat pada kelompok F dibandingkan dengan kelompok C (p < 0.05),="" namun,="" relatif="" terhadap="" kelompok="" f,="" tiga="" indikator="" di="" atas="" secara="" khusus="" menurun="" di="" f="" ditambah="" 1="">Kalsiumgrup (p < 0.05).="" mg,="" p="" dan="" k="" adalah="" indikator="" elektrolit="" yang="" berhubungan="" erat="">ginjalfungsi. Dibandingkan dengan kelompok C, kadar Mg serum secara signifikan menurun, kadar P dan K meningkat secara dramatis pada kelompok F (p < 0.05).="" namun="" demikian,="" menambahkan="" 1="">kalsiumuntuk diet terutama meningkatkan kadar serum Mg sebesar 15,3 persen (p < 0.05)="" dan="" secara="" nyata="" mengurangi="" kadar="" p="" serum="" sebesar="" 16,9="" persen="" (p=""><0,05). kandungan="" serum="" k="" telah="" menunjukkan="" tren="" penurunan="" tanpa="" signifikansi="" setelah="" pemberian="" suplemen="" 1="" persen="">
Perubahan dalamginjalmorfologi
Perubahan morfologi dariginjaljaringan diperiksa dengan H&E (Gbr. 2I-Ⅳ, -ⅳ). Di grup C,ginjalsel tubulus tersusun rapat, morfologi teratur, dan morfologi glomerulus utuh. Namun, batas antar sel tidak jelas,ginjalsel-sel menjadi atrofi dan cacat,ginjalrongga kapsul melebar,ginjaltubulus membentuk gips, dan sel epitel menjadi terlepas dalam kelompok F. Dibandingkan dengan kelompok F, dengan peningkatanKalsiumkonsentrasi, susunanginjalsel secara bertahap menjadi lebih teratur, morfologiginjalsel-sel secara bertahap pulih, dan tingkat cedera secara bertahap berkurang. Selain itu, kami mengevaluasi kerusakan dengan menggunakanginjalskor (Gbr. 2Ⅴ). Skor kelompok F secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok C (p < 0.01);="" namun="" demikian,="" skor="" dalam="" f="" ditambah="" 1="">Kalsiumkelompok menurun tajam jika dibandingkan dengan kelompok F (p < 0.05).
TUNEL mendeteksiginjalselapoptosis
Kami melakukan uji TUNEL untuk mendeteksi dan menganalisis apakahginjalsel telah mengalamiapoptosisdalam penelitian ini (Gbr. 3I-Ⅳ, -ⅳ).Ginjaljaringan pada kelompok C tersusun rapi, dengan jumlah sel apoptosis yang lebih sedikit (4,67 ± 1,15 persen). Grup F menunjukkan sejumlah besar TUNEL-positifginjalsel epitel tubulus (48,17 ± 3,94 persen ). Sebaliknya, F ditambah 1 persenKalsiumkelompok menunjukkan penurunan dramatis dalam jumlah sel TUNEL-positif (28,83 ± 4,81 persen) (Gbr. 3Ⅴ).
Efek dariKalsiumpada perubahan yang diinduksi F pada gen terkait jalur reseptor kematian
Tingkat ekspresi mRNA relatif dari faktor hulu yang terkait dengan kematian yang dimediasi reseptorapoptosisjalur (TRAIL, DR5, TNF, TNFR1, TNF-R2, FAS, FAS-L, OPG) terungkap pada Gambar. 4a. Sehubungan dengan kelompok C, tingkat ekspresi mRNA dari TRAIL, DR5, TNF, TNF-R1, TNFR2, FAS, dan FAS-L terutama ditingkatkan pada tikus yang diberi perlakuan F (p < 0.01).="" sebaliknya,="" ekspresi="" mrna="" relatif="" dari="" trail,="" tnf,="" tnf-r2,="" fas,="" dan="" fas-l="" berkurang="" secara="" nyata="" pada="" f="" ditambah="" 1="">Kalsiumkelompok dibandingkan dengan kelompok F (p < {{0}}.05).="" dibandingkan="" dengan="" kelompok="" c,="" penurunan="" yang="" jelas="" pada="" tingkat="" ekspresi="" mrna="" opg="" pada="" kelompok="" f="" diamati="" (p=""><0,01). namun,="" relatif="" terhadap="" grup="" f,="" opg="" di="" f="">Kalsiumkelompok ditingkatkan. Faktor hilir FADD, TRADD, Caspase 8, Caspase 3, dan tingkat ekspresi mRNA relatif PARP ditunjukkan pada Gambar. 4b. Ekspresi protein FADD, TRADD, Caspase 8, Caspase 3, dan PARP jelas ditingkatkan pada kelompok F dibandingkan dengan kelompok C (p < 0.01),="" tetapi="" jelas="" berkurang="" pada="" f="">Kalsiumkelompok, dibandingkan dengan kelompok F (p < 0.05).
Efek dariKalsiumpada perubahan yang diinduksi F dalamapoptosisprotein terkait
Ekspresi protein TRAIL, FAS, FAS-L, TNF, FADD, Caspase 8, Caspase 3, dan PARP dideteksi dengan Western blotting (Gbr. 5a, b). Dibandingkan dengan kelompok C, ekspresi protein TRAIL, FAS, FAS-L, TNF, FADD, Caspase 8, Caspase 3, dan PARP pada kelompok F sangat meningkat (p < 0.01).="" ekspresi="" protein="" dari="" semua="" faktor="" di="" atas="" terutama="" menurun="" pada="" f="" ditambah="" 1="">Kalsiumkelompok jika dibandingkan dengan kelompok F (p < 0.05).
Diskusi
Bukti terbaru membuktikan bahwa F dapat menyebabkan lesi pada jaringan lunak, dan tingkat kerusakan F tergantung pada konsentrasi F, waktu pemaparan, dan jenis organ (Wei et al., 2019). Dalam penelitian ini, 100 mg/L NaF digunakan selama 17 minggu untuk membuat model hewan paparan NaF subakut air minum. Dosis NaF dipilih sesuai dengan tingkat polusi F di lingkungan dan faktor-faktor yang tidak pasti dari spesies yang berbeda. Mengingat bahwa konsentrasi F- alami yang diukur dalam air tanah setempat adalah sekitar 4,5 mg/L, air suling dengan 100 mg/L NaF yang digunakan dalam penelitian ini (konsentrasi F-nya sekitar 45 mg/L) dihitung berdasarkan faktor yang tidak pasti untuk ekstrapolasi hewan-ke-manusia pada 10 (Pedoman Kualitas Air Minum, 2017; Mukherjee dan Singh, 2021; Wen et al., 2013; Zhang et al., 2020). Studi awal telah menemukan bahwa dietkalsiumdapat mempengaruhi penyerapan fluor, meningkatkan ekskresi fluor dalam tubuh, mengurangi tingkat penyerapan fluor, dan dengan demikian mengurangi toksisitas F (Harrison et al., 1984; Larsen et al., 1981). Studi eksperimental kami baru-baru ini menunjukkan bahwa Ca mengurangi cedera tulang dan hati yang diinduksi F dengan menghambat jalur intrinsikapoptosis(Li et al., 2021; J. Wang et al., 2020; Wang et al., 2019). Namun, sejauh ini, penelitian tentang efek perlindungan Ca pada nefrotoksisitas yang diinduksi F dan mekanisme terkaitnya belum pernah terjadi sebelumnya. Di sini, kami melaporkan bahwa Ca mengurangi yang diinduksi Fginjalkerusakan. Selain itu, kami juga menemukan bahwa Ca membalikkan yang diinduksi Fginjalselapoptosismelalui kematian yang dimediasi reseptorapoptosis(jalur FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL). Akumulasi F jangka panjang diginjaldapat menyebabkan kerusakan struktur dan fungsional jaringan. Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa paparan NaF menyebabkanginjalselapoptosispada tikus, disertai dengan atrofi dan deformasi glomerulus,ginjalpelebaran rongga kapsul,ginjaltubulus membentuk gips, dan sel-sel epitel jatuh. Namun,ginjalkerusakan berkurang secara signifikan setelah suplementasi 1 persen Ca. Hasil ini serupa dengan hasil yang diperoleh pada laporan sebelumnya (Cao et al., 2015; HW Wang et al., 2020).
CRE adalah metabolit otot, UA adalah produk akhir metabolisme purin, dan BUN adalah produk akhir utama dari metabolisme protein tubuh, yang diekskresikan melalui filtrasi glomerulus dan biasanya digunakan untuk mendeteksiginjalfungsi (Myers et al., 2006; HW Wang et al., 2020). Survei biokimia wilayah F tinggi menunjukkan bahwa laju filtrasi glomerulus berkurang secara signifikan, dan F, UA, dan BUN berubah secara signifikan (Malin et al., 2019). Tes pada hewan menunjukkan bahwa serum CRE,Kalsium, dan konsentrasi P berkurang secara signifikan pada tikus yang terpapar 100 mg/L NaF, menunjukkan bahwa F tergangguginjalfungsi serta metabolisme Ca dan P (HW Wang et al., 2020). Nefrotoksisitas yang diinduksi F terkait denganginjalpenyelewengan fungsi. Kapanginjalfungsi memburuk, ekskresi F dalam tubuh berkurang, menyebabkan akumulasi fluor yang berlebihan diginjaldan memperparah toksisitas F (Kido et al., 2017). Ketikaginjalmengalami gangguan berat,
ekskresi F dalam urin menurun, dan konsentrasi serum F semakin meningkat (Dharmaratne, 2019). Dalam penelitian ini, kami mengamati bahwa kadar BUN dan serum CRE, UA, P, K pada tikus yang diobati dengan 100 mg/L NaF meningkat secara signifikan, menunjukkan bahwa paparan F tinggi menyebabkan perubahanginjalindikator biokimia pada tikus dan menyebabkanginjalketidakcukupan. Selanjutnya, kami juga menunjukkan bahwa berbagai indikator dariginjalcenderung normal setelahKalsiumsuplementasi. Ini menunjukkan bahwa Ca (terutama 1 persenKalsium) memiliki efek pengurangan yang signifikan pada F-inducedginjalkerusakan pada tikus.
Bentengdapat membantu denganginjalkerusakan.
Apoptosisadalah kematian sel yang otonom dan teratur yang dikendalikan oleh gen, yang ditandai dengan degradasi DNA tanpa lisis sel yang jelas. Studi ini mengamati bahwa fluorosis menyebabkanginjalselapoptosispada tikus. FAS memainkan peran utama dalam terjadinyaapoptosisdan berbagai penyakit. Literatur terbaru mengungkapkan bahwa FAS menengahiapoptosisdalamginjaldiinduksi oleh iskemia-reperfusi dan leukosit manusiaapoptosisdiinduksi oleh N-nitrosodimethylamine (Iwaniuk et al., 2019; Xu
dkk., 2019). Ketika FAS dan FAS-L bergabung untuk membentuk trimer, sinyal pro-apoptosis dipicu. Sebuah studi baru-baru ini menunjukkan bahwa F menginduksi selapoptosismelalui jalur FAS/FAS-L (Xu et al., 2011). Dalam penelitian ini, F secara signifikan meningkatkan ekspresi mRNA dan protein FAS dan FAS-L dalamginjal. Up-regulasi tingkat FAS dan FAS-L menunjukkan bahwa jalur apoptosis terkait FAS / FAS-L mungkin terlibat dalam F-inducedapoptosis. Perekrutan trimer FADD FAS/FAS-L mengarah pada pembelahan Pro-Caspase 8 untuk menghasilkan Caspase 8 aktif, yang pada gilirannya mengaktifkan Caspase 3 dan kemudian mengarah keapoptosis(Li et al., 2011; Xu et al., 2011). Studi ini memverifikasi bahwa 100 mg/L NaF diinduksiapoptosisdi tikusginjalmelalui jalur FAS/FAS-L. Hasil yang paling penting adalah bahwa suplementasi Ca diet melemahkanapoptosis-menginduksi efek F, yang dikaitkan dengan down-regulasi aktivasi FAS/FAS-L dan aktivasi sekunder Caspases.
TNF adalah sitokin pleiotropik yang berpartisipasi dalam berbagai respons seluler, termasuk diferensiasi, proliferasi, peradangan, dan kematian sel. Sinyal TNF memicu keduanyaapoptosisdan jalur anti-apoptosis. Banyak jenis literatur telah melaporkan bahwa TNF mendominasi lipopolisakarida yang diinduksiginjalkerusakan dan akut yang diinduksi cisplatinginjalcedera (Lee et al., 2016; Li et al., 2018). TNF mengikat TNF-R1, DD-nya merekrut TRADD, dan kemudian TRADD berinteraksi dengan FADD, yang mengarah pada pembentukan DISC (Kiraz et al., 2016; Sun et al., 2003). Studi telah mengungkapkan bahwa F dapat menginduksi hati, neuron, danginjalleukositapoptosismelalui jalur pensinyalan TNF (Lu et al., 2017; Singh et al., 2017; Yan et al., 2016). Serupa dengan hasil laporan ini, ekspresi relatif TNF, TNF-R1, TNF-R2, dan TRADD pada kelompok F meningkat secara signifikan dalam percobaan ini. Sebaliknya, ekspresi gen-gen ini menurun secara signifikan setelah 1 persenKalsiumsuplemen, menyarankan intervensi dariKalsiumdalam jalur TNF.
TRAIL terlibat dalam regulasiapoptosis, proliferasi, respon imun-inflamasi, dll. Saat ini, diyakini bahwa TRAIL terkait erat dengan kejadian dan prognosisginjalpenyakit (Candido, 2014). Semakin banyak literatur telah mengkonfirmasi bahwa TRAIL mengaturapoptosisdariginjalsel epitel tubulus pada glomerulonefritis terkait HBV danginjalapoptosisterkait Uromodulinginjalpenyakit (Johnson et al., 2017; Yang et al., 2018). Lebih lanjut, sebuah penelitian melaporkan bahwa ekspresi TRAIL umumnya diubah selama homeostasis dan berbagaiginjalcedera (Devarapu et al., 2017). TRAIL menempel pada reseptor kematian DR5 dan merekrut FADD melalui interaksi DD, dan kemudian berikatan dengan pro-Caspase 8 melalui domain efek kematian yang ada di FADD untuk membentuk DISC (Yuan et al., 2018). Penelitian ini menunjukkan bahwa ekspresi TRAIL dan DR5 meningkat secara signifikan pada kelompok F. Setelah melengkapi denganKalsium, ekspresi TRAIL dan DR5 dihambat. Disarankan bahwaKalsiummenghambat jalur TRAIL untuk mengurangi F-inducedapoptosis.
Kesimpulan
100 mg/L paparan NaF diaktifkan reseptor kematian yang dimediasiapoptosisjalur (FAS/FASL, TNFR/TNF, jalur DR5/TRAIL) dan kemudian diinduksiginjalselapoptosispada tikus, menyebabkanginjalgangguan metabolisme danginjalketidakcukupan, mengakibatkanginjalsel-sel menjadi atrofi dan cacat,ginjalrongga kapsul melebar,ginjaltubulus membentuk gips. Namun, penambahan 1 persenKalsiumuntuk diet menurunkan kandungan fluoride darah, lebih lanjut mengurangiginjalgangguan metabolisme danginjalinsufisiensi melalui jalur yang dimediasi reseptor kematian, dan secara signifikan mengurangiginjalcedera (komponen Gambar 6).
Referensi
Sumbernya oleh Haojie Li, Sekolah Tinggi Kedokteran Hewan, Universitas Pertanian Shanxi, Taigu 030801, Shanxi, PR China dan lain-lain.
