Strain Probiotik yang Viable dan Heat-Killed Meningkatkan Imunitas Mulut dengan Meningkatkan Konsentrasi IgA di Mukosa Mulut

Abstrak

Imunitas mukosa mulut-hidung berperan penting dalam melindungi tubuh terhadap invasi bakteri dan virus. Produk probiotik yang aman telah digunakan untuk meningkatkan kekebalan manusia dan kesehatan mulut. Dalam penelitian ini, kami memverifikasi efek menguntungkan dari tablet probiotik campuran, yang terdiri dari Lactobacillus salivarius subsp. salicinius AP-32, Bifdobacterium animalis subsp. lactis CP-9, dan Lactobacillus paracasei ET-66, dan tablet probiotik yang dimatikan dengan panas, terdiri dari L. salivarius subsp. salicinius AP-32 dan L. paracasei ET-66, tentang imunitas mulut di antara 45 peserta sehat. Peserta secara acak dibagi menjadi kelompok probiotik yang layak, probiotik yang dimatikan dengan panas, dan kelompok plasebo. Pemberian pengobatan berlangsung selama 4 minggu. Sampel air liur dikumpulkan pada Minggu 0, 2, 4, dan 6, dan populasi Lactobacillus, Bifidobacterium, dan Streptococcus mutans serta konsentrasi IgA diukur. Konsentrasi IgA dan kadar TGF-beta dan IL-10 dalam sel PBMC diukur dengan metode ELISA. Hasil menunjukkan bahwa kadar IgA dalam air liur meningkat secara signifikan pada pemberian kedua obat yang layak (119,30±12,63%, ***P<0.001) and heat-killed (116.78±12.28%, ***P<0.001) probiotics for 4 weeks. Among three probiotic strains, AP-32 would effectively increase the levels of TGF-beta and IL-10 in PBMCs. The oral pathogen Streptococcus mutans was significantly reduced on viable probiotic tablet administration (49.60±31.01%, ***P<0.001). The in vitro antibacterial test confirmed that viable probiotics effectively limited the survival rate of oral pathogens. Thus, this clinical pilot study demonstrated that oral probiotic tablets both in viable form or heat-killed form could exert beneficial effects on oral immunity via IL-10, TGB-beta mediated IgA secretion. The effective dosage of viable probiotic content in the oral tablet was 109 CFUs/g and the heat-killed oral tablet was 1× 1010 cells/g.

manfaat suplemen cistanche-meningkatkan kekebalan tubuh

Perkenalan

Mukosa mulut-hidung, pintu gerbang kontak dengan antigen yang dihirup, adalah garis depan pertahanan sistem kekebalan tubuh manusia [1, 2]. Biasanya, virus atau bakteri patogen menyerang permukaan mukosa rongga mulut-hidung dengan melawan sistem kekebalan lokal dan mikrobiota yang sehat [3]. Peradangan dan gejala, termasuk batuk, sakit tenggorokan, pilek, dan demam, berkembang karena respon imun terhadap virus dan bakteri patogen invasif [4]. Selain itu, imunoglobulin A (IgA) adalah faktor imun utama dalam air liur dan mengatur homeostasis mikrobiota mulut [5]. Beberapa penelitian telah melaporkan kemampuan IgA sekretorik untuk melindungi tubuh dari infeksi virus patogen, termasuk virus pernapasan syncytial [6], rotavirus [7], dan virus influenza [7]. IgA sekretorik berfungsi melindungi epitel mukosa. Nicolas Millet dkk. menemukan bahwa IgA mukosa dapat mencegah dysbiosis Candida albicans komensal di rongga mulut [8]. Ini juga mencegah agregasi patogen mulut Streptococcus mutans, yang menyebabkan plak gigi [9].

Selain itu, para peneliti menemukan bahwa mikrobiota mulut dan metabolitnya secara lokal dapat mempengaruhi kekebalan pada penghalang mulut [10]. Penelitian sebelumnya menunjukkan efektivitas probiotik dalam meningkatkan konsentrasi IgA di mukosa mulut [11]. Ericson dkk. menunjukkan bahwa mengunyah permen karet yang mengandung Lactobacillus reuteri berpartisipasi dalam respon imun adaptif pada subyek sehat dengan meningkatkan kadar IgA liur [12]. Pada manusia, sitokin imun TGF-beta dan IL-10 berkorelasi dengan produksi IgA [13].

Namun, apakah mikrobiota oral meningkatkan kadar IgA sekretori melalui sitokin TGF-beta dan IL-10 masih belum jelas. Selanjutnya, patogen mulut termasuk S. mutans, P. gingivalis, dan F. nucleatum subsp. polimorfisme dan A. actinomycetemcomitans menunjukkan korelasi yang tinggi dengan penyakit periodontal dan bau mulut [14]. Produk probiotik bisa menjadi terapi alternatif potensial terhadap periodontitis dengan menghambat patogen mulut Fusobacterium nucleatum, namun Porphyromonas gingivalis dan Aggregatibacter actinomycetemcomitans tidak menunjukkan penurunan yang signifikan [15]. Suplementasi probiotik juga dapat mencegah infeksi patogen [16]. Telah dilaporkan bahwa spesies kunci mikrobiota membatasi pertumbuhan patogen Streptococcus pneumonia [17]. Oleh karena itu, menjaga keseimbangan ekosistem mikroba melalui penggunaan strain probiotik dapat menjadi cara alternatif untuk mengatur kekebalan mulut dan meningkatkan kesehatan mulut. Temuan sebelumnya mengenai penghambatan patogen mulut oleh strain probiotik telah mengungkapkan bahwa Lactobacillus liurarius subsp. salicinius AP-32, Bifdobacterium animalis subsp. lactis CP-9, dan Lactobacillus paracasei ET-66 memberikan efek antibakteri yang sangat baik secara in vitro; Namun, bukan karena mekanisme peningkatan kadar H2O2 [18]. Strategi utama strain probiotik untuk membatasi pertumbuhan patogen oral adalah dengan menggabungkan patogen secara oral, memproduksi biosurfaktan, mengubah lingkungan mulut, dan menghasilkan zat antimikroba [19]. Selain itu, penelitian in vitro menunjukkan bahwa L. salicinius AP-32 memediasi ekspresi sitokin inflamasi [interleukin (IL)-8, IL-10] dalam sel epitel manusia [20]. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami memverifikasi apakah tablet probiotik campuran yang layak, terdiri dari L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. lactis CP-9, dan L. paracasei ET-66, dan tablet probiotik yang dimatikan dengan panas, terdiri dari L. salivarius subsp. Salicinius AP-32 dan L. paracasei ET-66, meningkatkan fungsi kekebalan tubuh melalui TGF-beta, IL-10 atau meningkatkan tingkat konsentrasi IgA liur. Fungsi anti-bakteri dari penyerapan produk probiotik di rongga mulut telah diuji.

manfaat suplemen cistanche-cara memperkuat sistem kekebalan tubuh

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Meningkatkan Imunitas

【Minta lebih lanjut】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikasi WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Bahan dan metode

Peserta

Secara total, 45 peserta sehat berusia 20–40 tahun direkrut dan dibagi secara acak menjadi tiga subkelompok: tablet oral probiotik yang layak, tablet oral probiotik yang dimatikan dengan panas, dan kelompok plasebo. Setiap kelompok terdiri dari 15 peserta. Peserta yang memiliki kebiasaan merokok dan makan sirih pinang tidak dimasukkan dalam penelitian ini. Tablet oral diberikan secara membabi buta kepada para peserta. Semua peserta meminum tablet oral tiga kali sehari (pagi, siang, dan malam) selama 4 minggu. Sampel air liur (2 mL) dikumpulkan untuk mengukur konsentrasi IgA dan populasi mikroorganisme pada Minggu 0, 2, 4, dan 6. Informed consent diperoleh dari semua peserta yang termasuk dalam penelitian ini. Protokol ini disetujui oleh Institutional Review Board Universitas Kedokteran Chung Shan, Taiwan (CS19052).

Tablet Oral Probiotik yang Layak

Tablet oral probiotik yang layak (1 g) mengandung tiga strain probiotik yang layak, L. liurarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. laktis CP-9, dan L. paracasei ET-66. Kami mencampurkan 0.01 g dari 1011 unit pembentukan koloni (CFU) probiotik tunggal ke dalam tablet oral. Setiap strain probiotik diukur sekitar 0,33 * 109CFUs/g. Total kandungan probiotik dalam tablet oral adalah 109 koloni CFUs/g. Dosis aktif tablet oral probiotik mengikuti penelitian yang diterbitkan sebelumnya [18]. Semua strain probiotik diperoleh dari laboratorium Biofag Biotech Co., Ltd. (Tainan, Taiwan). L.salivarius subsp. salicinius AP-32 diisolasi dari usus manusia yang sehat dan disimpan di Institut Penelitian dan Pengembangan Industri Makanan, Taiwan (ID: BCRC 910437) dan di Universitas Wuhan, Tiongkok (ID: CCTCC-M2011127); B. animalis subsp. CP laktat-9 diisolasi dari ASI manusia yang sehat dan disimpan di Institut Penelitian dan Pengembangan Industri Makanan, Taiwan (ID: BCRC 910645) dan di Universitas Wuhan (ID: CCTCC-M2014588); L. paracasei ET-66 diisolasi dari ASI manusia yang sehat dan disimpan di Institut Penelitian dan Pengembangan Industri Makanan, Taiwan (ID: BCRC 910753) dan di Pusat Pengumpulan Budaya Mikrobiologi Umum Tiongkok, Beijing, Tiongkok (ID: CGMCC{ {22}}). Lactobacillus. air liur subsp. salicinius AP-32 dan L. paracasei ET-66 dikultur pada pelat agar de Man, Rogosa, dan Sharpe (MRS) (110.660, Merck, Darmstadt, Jerman) dan diinkubasi dalam kondisi anaerobik fakultatif pada suhu 37 derajat selama 48 jam. B. animalis subsp. Lactis CP-9 dikultur pada agar MRS yang dilengkapi dengan sistein 0,05% dan diinkubasi secara anaerob pada suhu 37 derajat selama 48 jam. Penghitungan koloni dilakukan untuk mengukur CFU bakteri setelah membiakkan strain probiotik [18].

tanaman cistanche meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Tablet Oral Probiotik yang dapat dibunuh dengan panas

Tablet oral probiotik yang dimatikan dengan panas (1 g) terdiri dari L. salivarius subsp. salicinius AP-32 dan L. paracasei ET-66. Strain yang hidup dikultur dan diinkubasi, seperti yang dijelaskan sebelumnya. Kemudian, AP-32 dan ET-66 diinaktivasi dengan menginkubasi strain yang hidup dalam media MRS pada suhu 100 derajat selama 1 jam. Kandungan probiotik dalam tablet oral adalah 1× 1010 sel/g. Dosis aktif tablet oral probiotik yang dimatikan dengan panas mengikuti pengujian in vitro yang dipublikasikan sebelumnya [11]. Semua prosedur eksperimental dilakukan di laboratorium Biofag Biotech Co., Ltd. (Tainan, Taiwan).

Pengukuran Populasi Lactobacillus dan Bifidobacterium dalam Sampel Air Liur

Sampel air liur (2 mL) dikumpulkan dari masing-masing peserta pada Minggu 0, 2, 4, dan 6. Sampel air liur (100 µL) diencerkan secara serial dan ditambahkan ke MRS piring. Untuk mengukur populasi Lactobacillus, Lactobacillus dikultur dan diinkubasi pada pelat agar MRS dalam kondisi anaerobik fakultatif pada suhu 37 derajat selama 48 jam. Untuk mengukur populasi Bifdobacterium, Bifdobacterium dikultur dan diinkubasi secara anaerobik pada agar MRS yang dilengkapi dengan sistein 00,05% pada suhu 37 derajat selama 48 jam. Penghitungan koloni dilakukan untuk mengukur CFU bakteri setelah membiakkan strain probiotik. Tingkat populasi Lactobacillus dan Bifidobacterium dinormalisasi ke jumlah populasi probiotik pada Minggu 0. Tingkat populasi Lactobacillus dan Bifidobacterium yang dikumpulkan pada Minggu 0 dianggap 100%. Metode eksperimental mengikuti karya yang diterbitkan sebelumnya [18].

Pengukuran Konsentrasi IgA pada Mukosa Mulut

Sampel air liur (2 mL) dikumpulkan dari masing-masing peserta pada Minggu 0, 2, 4, dan 6 dan dipertahankan pada suhu 20 derajat. Kit ELISA Manusia Tanpa Lapisan IgA (Katalog # 88-50600-88; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) digunakan untuk menganalisis konsentrasi IgA. Pertama, kami melapisi antibodi IgA anti-manusia pada 96-well plate. IgA liur yang terdapat dalam sampel atau standar ditambahkan ke dalam microwell, dan kemudian antibodi IgA anti-manusia terkonjugasi HRP ditambahkan pada suhu kamar selama 1 jam. Memipet Substrat TMB ke setiap sumur selama 30 menit. Akhirnya, konsersi IgA diukur pada spektrofotometer pada 450 nm. Semua prosedur eksperimental dilakukan rangkap tiga, sesuai dengan instruksi pabrik. Tingkat konsentrasi IgA yang dikumpulkan pada Minggu 0 dianggap 100%. Metode eksperimental mengikuti karya yang diterbitkan sebelumnya [18].

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Pengukuran Konsentrasi TGF‑Beta dan IL‑10 di PBMC

Pengujian peningkatan kadar TGF-beta dan IL-10 yang diinduksi probiotik mengikuti penelitian sebelumnya [20]. Sel mononuklear darah tepi (PBMC) diperoleh dari sampel darah donor sehat (Tainan Blood Center, Taiwan Blood Services Foundation). Mensentrifugasi seluruh darah melalui gradien Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Swedia), dan fraksi kepadatan cahaya dari antarmuka 42,5%-50% dielusi. Penyemaian 4 * 10 sel sel PBMC yang diekstraksi dalam 100 μl RPMI-1640 dengan 1% FBS (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) ke setiap sumur dari 96 pelat sumur. Kemudian menambahkan 5 * 105 cfu/20 µl perlakuan probiotik ke setiap sumur PBMC yang diunggulkan (sel: strain probiotik=1:10). Kontrol positif menambahkan 10 µg/ml Phytohaemagglutinin (PHA) (Sigma-Aldrich, Munich, Jerman) ke dalam sumur yang diunggulkan PBMC untuk masing-masing produksi TGF-, IL-10 [21]. Kultur bersama probiotik dengan PBMC selama 48 jam. Mengukur supernatan yang mengandung sitokin IL-10 dan TGF- dengan analisis enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) (Thermo Scientific, Carlsbad, CA, USA). Semua percobaan diukur dan mengikuti protokol komersial setidaknya dalam rangkap tiga.

Evaluasi Fungsi Antibakteri pada Rongga Mulut

Streptococcus mutans merupakan ancaman kesehatan mulut yang umum, yang menyebabkan karies gigi dengan membentuk wabah atau biofilm [22]. Sampel Streptococcus mutans dikumpulkan dari penyeka, dimana kami mengumpulkan S. mutans pada bagian supragingiva, gingiva, dan mukosa mulut, pada Minggu 0, 2, 4, dan 6. S. mutans dipertahankan dalam tryptic kaldu kedelai (TSB, 5 mL) ditambah dengan 50% gliserol. Media S. mutans diencerkan secara serial dan ditambahkan ke pelat Mitis Salivarius-Bacitracin Agar (MSBA, 0.2 U/mL), yang diinkubasi pada suhu 37 derajat selama 2 hari. Terakhir, jumlah koloni S. mutans di setiap sampel peserta dihitung untuk menghitung tingkat kelangsungan hidup patogen; tingkat kelangsungan hidup S.mutans yang dikumpulkan pada Minggu 0 dianggap 100%. Metode eksperimental mengikuti karya yang diterbitkan sebelumnya [18].

Aktivitas Antibakteri In Vitro dari Tablet Oral

Oral tablets (1 g) that contained viable (AP-32, CP-9, and ET-66; > 109 CFUs) and heat-killed (AP-32 and ET-66,>1010 CFU) strain probiotik masing-masing dilarutkan dalam media infus TSB dan jantung otak, untuk mendapatkan konsentrasi akhir 0,1 g/mL. Hanya media yang digunakan untuk kelompok kosong, sedangkan tablet (1 g) tanpa komponen probiotik apa pun dilarutkan dalam media masing-masing untuk kelompok plasebo. Kemudian, patogen oral (106 CFU) dimasukkan ke dalam larutan tablet dan diinkubasi bersama pada suhu 37 derajat untuk 2 (S. mutans) atau 3 (Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum, dan Aggregatibacter actinomy cetemcomitans) d. Patogen diperoleh dari BCRC. Tingkat penghambatan patogen oral (%) dihitung sebagai berikut: (kontrol CFUblank – kelompok eksperimen CFU)/kontrol CFUblank. Metode eksperimental mengikuti pengujian yang dipublikasikan sebelumnya [11].

Analisis statistik

Perangkat lunak GraphPad Prism digunakan untuk analisis statistik hasil uji t dua sisi. Data disajikan sebagai mean standar deviasi (SD) atau mean dari hasil dua atau tiga percobaan independen. Perbedaan statistik dianggap signifikan pada nilai P<0.05.

Hasil

Tablet Probiotik Meningkatkan Populasi Bifidobacterium di Rongga Mulut

Populasi Bifidobacterium meningkat secara stabil di rongga mulut setelah pemberian tablet probiotik. Populasi bakteri setelah perlakuan dinormalisasi dengan populasi bakteri sebelum perlakuan (Tingkat populasi %=CFU pasca-perawatan/CFU pra-perawatan). Pada kelompok probiotik yang layak, tingkat populasi meningkat secara signifikan menjadi 244,14±164,96% pada Minggu ke-2 (**P<0.01, Fig. 1a) and 438.41±308.58 at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population rate remained high at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 550.16±448.19%, ***P<0.001), compared to Week 0. The Bifidobacterium population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (**P<0.01). In the heat-killed probiotic group, the Bifidobacterium population was increased at Weeks 2 (149.92±60.47%, **P<0.01) and 4 (199.87±148.64%, *P<0.05), but was decreased at Week 6 after administration of the heat-killed probiotic tablets was stopped for 2 weeks (182.98±163.73%, Fig. 1a).

Tablet Probiotik Meningkatkan Populasi Lactobacillus di Rongga Mulut

Perubahan populasi Lactobacillus oral akibat pemberian tablet probiotik menunjukkan pola yang serupa dengan perubahan populasi Bifidobacterium oral. Populasi bakteri setelah perlakuan dinormalisasi dengan populasi bakteri sebelum perlakuan. Pada kelompok probiotik yang layak, tingkat populasi Lactobacillus meningkat secara signifikan menjadi 447,74±337,89% pada Minggu ke-2 (**P<0.01, Fig. 1b) and 982.27±726.66% at Week 4 (***P<0.001), compared to Week 0. The Lactobacillus population rate was higher at Week 6 (no administration of viable probiotic tablets for 2 weeks after Week 4, 727.57±539.76%, ***P<0.001) than at Week 0. The Lactobacillus population number was significantly different between the viable probiotic and placebo groups at Week 6 (***P<0.001). In the heat-killed probiotic group, the Lactobacillus population was increased at Weeks 2 (256.66±183.78%, **P<0.01) and 4 (312.85 ± 279.71%, *P < 0.05). Additionally, the Lactobacillus number remained but showed no significant difference at Week 6 after the administration of heat-killed probiotics was stopped for 2 weeks (208.00±199.50%, Fig. 1b).

Gambar 1 a Pengukuran populasi Bifidobacterium pada permukaan mukosa mulut. V tablet probiotik yang layak; H tablet probiotik mati yang dimatikan dengan panas; C tablet plasebo (kontrol); dan bakteri asam laktat BAL. Pengumpulan dan analisis sampel liur pada Minggu 0, 2, 4, dan 6 dilakukan. Data disajikan sebagai mean standar deviasi (SD). Uji-t dua sisi digunakan untuk menganalisis perbedaan statistik. Signifikansi statistik ditandai dengan *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. b Measurement of Lactobacillus populations on the oral mucosal surfaces. V viable probiotic tablets; H heat-killed inactivated probiotic tablets; C placebo tablets (control); and LAB lactic acid bacteria. Collection and analysis of salivary samples at Weeks 0, 2, 4, and 6 were performed. Data were presented as the mean standard deviation (SD). A two-tailed t-test was used to analyze statistical differences. Statistical significances were marked with *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Tablet Probiotik yang Mengandung AP‑32, ET‑66, dan CP‑9 secara signifikan meningkatkan Konsentrasi IgA pada Mukosa Mulut

Karena konsumsi tablet probiotik (viable atau heat-killed) telah terbukti meningkatkan kadar Bifidobacterium dan Lactobacillus di rongga mulut, kami menganalisis lebih lanjut perubahan konsentrasi IgA di air liur, yang terjadi karena penggunaan produk probiotik. Kadar IgA setelah pengobatan dinormalisasi dengan kadar IgA sebelum perlakuan. Pada kelompok probiotik yang layak, konsentrasi IgA dalam air liur sedikit meningkat menjadi 103,24 ± 8,10% pada Minggu ke-2 (Gambar 2) dan 104,81 ± 13,26 pada Minggu ke-4, namun tanpa perbedaan yang signifikan secara statistik. Namun, konsentrasi IgA liur pada kelompok probiotik yang layak, dibandingkan dengan kelompok plasebo, meningkat secara signifikan menjadi 119,30 ± 12,63% pada Minggu ke-6 (tidak ada pemberian tablet probiotik yang layak selama 2 minggu setelah Minggu ke-4), dibandingkan dengan Minggu ke-0 ( ***P<0.001). Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the salivary IgA concentration was slightly increased at Weeks 2 (102.51± 7.20%) and 4 (104.35 ± 10.27%). The saliva IgA concentration was increased at Week 6 (116.78 ± 12.28%, ***P < 0.001, Fig. 2), compared to Week 0.

Strain yang Layak Meningkatkan Tingkat IL‑10 dan TGF‑Beta di PBMC

Kontrol positif 10 µg/ml Phytohaemagglutinin (PHA) berhasil meningkatkan kadar IL-10 (58,2 ± 7,9 pg/ml, ***P <0,001, Gambar 3a) dan TGF- (53,4±8 pg/ml, ***P<0.001, Fig. 3b) in PBMCs by comparing to the negative control (PBMCs treated with medium only). Viable strains of CP-9, AP-32 and ET-66 signifcantly increased the levels of IL-10 in PBMCs to 84.2±9 pg/ml (***P<0.001, ##P<0.01), 303.1±170.9 pg/ml (*P<0.05, ##P<0.01) and 98.2±17.5 pg/ml (***P<0.01, ##P<0.01), respectively. Symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated a significant difference by comparing to the PHA control (Fig. 3a). Besides, viable strains of CP-9, AP-32, and ET-66 significantly increased the levels of TGF-beta in PBMCs to 23.2 ± 4.7 pg/ml (***P < 0.001), 130.9 ± 16 pg/ ml (***P < 0.001, ###P < 0.001) and 31.4 ± 5.5 pg/ml (***P<0.01), respectively (Fig. 3b).

Gambar 2 Konsentrasi imunoglobulin A (IgA) dalam sampel air liur. V tablet probiotik yang layak; H tablet probiotik mati yang dimatikan dengan panas; C tablet plasebo (kontrol); dan bakteri asam laktat BAL. Pengumpulan dan analisis sampel liur pada Minggu 0, 2, 4, dan 6 dilakukan. Data disajikan sebagai mean standar deviasi (SD). Uji-t dua sisi digunakan untuk menganalisis perbedaan statistik. Statistik

Tablet Probiotik yang Mengandung AP‑32, ET‑66, dan CP‑9 Melarang Populasi S.mutans di Air Liur

Peningkatan populasi Bifidobacterium dan Lactobacillus serta peningkatan konsentrasi IgA dalam air liur mungkin berkontribusi dalam melawan mikroorganisme patogen mulut. Pada percobaan berikutnya, kami menguji perubahan populasi patogen mulut S. mutans akibat intervensi probiotik. Populasi bakteri setelah perlakuan dinormalisasi dengan populasi bakteri sebelum perlakuan. Pada kelompok probiotik yang layak, populasi S.mutans berkurang secara signifikan pada Minggu ke-2 (53,55±31,60%, ***P<0.001), 4 (49.60±31.01%, ***P<0.001), and 6 (55.19±42.72%, **P<0.01, Fig. 4). At week 6, S. mutans was significantly inhibited in the viable probiotic group (55.19±42.72%, ***P<0.001), compared to in the placebo group. Furthermore, in the heat-killed probiotic group, the S. mutans population was slightly decreased at Week 2 (85.81±49.87%) and significantly reduced at Week 4 (58.35 ± 33.17%, ***P<0.001). The S. mutans population level in the heat-killed probiotic group (202.81±167.99%) reverted to that in the placebo group (225.05±127.01%) at Week 6 (no administration of heat-killed probiotic tablets for 2 weeks from Week 4) (Fig. 4).

Gambar 3 Strain yang layak meningkatkan level IL-10, dan TGF-beta, di PBMC. Tingkat IL-10 dan b TGF-beta dalam PBMC diuji dengan mengobati strain probiotik. Menambahkan 5 * 105 cfu/20 µl strain CP-9, AP-32, dan ET-66 yang layak ke PMBC 10 µg/ml. Phytohaemagglutinin (PHA) digunakan sebagai kontrol positif. Kontrol negatifnya adalah PBMC yang diberi perlakuan dengan media RMPI-1640 saja. Tes rangkap tiga dilakukan. Data disajikan sebagai mean standar deviasi (SD). Uji-t dua sisi digunakan untuk menganalisis perbedaan statistik. Signifikansi statistik ditandai dengan P<0.05, P<0.01, P<0.001. The symbol *indicated a significant difference by comparing to the medium-treated control; symbol #indicated significant difference by comparing to the PHA control

Gambar 4 Pengukuran populasi Streptococcus mutans patogen pada permukaan mukosa mulut. V tablet probiotik yang layak; H tablet probiotik mati yang dimatikan dengan panas; C tablet plasebo (kontrol); dan bakteri asam laktat BAL. Pengumpulan dan analisis sampel liur pada Minggu 0, 2, 4, dan 6 dilakukan. Data disajikan sebagai mean standar deviasi (SD). Uji-t dua sisi digunakan untuk menganalisis perbedaan statistik. Signifikansi statistik ditandai dengan *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Konfirmasi Kemampuan Tablet Probiotik Menghambat Pertumbuhan Patogen Oral dengan Uji In Vitro

Penelitian in vitro mengungkapkan bahwa tablet probiotik yang hidup secara signifikan menghambat tingkat kelangsungan hidup patogen mulut (Gambar 5a). Populasi bakteri setelah perlakuan dinormalisasi dengan populasi bakteri sebelum perlakuan. Tingkat kelangsungan hidup S. mutans, P. gingivalis, F. nucleatum, dan A. actinomy cetemcomitans pada kelompok probiotik yang layak, dibandingkan dengan kelompok plasebo, menurun menjadi 4,23% (***P < 0 .001, plasebo=91%), 8,64% (***P < 0,001, plasebo=89%), 5,77% (**P<0.01, placebo=98%), and 6.23% (**P<0.01, placebo=87%), respectively. However, the heat-killed probiotic tablet exerted weaker antibacterial effects than the viable probiotic tablet (Fig. 5b). The survival rate of S. mutans, P. gingivalis, F. nucleatum, and A. antinomy cetemcomitans in the heat-killed probiotic group, compared to in the placebo group, was slightly decreased without statistical significance (82%, placebo=91%), significantly reduced to 53% (*P<0.05, placebo=89%), not inhibited (96.88%, placebo=98%), and significantly reduced to 80% (**P<0.01, placebo=87%), respectively.

Diskusi

Dibandingkan dengan kelompok plasebo, populasi oral Lactobacillus dan Bifidobacterium akan meningkat secara signifikan dengan pemberian tablet probiotik yang layak atau tablet probiotik yang dimatikan dengan panas selama 4 minggu. Selain itu, jumlah Lactobacillus dan Bifidobacterium tetap pada tingkat yang sangat tinggi selama 2 minggu setelah penghentian konsumsi konsumsi probiotik yang layak (Gambar 1a dan b). Senada dengan Camila Casuccio Almeida dkk. menunjukkan bahwa pemberian pengobatan probiotik selama empat minggu dapat memperbaiki gejala pada pasien intoleransi laktosa selama minimal 3 bulan setelah menghentikan konsumsi probiotik [23]. Namun, efek probiotik yang bertahan dalam pengobatan jangka panjang harus dievaluasi di masa depan. Selain itu, konsentrasi IgA dalam air liur meningkat secara signifikan pada pemberian tablet probiotik yang hidup dan dimatikan dengan panas. Baik kelompok probiotik yang dibunuh dengan panas maupun kelompok probiotik yang hidup meningkatkan IgA liur dengan pemberian tablet oral selama 4 minggu, namun tidak menunjukkan perbedaan statistik dibandingkan dengan plasebo. Konsentrasi IgA pada kelompok probiotik yang mati akibat panas dan hidup menunjukkan peningkatan yang signifikan pada Minggu ke-6. Namun, mekanisme peningkatan IgA setelah penghentian pemberian probiotik selama 2 minggu harus diselidiki lebih lanjut (Gbr. 2) Braathen et al. melaporkan hasil serupa pada peran modulasi kekebalan dari strain probiotik di rongga mulut [24]. Selain itu, strain probiotik telah dilaporkan meningkatkan konsentrasi IgA tinja secara signifikan pada babi dan babi [25]. Namun, penelitian mengenai pengurangan gejala IgA pada infeksi saluran napas atas masih belum cukup. Mekanisme molekuler terperinci mengenai penghambatan dan pencegahan infeksi saluran napas atas oleh strain probiotik CP-9, AP-32, dan ET-66 dapat diselidiki dalam penelitian selanjutnya. Dalam penelitian ini, strain CP-9, AP-32, dan ET-66 yang aktif akan meningkatkan tingkat IL-10, dan TFG-beta dalam sel PBMC. AP-32 menunjukkan kemampuan efektif dalam meningkatkan IL-10, dan TFG-beta di PBMC dengan membandingkannya dengan kontrol positif PHA (Gambar 3a dan b). Diperkirakan bahwa strain CP-9, AP-32, dan ET-66 yang aktif mungkin menginduksi sel B yang mensekresi IL-10 dan TFG-beta untuk meningkatkan kadar IgA dalam air liur. Namun, korelasi antara IL-10 air liur, TFG-beta, dan IgA air liur harus diuji lebih lanjut [26]. Selain itu, apakah probiotik yang dimatikan dengan panas meningkatkan IgA melalui penginduksian IL-10 dan TFG-beta masih belum jelas. Uji in vitro menunjukkan bahwa AP-32 yang dimatikan dengan panas meningkatkan sekresi interferon dan IL-12p70 dan menurunkan kadar IL-13 [27]. Oleh karena itu, dalam studi klinis ini, kemampuan probiotik strain CP-9, AP-32, dan ET-66 serta AP-32 dan ET-66 yang dapat membunuh panas strain untuk menghambat bakteri patogen di rongga mulut selanjutnya divalidasi (Gbr. 4). Obat pelega tenggorokan probiotik yang layak menunjukkan kemampuan anti-patogen yang lebih baik daripada obat pelega tenggorokan yang dimatikan dengan panas melalui sekresi asam organik, peptida antimikroba [28], eksopolisakarida (EPS) [29] bakteriosin [30] (Gbr. 5a dan b). Komponen antimikroba fungsional yang dihasilkan oleh strain probiotik yang layak harus dideteksi dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dan kromatografi cair (LC) – spektrometri massa di masa depan [31]. Dilaporkan bahwa probiotik yang dimatikan dengan panas memiliki keunggulan utama dibandingkan probiotik yang dapat hidup tetapi tanpa masalah keamanan tertentu dibandingkan dengan strain probiotik yang dapat hidup [32]. Namun, komponen antimikroba dari probiotik yang dimatikan dengan panas harus diverifikasi lebih lanjut.

Gambar 5 Konfirmasi kemampuan tablet probiotik untuk menghambat pertumbuhan patogen mulut dengan uji in vitro. Kemampuan tablet probiotik yang dapat hidup dan dimatikan dengan panas untuk menghambat tingkat kelangsungan hidup patogen mulut, termasuk Streptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, dan Aggregatibacter actinomycetemcomitans, telah divalidasi. Grup kosong, hanya medium; kelompok plasebo, tablet (1 g) tanpa komponen probiotik. Tes rangkap tiga dilakukan. Data disajikan sebagai mean standar deviasi (SD). Uji-t dua sisi digunakan untuk menganalisis perbedaan statistik. Signifikansi statistik ditandai dengan *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

Kesimpulan

Tablet probiotik campuran yang layak, terdiri dari L. salivarius subsp. salicinius AP-32, B. animalis subsp. CP laktat-9, dan L. paracasei ET-66, dan probiotik yang dimatikan dengan panas, termasuk L. liurarius subsp. salicinius AP-32 dan L. paracasei ET-66, menjalankan fungsinya yang bermanfaat dengan meningkatkan populasi Lactobacillus dan Bifdobacterium di mulut, mengurangi S. mutans di rongga mulut, dan meningkatkan konsentrasi IgA di air liur pada partisipan yang sehat. Hasil uji in vitro memvalidasi bahwa probiotik aktif secara efektif menghambat patogen mulut, termasuk S. mutans, P. gingivalis, dan F. nucleatum subsp. polimorfisme, dan A. actinomycetemcomitans. Imunitas mukosa mulut-hidung merupakan pertahanan garis depan melawan serangan mikroorganisme, dan hal ini telah menjadi masalah yang krusial. Oleh karena itu, penelitian ini akan menawarkan strategi alternatif (suplementasi probiotik) untuk menjaga kekebalan mulut dan kesehatan mulut.

manfaat suplemen cistanche-cara memperkuat sistem kekebalan tubuh

Referensi

1. Takaki H, Ichimiya S, Matsumoto M, Seya T (2018) Respon imun mukosa pada jaringan limfoid terkait hidung setelah pemberian intranasal dengan bahan pembantu. J Imun bawaan 10(5–6):515–521

2. Wu RQ, Zhang DF, Tu E, Chen QM, Chen WJ (2014) Sistem kekebalan mukosa di rongga mulut—sebuah orkestra keanekaragaman sel T. Ilmu Lisan Int J 6(3):125–132

3. Man WH, de Steenhuijsen Piters WAA, Bogaert D (2017) Mikrobiota saluran pernafasan: penjaga gerbang kesehatan pernafasan. Mikrobiol Nat Rev 15(5):259–270

4. Wald ER, Guerra N, Byers C (1991) Infeksi saluran pernafasan bagian atas pada anak kecil: durasi dan frekuensi komplikasi. Pediatri 87(2):129–133

5. Marcotte H, Lavoie MC (1998) Ekologi mikroba mulut dan peran imunoglobulin ludah A. Microbiol Mol Biol Rev 62(1):71–109

6. Weltzin R, Traina-Dorge V, Soike K, Zhang JY, Mack P, Soman G dkk (1996) Antibodi IgA monoklonal intranasal terhadap virus sinkronisasi pernapasan melindungi monyet rhesus dari infeksi saluran pernapasan atas dan bawah. J Menginfeksi Dis 174(2):256–261

7. Ruggeri FM, Johansen K, Basile G, Kraehenbuhl JP, Svensson L (1998) Imunoglobulin A antirotavirus menetralkan virus in vitro setelah transcytosis melalui sel epitel dan melindungi bayi tikus dari diare. J virol 72(4):2708–2714

8. Millet N, Solis NV, Swidergall M (2020) IgA mukosa mencegah disbiosis Candida albicans komensal di rongga mulut. Imunol Depan 11:2448

9. Katz J, Harmon CC, Buckner GP, Richardson GJ, Russell MW, Michalek SM (1993) Respons imunoglobulin A ludah protektif terhadap infeksi Streptococcus mutans setelah imunisasi intranasal dengan antigen S. mutans I/II digabungkan dengan subunit B toksin kolera . Menginfeksi Imun 61(5):1964–1971

10. Moutsopoulos NM, Konkel JE (2018) Imunitas spesifik jaringan pada penghalang mukosa mulut. Tren Imunol 39(4):276–287

11. Lin CW, Chen YT, Ho HH, Hsieh PS, Kuo YW, Lin JH, Liu CR, Huang YF, Chen CW, Hsu CH, Lin WY, Yang SF (2021) Obat pelega tenggorokan dengan strain probiotik meningkatkan respon imun dan kesehatan mulut . Dis Lisan. https://doi.org/10.1111/odi.13854

12. Ericson D, Hamberg K, Bratthall G, Sinkiewicz-Enggren G, Ljunggren L (2013) Respon IgA Saliva terhadap bakteri probiotik dan streptokokus mutans setelah penggunaan permen karet yang mengandung Lactobacillus reuteri. Pathog Dis 68(3):82–87

13. Defrance T, Vanbervliet B, Briere F, Durand I, Rousset F, Banchereau J (1992) Interleukin 10 dan transformasi faktor pertumbuhan beta bekerja sama untuk menginduksi sel B manusia naif anti-CD40-yang diaktifkan untuk mensekresi imunoglobulin A. J Exp Med 175(3):671–682

14. Papone V, Verolo C, Zafaroni L, Batlle A, Capo C, Bueno L et al (2015) Deteksi dan prevalensi patogen periodontal pada populasi Uruguay dengan periodontitis kronis menggunakan metodologi konvensional dan metagenomik. Odontoestomatologia 17(25):23–32

15. Butera A, Gallo S, Maiorani C, Molino D, Chiesa A, Preda C, Scribante A (2021) Alternatif probiotik selain klorheksidin dalam terapi periodontal: evaluasi parameter klinis dan mikrobiologis. Mikroorganisme 9(1):69

16. Wang Y, Li X, Ge T, Xiao Y, Liao Y, Cui Y dkk (2016) Probiotik untuk pencegahan dan pengobatan infeksi saluran pernapasan pada anak-anak: tinjauan sistematis dan meta-analisis dari uji coba terkontrol secara acak. Kedokteran 95(31):e4509. https://doi.org/10.1097/ MD.0000000000004509

17. Laufer AS, Metlay JP, Gent JF, Fennie KP, Kong Y, Pettigrew MM (2011) Komunitas mikroba pada saluran pernapasan bagian atas dan otitis media pada anak-anak. mBio 2(1):e00245-10. https://doi.org/10. 1128/mBio.00245-10

18. Chen YT, Hsieh PS, Ho HH, Hsieh SH, Kuo YW, Yang SF, Lin CW (2020) Aktivitas antibakteri dari strain probiotik yang hidup dan dapat dibunuh dengan panas terhadap patogen mulut. Mari Gunakan Mikrobiol 70(4):310–317

19. Bonifait L, Chandad F, Grenier D (2009) Probiotik untuk kesehatan mulut: mitos atau kenyataan? Asosiasi J Can Dent 75(8):585–90

20. Hsieh PS, An Y, Tsai YC, Chen YC, Chuang CJ, Zeng CT, King AE (2013) Potensi strain probiotik untuk memodulasi respon inflamasi sel epitel dan imun secara in vitro. Mikrobiol Baru 36(2):167–179

21. Elrefaei M, Burke CM, Baker CA, Jones NG, Bousheri S, Bangsberg DR, Cao H (2009) Produksi TGF- dan IL-10 oleh sel T CD spesifik HIV8+ diatur oleh CTLA{ {5}} memberi sinyal pada sel T CD4+. Tolong SATU 4(12):e8194

22. Ranganathan V, Akhila CH (2019) Streptococcus mutans: Apakah ia menjadi penyebab utama manifestasi oral? J Mikrobiol Exp 7(4):207–213

23. Almeida CC, Lorena SLS, Pavan CR, Akasaka HMI, Mesquita MA (2012) Efek menguntungkan dari konsumsi jangka panjang kombinasi probiotik Lactobacillus casei Shirota dan Bifidobacterium breve Yakult dapat bertahan setelah penghentian terapi pada pasien intoleransi laktosa. Praktek Nutr Clin 27(2):247–251

24. Braathen G, Ingildsen V, Twetman S, Ericson D, Jørgensen MR (2017) Kehadiran Lactobacillus reuteri dalam air liur bertepatan dengan lebih tinggi IgA air liur pada orang dewasa muda setelah asupan tablet hisap probiotik. Mikroba Manfaat 8(1):17–22

25. Scharek L, Guth J, Filter M, Schmidt MFG (2007) Dampak bakteri probiotik Enterococcus faecium NCIMB 10415 (SF68) dan Bacillus cereus var. kepada Anda NCIMB 40112 tentang pengembangan serum IgG dan IgA tinja babi babi dan babi. Arch Anim Nutr 61(4):223–234

26. Ebrahimpour-Koujan S, Milajerdi A, Larijani B, Esmaillzadeh A (2020) Efek probiotik pada sitokin dan imunoglobulin ludah: tinjauan sistematis dan meta-analisis pada uji klinis. Perwakilan Sains 10(1):1–11

27. Ou CC, Lin SL, Tsai JJ, Lin MY (2011) Bakteri asam laktat yang dimatikan dengan panas meningkatkan potensi imunomodulator dengan mengarahkan respons imun ke arah polarisasi Th1. J Ilmu Makanan 76(5):M260–M267. https://doi.org/10.1111/j.1750-3841.2011. 02161.x

28. Nair MS, Amalaradjou MA, Venkitanarayanan K (2017) Sifat antivirulensi probiotik dalam memerangi patogenesis mikroba. Aplikasi Advl Mikrobiol 98:1–29

29. Wu MH, Pan TM, Wu YJ, Chang SJ, Chang MS, Hu CY (2010) Aktivitas eksopolisakarida dari bifidobacterium probiotik: Efek imunomodulator (pada makrofag J774A.1) dan sifat antimikroba. Mikrobiol Makanan Int J 144(1):104–110

30. Barefoot SF, Klaenhammer TR (1983) Deteksi dan aktivitas laktasin B, bakteriosin yang diproduksi oleh Lactobacillus acidophilus. Mikrobiol Lingkungan Aplikasi 45(6):1808–1815

31. Kim PI, Sohng JK, Sung C, Joo HS, Kim EM, Yamaguchi T, Kim BG (2010) Karakterisasi dan identifikasi struktur peptida antimikroba, hominin, diproduksi oleh Staphylococcus hominis MBBL 2–9. Biokimia Biophys Res Commun 399(2):133–138

32. Piqué N, Berlanga M, Miñana-Galbis D (2019) Manfaat kesehatan dari probiotik yang dimatikan dengan panas (Tyndallized): gambaran umum. Int J Mol Sci 20(10):2534