Tubuloside B Dari Cistanche Salsa Menyelamatkan Sel Neuronal PC12 Dari 1-Metil-4-phenylpyridinium Ion-Induced Apoptosis Dan Stres Oksidatif

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

Guoqing Zheng, Xiaoping Pu, Li Lei, Pengfei Tu, Changling Li

Abstrak:

pelindung sarafefek tubuloside B dari cistanche, salah satu fenilethanoid yang diisolasi dari Cinajamu Cistanche salsa, pada apoptosis yang diinduksi 1-metil-4-fenilpiridinium (MPP plus ) dan stres oksidatif dalam sel neuron PC12 diselidiki. Sel PC12 yang diobati dengan MPP mengalami kematian apoptosis sebagaimana ditentukan oleh uji MTF, flow cytometry, dan elektroforesis gel agarosa DNA; akumulasi intraseluler spesies oksigen reaktif (ROS) diukur dengan pewarnaan DCFH-DA dengan laser scanning confocal microscopy (LSCM). Pengobatan simultan dengan tuhuloside B sangat melemahkan sitotoksisitas yang diinduksi MPP＋, fragmentasi DNA, dan akumulasi ROS intraseluler. Hasil ini sangat menunjukkan bahwa tubuloside B mencegah apoptosis yang diinduksi MPP dan stres oksidatif. Tubuloside B dapat diterapkan sebagaipenyakit anti-Parkinsonagen.

pengantar

Secara patologis, penyakit Parkinson sporadis (PD) biasanya ditandai dengan hilangnya neuron katekolaminergik, terutama neuron dopaminergik dari substansia nigra pars compacta (SNc), dan adanya karakteristik intraneurona| inklusi yang disebut badan Lewy di daerah otak yang terkena. Meskipun berbagai faktor telah terlibat dalam patogenesis PD, mekanisme yang terlibat dalam inisiasi dan perkembangan PD tetap tidak pasti, Meskipun penyebab PD tetap dijawab, beberapa bukti kuat menunjukkan keterlibatan stres oksidatif, akhirnya mengarah kematian neuronal atau apoptosis oleh generasi radikal bebas yang berlebihan [1], [2], [3]. Fakta bahwa sistem dopaminergik nigral dapat menghasilkan radikal bebas tingkat tinggi dan memiliki tingkat sistem pertahanan antioksidan yang relatif rendah semakin mendukung hipotesis ini. Baik studi in vivo maupun in vitro menunjukkan neurotoksisitas yang dimediasi stres oksidatif dari MPP＋, suatu metabolit aktif dari l-metil-4-fenil-l,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) pada neuron dopaminergik [4 ], [5]. Keterlibatan radikal bebas yang dihasilkan secara berlebihan oleh stres oksidatif sebagai penyebab langsung dari gangguan neurodegeneratif seperti PD menunjukkan peran penting antioksidan. Tubulosida B (Gbr. l) merupakan salah satu senyawa fenilethanoid yang diisolasi dari batangCistanche salsa. Studi sebelumnya telah menemukan banyak phenylethanoids termasuk tubuloside B menunjukkan aktivitas radikal bebas yang kuat scavenging [6], [7].

Mempertimbangkan temuan ini, kami menyelidiki dalam penelitian ini efek tubu]nside B pada neurotoksisitas yang diinduksi MPP plus in vitro, menggunakan garis sel saraf simpatis pheochromocytoma PC12 yang telah berhasil digunakan selama bertahun-tahun untuk mempelajari fungsi saraf [8], [9].

penyakit anti-Parkinson:cistanche

Bahan dan metode

Bahan:

Tubulosida B dariCistanche salsadipasok dengan baik oleh Dr. Li Lei (Departemen Produk Alami, Sekolah Ilmu Farmasi, Universitas Peking, Beijing, Cina). Kemurnian senyawa lebih dari 98 persen dengan analisis HPLC. Medium Eagle (DMEM) Dulbecco yang dimodifikasi, serum kuda, dan serum janin anak sapi dibeli dari GIBCO BRL, 1-metil~-fenilpiridinium ion (MPP plus ), poli-L-lisin, 3-(4, 5 -dimethylthiazol-2 -yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT), propidium iodide (PI), RNase A, proteinase K, dan 2;7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) dibeli dari Sigma.

Budaya sel

Sel PCI2 dipertahankan dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10 persen serum kuda, 5 persen serum janin betis, penisilin 100U/ml dan streptomisin 100ug/ml. Sel-sel dikultur dalam inkubator yang dilembabkan yang diangin-anginkan dengan 95 persen udara dan 5 persen CO2 pada 37 derajat. Semua percobaan dilakukan 24-48 jam setelah sel diunggulkan. Sel-sel dipanen secara rutin dengan tripsinisasi 0,25 persen ketika sel-sel mendekati tahap subkonfluen dan disepuh dalam labu kultur 25 cm yang dibelah pada 1: 8.

Analisis viabilitas sel

Viabilitas sel ditentukan menggunakan uji MTT yang dimodifikasi seperti yang dijelaskan sebelumnya [10], Singkatnya, sel PC12 diunggulkan di 96-pelat sumur dengan kepadatan I × 104 langit-langit per sumur. Kultur ditumbuhkan selama 48 jam, dan kemudian media diubah menjadi media yang mengandung berbagai konsentrasi tubulnside B atau MPP＋. Setelah inkubasi hingga 48 jam dan 72 jam, larutan MTr (5 mg/ml dalam DMEM) ditambahkan ke pelat sumur 96-dan sel dibiarkan diinkubasi selama 4 jam pada suhu 37 derajat . Setelah media dihilangkan, sel dan kristal pewarna dilarutkan dengan menambahkan 200μL DMSO, dan serapannya diukur pada 570nm (540 nm sebagai referensi) dengan model 550 microplate reader (Bio-Rad). Viabilitas sel juga dianalisis menggunakan metode eksklusi trypan blue. Sel-sel dikumpulkan, dibuat pelet dengan lembut, dan diwarnai dengan larutan trypan blue 0,6 persen selama 3 kali hujan. Persentase sel yang tidak berwarna kemudian dinilai dalam sepuluh bidang mikroskop yang dipilih secara acak. Sebagai obat positif, 100 ng／ml faktor pertumbuhan epidermal (EGF) digunakan.

Deteksi apoptosis dengan flow cytometry

Sel-sel apoptosis dideteksi dengan flow cytometry menggunakan propidium iodide (PI) [11]. Secara singkat, sekitar 1 × 106 sel yang diinkubasi dengan zat uji dipanen dengan sentrifugasi dan dicuci sekali dengan PBS. Sel difiksasi dengan etanol 70 persen selama 24 jam pada derajat - 20 dan dicuci sekali dengan PBS. Sel kemudian disuspensikan kembali dalam 300μL PBS yang mengandung 0,5 mg/ml RNase dan 0,5 mg/ml PI. Setelah inkubasi lebih lanjut selama 30 menit dalam gelap, flow cytometry dilakukan dengan FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Jerman).

Kami menerapkan protokol Moore [12] yang hanya mengisolasi DNA yang terfragmentasi dan eksperimen dinormalisasi dengan menggunakan jumlah kultur yang sama dari setiap kelompok uji. Secara singkat, 3 × 106 neuron dari masing-masing sampel yang dirawat dicuci dalam larutan garam seimbang Hank (1000g selama 10 menit), dan pelet yang terbentuk di bagian bawah tabung dihomogenisasi dengan 1 ml buffer lisis (10 mM Tris pada pH 7,4. 5 mM EDTA, 1 persen Triton X-100) selama 20 menit di atas es. Setelah sentrifugasi pada 11,000 g selama 20 hujan pada 4 derajat , supernatan yang mengandung DNA terfragmentasi dikeluarkan dan dicerna dengan 20 mg/ml RNase A pada 37 derajat selama 1 jam, dan 0,1 mg/ml proteinase K pada 56 derajat untuk tambahan 1 jam. DNA yang terfragmentasi diekstraksi menggunakan fenol dan kloroform dan disentrifugasi pada 1O,000g selama 1 hujan pada 4 C. Fase berair dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf baru, dicampur dengan 2 volume etanol dingin, dan kemudian ditempatkan pada-20 derajat selama minimal 1 jam untuk mengendapkan DNA. Setelah sentrifugasi pada 15,000g selama 20 menit pada 4 derajat , supernatan dihilangkan, dan pelet DNA dicuci dengan etanol 80 persen sekali (15.000 g selama 15 menit pada derajat 4 ), dikeringkan dengan udara, dan dilarutkan dalam 20μL TE penyangga pada pH 7,6. Seluruh sampel kemudian dielektroforesis pada gel agarosa 1,5 persen selama 1 jam pada 85 V. Gel diperiksa dan difoto oleh Sistem Dokumentasi Gel Produk Ultra Violet (GELDOC-2000, Bio-Rad, USA).

Pengukuran pembentukan ROS intraseluler

Pembentukan peroksida intraseluler dideteksi dengan mikroskop laser pemindaian confocal menggunakan senyawa non-fluoresen, 2"7"-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) [13], yang diesterifikasi di dalam sel oleh esterase endogen ke asam bebas terionisasi, 2 ;7"-dichlorofluorescein. 2",7-Dichlorofiuorescin mampu dioksidasi menjadi fluorescent 2"7"-dichlorofluorescein (DCF) oleh hidroantioksidan. Sel diinkubasi dengan 10 M DCFH-DA selama 30 menit pada 37 derajat. Kultur dicuci dua kali dengan larutan garam seimbang Hank dan dicitrakan dalam media yang sama. Pencitraan dilakukan menggunakan mikroskop laser pemindaian confocal, DCF tereksitasi pada 488 nm dan filter emisi adalah filter penghalang 510nm. Untuk memberikan perbandingan yang valid, parameter akuisisi yang sama digunakan untuk semua pengamatan. Posisi vertikal optimal di tengah sel ditetapkan, dan kemudian bidang dipindai dengan cepat. Karena iluminasi pada panjang gelombang eksitasi 488 nm menyebabkan peningkatan fluoresensi karena oksidasi zat warna ini, setiap bidang disinari Cahaya untuk waktu yang persis sama. Nilai dasar dari sel yang tidak distimulasi digunakan sebagai nilai kontrol untuk dibandingkan dengan sel yang diobati dengan MPP dengan ada atau tidak adanya tubulosida B. Setelah pemindaian, intensitas fluoresensi relatif rata-rata di 15-20 badan sel saraf per bidang mikroskop dikuantifikasi dalam empat kultur terpisah per kondisi perawatan.

cistanche

Analisis statistik

Semua nilai yang diperoleh dinyatakan sebagai mean ±SD. Signifikansi statistik perbedaan antar kelompok ditentukan dengan uji-t Student; Nilai p terhitung kurang dari 0.05 dianggap signifikan secara statistik.

Hasil

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2, MPP plus menghasilkan penurunan viabilitas sel PCI2 yang bergantung pada dosis. Sebaliknya, EGF, faktor neurotropik yang terkenal, menghasilkan perlindungan yang signifikan terhadap viabilitas sel pada 100ng/mL efek sitotoksik yang diinduksi MPP＋ juga dilemahkan dengan adanya tubuloside B (5, 10, 50 atau 100ug-ml-1 ), meskipun dengan potensi yang lebih kecil daripada obat referensi (Gbr．3)． Tubuloside B pada konsentrasi ini menunjukkan efek sitoprotektif dengan cara yang bergantung pada dosis dan senyawa itu sendiri tidak menyebabkan sitotoksisitas yang jelas (data tidak ditampilkan)． Elektroforesis gel dari ekstrak DNA dari sel PCI 2 yang diobati dengan 200 M MPP plus selama 48 jam menunjukkan peningkatan DNA． tanda klasik apoptosis, tubulosida B, pada dosis 10 dan 100μ g·ml-1edukasi pembentukan tangga DNA (Gambar 4) Gambar 5 menunjukkan histogram tipikal dari analisis aliran sitometrik kematian sel apoptosis yang diinduksi oleh MPP dalam sel PC12 dengan ada atau tidaknya tubuloside B Kuantifikasi profil siklus sel dengan PI mengungkapkan jumlah sel dengan karakteristik subdiploid (wilayah M1) yang menunjukkan fragmentasi DNA apoptosis． Dalam sel yang tidak diobati, fraksi subdiploid apoptosis minimal hingga 5．94％dari total 10.000 sel (Gambar．5 A)． Setelah 48 jam paparan MPP＋, persentase apoptosis meningkat menjadi 43．02;j;(Gbr．5 B)． Ketika ditambahkan ke kultur sel, tubuloside B menghambat apoptosis yang diinduksi MPP dengan cara yang bergantung pada dosis． Pada konsentrasi 10 ug·ml-1perlindungan oleh tubuloside B tidak signifikan secara statistik, tetapi pada 50 dan 1 00ug·ml-1, penurunan masing-masing 45％dan 63, diamati menghasilkan peningkatan persentase sel yang bertahan hidup (Gambar 5D, E)．

Akumulasi ROS intraseluler dapat dideteksi dengan menggunakan sel DCFH-DA．PC12 yang diobati dengan 200 uM MPP＋ selama 48 jam menampilkan fluoresensi intens di dalam sel setelah pewarnaan dengan pewarna DCFH-DA (Gbr．6)． Pengobatan simultan dengan tubuloside B (pada dosis 10 dan 100ug·ml.) menghambat produksi ROS yang diinduksi MPP＋一 (berkurangnya persentase masing-masing 24．52％ dan 55．63％)．

Diskusi

Patogenesis PD melibatkan stres oksidatif yang kuat, penurunan kadar antioksidan, dan defek mitokondria. semuanya diketahui menginduksi apoptosis di beberapa sistem seluler． Secara khusus, radikal bebas telah terbukti memicu kematian sel aktif di neuron[14]． MPTP menghasilkan sindrom mirip parkinson yang ireversibel dan parah yang menyebabkan degenerasi selektif neuron dopaminergik nigrostriatal pada manusia. Neurotoksin ini telah digunakan untuk membuat model hewan dari PD[15]．MPTP diubah oleh monoamine oksidase B menjadi MPP＋, yang terakumulasi dalam mitokondria． di mana ia menghambat kompleks mitokondria I dan hari-hari mitokondria itu． fungsi menyebabkan apoptosis [16] Oleh karena itu, MPP plus neurotoksisitas yang diinduksi pada neuron dopaminergik telah digunakan secara luas sebagai model etiologi PD untuk skrining agen neuroprotektif．

Dalam penelitian ini, kami telah menunjukkan bahwa kematian sel yang diinduksi MPP plus melalui stres oksidatif dalam sel PC12 dikurangi oleh tubuloside B. Lebih lanjut, kami menunjukkan bahwa tubuloside B juga dilindungi dengan cara yang bergantung pada dosis terhadap DNA laddering yang diinduksi MPP plus. dan apoptosis, yang diukur menggunakan elektroforesis gel DNA dan analisis flow cytometric. Selain itu, pengobatan simultan dengan konsentrasi tubuloside B yang lebih tinggi menghambat produksi ROS yang diinduksi MPP. Dengan demikian, tubuloside B telah menunjukkan efek neuroprotektif multi-fungsional. Beberapa mekanisme, secara terpisah atau bersama-sama, mungkin terlibat dalam aksi tubulosida B. Efek antioksidan adalah mekanisme yang mungkin untuk perlindungan saraf yang dimediasi tubulosida B. Xiong Q menemukan bahwa tubulosida B menunjukkan aktivitas penangkapan radikal bebas yang kuat pada 1,1-difenil-2-radikal pikrilhidrazil dan xantin]xantin oksidase menghasilkan radikal anion superoksida [6].

Beberapa fenilethanoid baru-baru ini dilaporkan memiliki sifat pemulung radikal bebas dan melindungi cedera toksik akibat stres oksidatif. ROS yang dihasilkan oleh MPP plus seperti hidrogen peroksida, anion superoksida, dan radikal hidroksil mudah merusak molekul biologis, yang pada akhirnya dapat menyebabkan kematian sel apoptosis atau nekrotik. Dengan demikian, tubuloside B mungkin memiliki efek pembersihan langsung terhadap ROS. Sementara data kami tidak menetapkan situs yang tepat di mana tubuloside B bertindak untuk menekan akumulasi ROS, mereka menunjukkan bahwa mekanisme neuroprotektif melibatkan stimulasi jalur antioksidan. Sebuah studi tentang struktur molekul tubuloside B juga menunjukkan bahwa ia memiliki kapasitas yang kuat untuk mengais radikal bebas (komunikasi pribadi).

Mekanisme lain juga mungkin relevan. Misalnya, tubuloside B mungkin memiliki kapasitas untuk melawan toksisitas MPP＋ dengan menghambat pembukaan pori transisi permeabilitas mitokondria dan disfungsi. Selain itu, apakah tubuloside B memiliki efek pertumbuhan langsung pada sel saraf juga harus dipertimbangkan. Mekanisme pasti dari aksi neuroprotektif tubuloside B masih belum jelas. Studi tambahan diperlukan untuk menjelaskan gambaran lengkap tentang efek neuroprotektifnya.

Secara meyakinkan, tubuloside B dari ekstrak salsa Cistanche memiliki efek protektif yang jelas pada MPP plus yang diinduksi apoptosis dan stres oksidatif. Efek neuroprotektifnya terhadap toksisitas MPP mungkin penting dan menyarankan itu mungkin memiliki potensi terapeutik dalam pencegahan dan pengobatan PD.

pengobatan PD: cistanche

Referensi

7. Xiong Q, Tezuka Y, Kaneko 1", Li H, Tran LQ Hase K, Namba T, Kadota S. Penghambatan oksida nitrat oleh fenilethanoid pada makrofag yang diaktifkan. Eur J Pharmaco12000; 400:137 –44

8. Greene LA, Tischler AS. Pembentukan garis klon noradrenergik sel pheochromocytoma adrenal yang merespon faktor pertumbuhan saraf. Proc Nat Acad Sci 1976; 73:2424-8

9. Yao Z, Drieu K, Szweda LI, Papadopoulos V. Radikal bebas dan peroksidasi lipid tidak memediasi kematian sel neuron yang diinduksi -amiloid. Otak Res 1999; 847: 203- 10

10. Yamamoto T, Yuyama K, Nakamura K, Kato T, Yamamoto H. Karakterisasi kinetik dari toksisitas oksida nitrat untuk sel PC12: efek waktu paruh pelepasan NO. Eur J Pharmacol 2000; 397:25-33

11. Nicoletti l, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani E Riccardi C. Metode cepat dan sederhana untuk mengukur apoptosis timosit dengan pewarnaan propidium iodida dan flow cytometry. Metode Imunol J 1991; 139: 271-9

12. Moore KJ, Matlashewski C. Infeksi intraseluler oleh Leishmania do nova menghambat apoptosis makrofag. J Imunol 1994; 152: 2930- 7

13. Mark RJ, Keller JN, Kruman I, Mattson MP. FGF dasar melemahkan stres oksidatif yang diinduksi peptida amiloid, disfungsi mitokondria, dan penurunan aktivitas Na -K -ATPase di neuron hipokampus. Penelitian Otak 1997; 756: 205-14

14. Merad-Boudia M, Nicole A, Santiard-Baron D, Saille C, CeballosPicot L Kerusakan mitokondria sebagai peristiwa awal dalam proses apoptosis yang disebabkan oleh penipisan glutathione dalam sel saraf: relevansi dengan penyakit Parkinson. Biochem Pharmaco11998; 56: 645-55

15. Langston JW, Ballard P, Tetrud JW, Irwin I. Parkinsonisme kronis pada manusia karena produk sintesis meperidine-analog. Sains 1983; 219:979-80

16. Mizuno Y, Sone N, Suzuki K, Saitoh T. Studi tentang toksisitas 1-me etil-4-ion fenilpiridinium (MPP ) terhadap mitokondria otak tikus.J Neurol Sci 1988; 86: 97-110