Total Glikosida Cistanche Deserticola Mempromosikan Pemulihan Fungsi Neurologis Dengan Menginduksi Regenerasi Neurovaskular Melalui Jalur Nrf- 2/Keap-1 pada Tikus MCAO/R-Ⅰ

PERKENALAN

Stroke dianggap sebagai penyebab utama kematian dan kecacatan di dunia. Hampir 87% dari seluruh kasus stroke dipicu oleh stroke iskemik. Saat ini, agen yang paling efektif dan satu-satunya obat yang disetujui FDA digunakanpengobatan stroke iskemikadalah aktivator plasminogen jaringan rekombinan. Namun, sejumlah besar pasien stroke gagal memberikan respons terhadap obat ini, karena rentang waktu terapi yang sempit dan risiko komplikasi hemoragik yang serius. Tantangan utama pengobatan trombolitik adalah cedera iskemia/reperfusi (I/R), yang dianggap sebagai penyebab utama cedera otak dan kerusakan fungsi. Reperfusi setelah iskemia serebral meningkatkan risiko pendarahan otak sekaligus menyebabkan cedera neurovaskular dan memproduksi spesies oksigen reaktif (ROS) berlebihan yang merusak sawar darah-otak. Beberapa penelitian telah mengkonfirmasi bahwa terganggunya BBB merupakan penyebab utama patogenesis stroke iskemik.

CISTANCHE TUBULOSA ALAMI UNTUK PENGOBATAN STROKE ISKEMIK PHGS75% ECH 30% ACT 12%

BBB terutama terdiri dari sel endotel, perisit, astrosit, neuron, dan membran basal. Komponen inti BBB adalah sel endotel mikrovaskuler serebral yang disatukan melalui sambungan ketat, sehingga membatasi molekul eksogen masuk ke otak. Perubahan patologis pada persimpangan ketat - khususnya occludin, claudin-5, dan zonula occludens-1 (ZO-1) -secara signifikan mempengaruhi fungsi BBB selama stroke iskemik, terutama permeabilitas penghalang. Selama periode I/R, ROS yang berlebihan merupakan salah satu faktor utama yang menyebabkan kerusakan langsung pada neuron otak. Produksi ROS yang berlebihan menyebabkan degradasi sambungan tertentu dan gangguan BBB, yang mengakibatkan molekul eksogen memasuki otak melalui BBB, yang menyebabkan kerusakan otak semakin parah. Oleh karena itu, perlindungan BBB dengan anti-oksidan telah dianggap sebagai cara potensial untuk mencegah cedera reperfusi.

Selain kerusakan BBB, I/R dapat menyebabkan cedera neurovaskular dan kematian neuron. Selama stroke, peningkatan kematian sel saraf mungkin disebabkan oleh stres oksidatif dan banyak penelitian menunjukkan bahwa ROS memperburuk keparahan stroke dan kerusakan neurologis. Meskipun uji klinis belum memberikan hasil yang memuaskan, perlindungan saraf masih merupakan strategi yang menjanjikan untuk pengobatan stroke iskemik akut. Oleh karena itu, menemukan obat pelindung saraf yang efektif untuk mengobati stroke merupakan suatu manfaat bagi pasien stroke.

Pengobatan Tradisional Tiongkok (TCM) mengambil tindakan untuk melakukan intervensi terhadap ketidakseimbangan internal tubuh. Karena patogenesis stroke iskemik yang kompleks, efek multifaktorial dari TCM dan unsur aktifnya memainkan peran penting dalam pengobatan stroke.Cistanchedeserticola YC Ma, tersebar luas di daerah kering atau semi-kering di seluruh Mongolia dan Tiongkok Barat Laut, telah menjadi ramuan TCM yang banyak digunakan untuk pengobatan berbagai penyakit seperti kelupaan dan depresi selama lebih dari 1,000 tahun di Tiongkok. Studi farmakologi modern menunjukkan bahwa ekstrak kasar dari C. deserticola menunjukkan berbagai aktivitas farmakologi, sepertimeningkatkan fungsi pembelajaran dan memori, perlindungan saraf, kekebalan, antioksidan, anti-penuaan, dan efek antilelah. Analisis kimia C. deserticola menunjukkan bahwa unsur utamanya meliputiglikosida feniletanoid, glikosida iridoid, polisakarida, dan oligosakarida. Namun, komponen aktif C. deserticola untuk perlindungan otak belum begitu jelas.

Sifat neuroprotektif C. deserticola menyiratkan potensi terapeutiknya pada penyakit yang berhubungan dengan kognitif seperti stroke dan depresi, serta penyakit Alzheimer. Namun, penelitian mengenai dampak C. deserticola pada stroke, termasuk komponen aktif dan mekanisme kerjanya, masih sangat terbatas. Dalam penelitian ini, kami mengeksplorasi efek perlindungan dari tiga ekstrak dari C. deserticola, glikosida total (TG, glikosida feniletanoid, dan glikosida lainnya), polisakarida (PS), dan oligosakarida (OS) pada cedera I/R otak. Temuan kami dapat berkontribusi pada penerapan klinis C. deserticola yang akurat dan menyediakan kandidat agen untuk ituterapi stroke iskemik.

BAHAN DAN METODE

Bahan Kimia dan Reagen

Batang Cistanche deserticola dibeli dari Alashan, Mongolia Dalam, dan diidentifikasi oleh salah satu penulis (P.-F. Tu). TG, PS, dan OS disiapkan sesuai dengan metode yang kami laporkan sebelumnya. Analisis kuantitatif TG dilakukan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) seperti yang dijelaskan sebelumnya, dan kromatogramnya ditunjukkan pada Gambar 1. Komponen utama TG adalah echinacoside, tubuloside A, acteoside, isoacteoside, dan 2'-acetylacteoside; kandungannya berturut-turut adalah 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g, dan 12,045 mg/g. Kandungan PS dan OS masing-masing adalah 69,42% dan 65,24%, sebagaimana ditentukan oleh HPLC dan analisis asam fenol-sulfat.

CISTANCHE TUBULOSA ALAMI UNTUK MENGOBATI STROKE ISKEMIK PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Referensi standar echinacoside (A0282), tubuloside A (A0942), acteoside (A0280), isoacteoside (A0281), dan 2'- acetylacteoside (A0943) dibeli dari Chengdu Must Biotechnology. Kemurnian semua standar lebih dari 98%. Kit H&E noda Nissl dibeli dari Boster. Edaravone (T0407-1) ​​dibeli dari Target Mol (Shanghai, Cina). MAP anti tikus kelinci-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620), dan CD31 anti tikus tikus (ab24590) telah dibeli dari Abcam Inc. Kelinci anti tikus Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M), dan Occludin (BS72035) dibeli dari Bioworld Technology. Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, USA) adalah sumber Synapsin anti tikus kelinci-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) dibeli dari Proteintech Group, Inc. Antibodi sekunder dipasok oleh Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Beijing, Cina). Hoechst 33258 diperoleh dari Beyotime.

Hewan

Tikus Sprague-Dawley (jantan, dengan berat 250-300g) diperoleh dari Vital River Laboratory Animal Technology dan ditempatkan di ruangan ber-AC dengan siklus terang / gelap 12 jam. Semua percobaan pada hewan dilakukan berdasarkan pedoman penelitian hewan ARRIVE, dan disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional dari Pusat Ilmu Kesehatan Universitas Peking.

Protokol Eksperimental Hewan

Tikus diberi MCAO/R, seperti yang dijelaskan sebelumnya (Wang et al., 2018). Secara singkat, arteri karotis komunis kiri (CCA), arteri karotis eksternal (ECA), dan arteri karotis internal (ICA) terbuka, dan jahitan nilon monofilamen 3-0 dimasukkan dari ECA ke dalam ICA hingga mencapai bagian tengah. arteri serebral (MCA). Setelah 1,5 jam oklusi MCA, reperfusi disimulasikan dengan menghilangkan filamen. Selama prosedur pembedahan, suhu tubuh semua tikus dipertahankan pada 37,0 derajat. Obat

Administrasi

Tikus dipisahkan secara acak menjadi enam kelompok menggunakan perangkat lunak SPSS versi 22.0 seperti yang dijelaskan: kelompok normal (NOR); kelompok model (MOD); kelompok edaravone (obat positif, 6 mL/kg, EDI); Kelompok TG (280 mg/kg, TG); Kelompok PS (280 mg/kg, PS), dan kelompok OS (280 mg/kg, OS). TG, PS, dan OS diberikan sekali sehari setelah MCAO/R selama 14 hari. Kelompok NOR dan MOD diobati dengan normal saline. Nomor hewan ditunjukkan pada Tabel 1.

Pengukuran Berat Badan dan Skor Defisit Neurologis yang Dimodifikasi (mNSS)

Berat badan dipantau pada hari ke 14 menggunakan Skala Digital ADVENTURE™ (OHAUS, New Jersey, USA). MNSS dinilai berdasarkan metode yang dijelaskan oleh FJ Wang (Wang et al., 2018), dengan sedikit revisi.

2, 3, 5-Pewarnaan Trifeniltetrazolium Klorida (TTC)

Volume infark diukur seperti dijelaskan sebelumnya. Singkatnya, otak dibagi menjadi tujuh blok koronal dengan jarak yang sama (2 mm). Bagian ini diwarnai dengan TTC 2% pada suhu 37 derajat selama 15 menit. Volume infark (%)=(volume belahan iskemik ipsilateral −volume belahan iskemik kontralateral)/volume belahan iskemik kontralateral × 100.

Pewarnaan Nissl dan H&E

Tikus-tikus tersebut dibius secara mendalam, dan seluruh otak kemudian dengan cepat dikeluarkan dari tengkorak, difiksasi menggunakan paraformaldehyde 4% yang tertanam dalam lilin parafin dan dipotong menjadi irisan setebal 7 µm. Bagian tersebut diwarnai dengan Nissl dan H&E. Dalam penelitian ini, enam bidang acak berukuran 200 × 200 µm ditangkap di setiap spesimen jaringan dengan mikroskop cahaya. Jumlah jenazah Nissl dihitung dengan software IPP versi 6.0.

Uji Evans Biru

Tikus disuntik dengan EB 2% setelah MCAO/R. Dua jam kemudian, tikus-tikus itu dibius dan seluruh otaknya kemudian dikeluarkan dengan cepat dan dihomogenisasi dalam aseton. Supernatan dianalisis pada 620 nm oleh pembaca serapan 800 TS.

Pengukuran Aktivitas Katalase (CAT), Superoxide Dismutase (SOD), Malondialdehyde (MDA), dan Glutathione Peroxidase (GSH-Px)

Semua sampel serum disentrifugasi pada 4,{1}} × rpm selama 15 menit pada suhu 4 derajat dan kemudian dianalisis untuk mendeteksi aktivitas MDA, CAT, SOD, dan GSH-Px mengikuti instruksi pabrik.

Analisis Western Blotting

Jaringan otak (100 mg) yang dikumpulkan dari masing-masing tikus dihomogenisasi dan dilisiskan dalam buffer lisis RIPA dan kemudian dianalisis untuk mendeteksi konsentrasi protein menggunakan kit BCA. Total protein jaringan dimuat pada 10% gel SDS-PAGE dan ditransfer ke membran nitroselulosa. Membran diblokir menggunakan susu skim 5%, kemudian diinkubasi semalaman dengan antibodi primer pada suhu 4 derajat. Membran kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder. Analisis Western blot dianalisis menggunakan Kodak Digital Imaging System.

Analisis Imunofluoresen

Pewarnaan imunofluoresensi untuk CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 dan Keap-1 dilakukan. Antibodi primer terhadap Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 dan Keap-1 diencerkan menjadi 1 :200 dan 1:100, masing-masing. Antibodi sekunder IgG anti-kelinci tikus Alexa Flur 488 dan IgG anti-kelinci rhodamin (TRITC) keduanya diencerkan menjadi 1:200. Inti diwarnai oleh Hoechst 33258. Gambar diambil menggunakan Sistem Pencitraan Patologi Kuantitatif Otomatis Vectra® Polaris™ (PerkinElmer, USA). Ekspresi protein dianalisis menggunakan software IPP versi 6.0. Analisis statistik

Semua data digambarkan sebagai mean ± SD. Perangkat lunak SPSS versi 22.0 dilakukan untuk analisis statistik. ANOVA satu arah digunakan ketika membandingkan kelompok yang berbeda. P <0.05 dianggap sebagai perbedaan statistik.

CISTANCHE TUBULOSA ALAMI UNTUK PENYAKIT ANTI ISKEMIK PHGS75% ECH 30% ACT 12%

HASIL

TG Meningkatkan Berat Badan dan Mengurangi Kerusakan Otak pada Tikus MCAO/R

Setelah 14 hari penyembuhan dengan TGs, PSs, Oss, dan EDI, berat badan, defisit neurologis, dan volume infark tikus I/R dievaluasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa bobot badan pada kelompok MOD mengalami penurunan yang sangat besar, sedangkan penurunan bobot pada kelompok TGs, PSs, dan EDI mengalami peningkatan (Gambar 2A). Skor defisit neurologis secara substansial diturunkan oleh EDI dan TGs (Gambar 2B). Irisan otak tikus kelompok NOR berwarna merah tua dan tidak terdapat infark, sedangkan tikus kelompok MOD menunjukkan infark serebral ipsilateral yang besar. Setelah pengobatan TG, volume infark berkurang secara signifikan (Gambar 2C, D). Perlakuan PS dan OS tidak menunjukkan pengaruh nyata pada indeks di atas. Data di atas menunjukkan bahwa TG dapat meringankan cedera otak akibat I/R, namun PS dan OS tidak bisa.

TG Memperbaiki Kerusakan Histopatologis pada Tikus MCAO/R

Untuk mengetahui beberapa efek pengobatan TGs, PSs, dan OSs terhadap kerusakan histopatologis, dilakukan pewarnaan H&E untuk mengetahui kerusakan patologis. Struktur histomorfologi otak pada kelompok NOR tersusun secara teratur. Perubahan morfologi pada kelompok TGs lebih sedikit dibandingkan pada kelompok MOD. Namun, kelompok perlakuan PS dan OS tidak menunjukkan perbaikan perubahan morfologi yang signifikan (Gambar 3).

TG Mengurangi Cedera Neuronal Setelah Tikus yang Diinduksi I/R

Pewarnaan Nissl menunjukkan adanya perubahan histopatologi neuron pada penumbra daerah iskemik. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4, neuron normal memiliki nukleolus yang jelas dan struktur yang utuh. Pada kelompok MOD, neuron memiliki ruang antar sel yang membesar. Tubuh nissl menghilang, menyusut dan ternoda dalam. Namun, perubahan ini jarang diamati pada kelompok EDI, TGs, dan PS. Hasil ini menggambarkan bahwa TG dan PS dapat secara signifikanmengurangi cedera saraf akibat iskemia/reperfusi.

TGs Mengurangi Gangguan BBB Setelah Tikus yang Diobati I/R

Uji biru Evans adalah metode klasik untuk meneliti perubahan permeabilitas BBB. Hasil percobaan menunjukkan bahwa peningkatan warna biru Evans diamati pada kelompok MOD, sementara terdapat penurunan warna biru Evans secara signifikan pada tikus yang diberi TG dan EDI. Selain itu, tidak ada perbedaan yang signifikan antara kelompok terapi PS dan OS (Gambar 5). Hasil ini menunjukkan bahwa TG dapat mengurangi gangguan BBB secara signifikan.

TG Mempromosikan Angiogenesis pada Tikus yang Terluka I/R

Penelitian yang lebih baru menunjukkan bahwa angiogenesis memainkan peran penting dalam pemulihan fungsional neurologis dan hasil prognosis setelah stroke iskemik akut (Yuen et al., 2015). Untuk mengevaluasi efek TGs, PSs, dan OSs pada angiogenesis, CD31 dan a-SMA digunakan untuk mengukur jumlah kapiler. Pewarnaan imunofluoresensi menunjukkan bahwa kelompok MOD menyebabkan penurunan yang luar biasa dalam ekspresi CD31 (Gambar 6A, B) dan a-SMA (Gambar 6C, D) di penumbra area iskemik tikus I/R, dibandingkan dengan tikus normal. . Hasil ini menggambarkan bahwa I/R dapat menyebabkan kerusakan pembuluh darah di korteks penumbra hemisfer iskemik. Namun, pengobatan TG dan EDI secara signifikan meningkatkan kepadatan kapiler, angiogenesis, dan arteriogenesis seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan ekspresi CD31 dan a-SMA. Hasil ini menunjukkan bahwa TG dapat meningkatkan angiogenesis pada penumbra iskemik tikus I/R, namun PS dan OS tidak dapat melakukannya.

TG Meningkatkan Ekspresi Protein Persimpangan Ketat pada Tikus yang Terluka I/R

Gangguan BBB dapat meningkatkan kadar air otak dan pembengkakan jaringan, sehingga menyebabkan cedera otak. Protein sambungan ketat adalah komponen struktural penting dari BBB. Untuk menguji apakah pengobatan TGs, PSs, dan OSs setelah stroke dapat mempengaruhi integritas BBB, ekspresi ZO-1, claudin-5, dan occludin dilakukan dengan analisis imunofluoresensi. Hasilnya menunjukkan bahwa ekspresi claudin-5, occludin, dan ZO-1 terlihat menurun pada kelompok MOD. Namun, jumlahnya meningkat secara substansial setelah 14 hari pemerintahannya. Kelompok PS dan OS tidak menunjukkan perubahan signifikan dalam ekspresi protein ini (Gambar 7). Data ini menunjukkan bahwa TG dapat mengatur ekspresi protein persimpangan ketat dan mungkin mempertahankan integritas BBB setelah cedera I/R.

TG Meningkatkan Cakupan Perisit pada Kapiler pada Tikus yang Terluka I/R

Cakupan pericyte pada kapiler memainkan peran penting dalam menjaga integritas BBB. Dengan demikian, kami menguji apakah cakupan perisit dapat ditingkatkan dengan pengobatan TG, PS, dan OS. Hasil analisis intensitas imunofluoresensi menunjukkan bahwa ekspresi PDGFRb dan CD31 menurun drastis pada kelompok MOD. Pemberian TG pada tikus I/R secara signifikan memulihkan atau bahkan meningkatkan intensitas ekspresi PDGFRb dan CD31, namun tidak ada perbedaan yang diamati pada kelompok perlakuan PS dan OS (Gambar 8). Dengan demikian, pengobatan TG dapat meningkatkan cakupan perisit secara signifikan. Temuan ini semakin menegaskan bahwa TG dapat menjaga integritas BBB setelah I/R.

CISTANCHE TUBULOSA ALAMI UNTUK MENCEGAH STROKE ISKEMIK PHGS75% ECH 30% ACT 12%