Studi Toksisitas Subkronik 2-(l-mentoksi)etanol pada Tikus F344 selama 13-minggu
Apr 19, 2024
Perkenalan
2-(1-mentoksi)etanol (CAS No. 38618-23-4) adalah cairan bening dan tidak berwarna dengan bau khas dan banyak digunakan sebagai bahan penyedap rasa. Komite Ahli Gabungan FAO/WHO untuk Bahan Tambahan Makanan (JECFA) telah mengevaluasi 2-(l-metoksi)etanol sebagai bahan penyedap, dikategorikan sebagai zat yang secara struktural berhubungan dengan mentol1. Berdasarkan kelas struktural bahan penyedap, 2-(l-metoksi)etanol dimasukkan ke dalam Kelas I. Di Amerika Serikat dan Eropa, tingkat asupannya sebesar 2-(l-metoksi)etanol oleh manusia diperkirakan masing-masing sebesar 12 ug/orang/hari dan 00,01 ug/orang/hari, keduanya berada di bawah ambang batas Kelas I yaitu 1.800 ug/orang/hari. Berdasarkan perkiraan ini, dianggap bahwa 2-(1-mentoksi)etanol mungkin tidak menimbulkan masalah keamanan selama penggunaan rutin sebagai bahan penyedap rasa.
CISTANCHE TUBULOSA ALAMI UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%
As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg berat badan [BB])1. Meskipun menggunakan 2-(1-mentoksi)etanol sebagai zat penyedap, data terbatas tersedia mengenai toksisitas dosis berulang senyawa ini. Laboratorium kami telah menyelidiki toksisitas beberapa bahan tambahan makanan, termasuk bahan penyedap yang mewakili setiap kategori, pada model hewan pengerat2–7. Untuk memperjelas profil toksikologi dan menetapkan tingkat efek samping tanpa teramati (NOAEL), kami melakukan studi toksisitas subkronis 13-minggu terhadap etanol 2-(1-mentoksi) yang diberikan secara oral kepada tikus F344 secara gavage.
Bahan dan metode
Uji bahan kimia
2-(1-mentoksi)etanol (Lot No. 5I0002, kemurnian 99,9%) diproduksi oleh Takasago Int. Corp. (Tokyo, Jepang) disediakan oleh Divisi Standar dan Evaluasi, Departemen Keamanan Pangan, Kementerian Kesehatan, Tenaga Kerja dan Kesejahteraan, Jepang, dengan dukungan dari Asosiasi Bahan Perasa & Pewangi Jepang (Tokyo, Jepang). Meskipun zat uji disediakan sebagai campuran isomer optik (CAS No. 38618-23-4), zat tersebut dikonfirmasi sebagai l-enantiomer (CAS No. 75443-64-0) oleh pabrikan. Gavage oral dengan minyak jagung (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Jepang) dipilih sebagai rute pemberian karena ketidaklarutan dalam air dan volatilitas etanol 2-(1-mentoksi) dalam air. Larutan etanol 2-({12}}mentoksi) disiapkan setiap hari, segera sebelum pemberian. Setelah penyimpanan selama 2 jam pada suhu kamar, rasio sisa etanol 2-({15}}mentoksi) dalam larutan 4, 40, dan 400 mg/mL dipastikan sebesar 96,8%, 99,8%, dan 96,5% , masing-masing, dengan kromatografi gas (Asosiasi Inspeksi Jepang untuk Lingkungan Industri Makanan dan Makanan, Tokyo, Jepang).
Hewan percobaan
Secara total, 40 tikus bebas patogen spesifik jantan dan 40 betina (F344/DuCrlCrlj, 5 minggu) dibeli dari Charles River Laboratories Jepang (Yokohama, Jepang) dan digunakan setelah aklimasi selama satu minggu. Selama penelitian, hewan ditempatkan di kandang polikarbonat dengan alas empuk, dipelihara dalam ruangan dengan sistem penghalang untuk mengontrol siklus terang/gelap (12 jam), ventilasi (kecepatan pertukaran udara 18 kali/jam), suhu ( 24 ± 1 derajat ), dan kelembaban relatif (55 ± 5%). Kandang dan alas keripik diganti dua kali seminggu. Setiap hewan memiliki akses gratis ke air keran dan makanan dasar (CRF-1; Oriental Yeast, Tokyo, Jepang). Pada awal percobaan, hewan-hewan tersebut dialokasikan secara acak ke dalam empat kelompok yang masing-masing terdiri dari 10 tikus jantan dan betina, berdasarkan berat badan yang diukur segera sebelum memulai perlakuan dengan bahan kimia uji.
Desain studi
Dalam studi pendahuluan selama {{0}}hari yang menilai etanol 2-(1-mentoksi) yang diberikan pada dosis 0, 200, 400, dan 800 mg/ kg BB/ hari, bobot hati absolut dan relatif meningkat secara signifikan pada semua kelompok perlakuan baik jenis kelamin (data tidak ditunjukkan). Berdasarkan hasil ini, kami memilih dosis etanol 2-(1-mentoksi) 0, 15, 60, dan 250 mg/kg BB/hari untuk diberikan kepada tikus jantan dan betina pada saat ini {{ Studi toksisitas selama 13}}minggu.
Kondisi umum dan kematian dinilai setiap hari. Berat badan, serta jumlah makanan yang diberikan dan sisa makanan, diukur seminggu sekali selama periode percobaan. Semua tikus dipuasakan semalaman untuk menyelesaikan pengobatan, dan sampel darah untuk hematologi dan biokimia serum dikumpulkan dari aorta perut dengan anestesi inhalasi dalam menggunakan isofluran. Desain penelitian sesuai dengan Pedoman Penunjukan Bahan Tambahan Makanan dan Revisi Standar Penggunaan Bahan Tambahan Makanan Jepang (1996) dan disetujui oleh Komite Perawatan dan Pemanfaatan Hewan dari Institut Ilmu Kesehatan Nasional, Jepang.
Hematologi dan biokimia serum
Parameter hematologi berikut dianalisis menggunakan penganalisis hematologi otomatis ProCyte Dx (Laboratorium IDEXX, Westbrook, ME, USA): jumlah sel darah putih (WBC), jumlah sel darah merah (RBC), konsentrasi hemoglobin (HGB), hematokrit (HCT), rata-rata volume sel darah (MCV), rata-rata sel darah merah (MCH), rata-rata konsentrasi sel darah merah (MCHC), jumlah trombosit (PLT), dan sel leukosit diferensial, termasuk neutrofil (Neut), limfosit (getah bening), monosit (Mono), eosinofil (Eosin), dan basofil (Baso). Analisis biokimia serum dilakukan oleh Oriental Yeast untuk parameter berikut: protein total (TP), albumin (Alb), rasio albumin/globulin (A/G), bilirubin total (Bil), glukosa, kolesterol total (T-Chol), trigliserida (TG), urea nitrogen (BUN), kreatinin (Cre), kalsium (Ca), fosfor anorganik (IP), natrium (Na), kalium (K), klorin (Cl), aspartat aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline fosfatase (ALP), dan -glutamil transpeptidase ( -GTP).
Berat organ dan penilaian histopatologis
Nekropsi lengkap dilakukan untuk semua hewan, dan otak, timus, paru-paru, jantung, limpa, hati, kelenjar adrenal, ginjal, testis, dan ovarium ditimbang. Organ-organ tersebut, serta jaringan dari sumsum tulang belakang, saraf trigeminal, kelenjar pituitari, rongga hidung, kelenjar ludah, lidah, kerongkongan, trakea, aorta, kelenjar tiroid, kelenjar paratiroid, pankreas, lambung, usus kecil dan besar, submandibular dan mesenterika kelenjar getah bening, vagina, rahim, kandung kemih, kelenjar prostat, vesikula seminalis, epididimis, tulang paha dan tulang dada dengan sumsum tulang, tulang belakang, otot rangka, saraf skiatik, kulit, dan kelenjar susu, difiksasi dalam formalin buffer netral 10%; kemudian, bagian yang tertanam parafin disiapkan dan diwarnai dengan hematoksilin dan eosin untuk pemeriksaan histopatologi. Testis dan mata dengan kelenjar Harderian masing-masing difiksasi dalam larutan Bouin dan larutan Davidson. Jaringan tulang, termasuk rongga hidung, tulang belakang, tulang dada, dan tulang paha, didekalsifikasi menggunakan campuran asam format 10% dan formalin buffer 10% hingga 2 minggu. Penilaian histopatologis dilakukan untuk semua jaringan yang diperoleh dari hewan dalam kelompok kontrol dan kelompok tersebut diberikan dosis tertinggi kecuali ada lesi terkait pengobatan yang diamati.
CISTANCHE TUBULOSA ALAMI UNTUK MENINGKATKAN IMUNITAS PHGS75% ECH 30% ACT 12%
Imunohistokimia untuk 2u-globulin
Pada tikus jantan, akumulasi 2u-globulin di ginjal diperiksa dengan analisis imunohistokimia pada bagian yang tertanam parafin. Untuk pengambilan antigen, bagian yang diperoleh dari 5 tikus di masing-masing kelompok diinkubasi dengan proteinase K (DAKO, Glostrup, Denmark) selama 1 menit pada suhu kamar. Semua bagian direndam dalam larutan H2O2/metanol 3% selama 10 menit pada suhu kamar untuk inaktivasi aktivitas peroksidase endogen. Setelah memblokir reaksi nonspesifik dengan 10% serum kelinci normal, bagian tersebut diinkubasi dengan antibodi primer untuk 2uglobulin (diencerkan 1:400; antibodi 2u-globulin anti-tikus; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) semalaman pada suhu 4 derajat 8. Visualisasi pengikatan antibodi dilakukan menggunakan VectaStain Elite ABC Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) dan 3,3′-diaminobenzidine. Semua bagian diwarnai dengan hematoxylin.
Analisis statistik
Variasi nilai data untuk berat badan selama periode percobaan, serta untuk hematologi, biokimia serum, dan berat organ, dinilai homogenitasnya menggunakan uji Bartlett. Analisis varians satu arah dan uji Kruskal-Wallis, masing-masing, digunakan untuk data homogen dan heterogen. Dalam menentukan perbedaan yang signifikan secara statistik, uji perbandingan berganda Dunnett digunakan untuk membandingkan kelompok kontrol dan kelompok perlakuan. Perbandingan kejadian dan derajat histopatologi dianalisis dengan masing-masing menggunakan uji probabilitas eksak Fisher dan uji Mann-Whitney's U. Nilai P dari<0.05 were considered statistically significant.
Hasil
Parameter dalam kehidupan, hematologi, dan biokimia serum
Tidak ada tanda-tanda klinis yang signifikan yang dicatat selama periode percobaan, dan semua hewan bertahan sampai nekropsi yang dijadwalkan. Selain itu, tidak ada perbedaan signifikan dalam berat badan dan asupan makanan harian yang diamati pada tikus jantan dan betina (Gambar 1A dan B).
Data hematologi dan biokimia serum masing-masing ditunjukkan pada Tabel 1 dan 2. Analisis hematologi menunjukkan penurunan HGB, HCT, MCV, dan MCH secara signifikan serta peningkatan PLT pada tikus jantan yang diberikan 250 mg/kg BB/hari 2-(1-mentoksi)etanol (Tabel 1). Dalam biokimia serum, peningkatan signifikan pada TP, T-Khol, dan Ca serta penurunan Bil dan ALP tercatat pada laki-laki dari kelompok 250 mg/kg (Tabel 2). Peningkatan Cre yang signifikan dan penurunan A/G tercatat pada laki-laki dari kelompok 60 dan 250 mg/kg. Pada wanita, peningkatan Ca dan penurunan ALP yang signifikan tercatat pada kelompok 60 dan 250 mg/kg, sedangkan peningkatan T-Khol dan penurunan A/G, Bil, TG, AST, dan ALT terdeteksi pada kelompok 250 mg. /kg kelompok. Meskipun peningkatan TG dan penurunan Cl yang signifikan diamati pada laki-laki yang diberikan 60 mg/kg, kurangnya hubungan dosis menunjukkan bahwa perbedaan ini tidak terkait dengan paparan zat uji.
Bobot organ
Data berat organ dirangkum dalam Tabel 3. Berat hati absolut dan relatif meningkat secara signifikan pada kedua jenis kelamin pada kelompok 250 mg/kg (Tabel 3). Peningkatan signifikan dalam berat hati relatif diamati pada laki-laki dari kelompok 60 mg/kg. Pada laki-laki, berat ginjal absolut dan relatif meningkat secara signifikan pada kelompok 60 dan 250 mg/kg. Pada kelompok pria 250 mg/kg, terjadi peningkatan yang signifikan pada bobot absolut dan relatif kelenjar adrenal serta bobot relatif limpa dan testis.
Histopatologi dan imunohistokimia
Data untuk temuan histopatologis dan imunohistokimia dirangkum dalam Tabel 4 dan 5. Temuan histopatologis mengungkapkan bahwa frekuensi akumulasi butiran eosinofilik (Gambar 2A – D), tubulus basofilik, dan cetakan hialin, serta peradangan interstisial fokal di ginjal, meningkat secara signifikan pada kelompok perlakuan yang semuanya laki-laki bila dibandingkan dengan kontrol. kelompok (Tabel 4). Berdasarkan analisis imunohistokimia, tikus jantan yang diobati dengan zat uji menunjukkan peningkatan imunoreaktivitas 2u-globulin dalam sel epitel tubulus proksimal, menunjukkan ketergantungan dosis yang jelas (Gambar 2E – H) (Tabel 5).
Pada nekropsi, seekor tikus jantan dalam kelompok 250 mg/kg menunjukkan pembesaran parah pada ginjal kanan karena karakteristik histologis nefroblastoma. Meskipun nefroblastoma jarang terjadi pada sebagian besar strain tikus9, kasus ini dianggap hanya kebetulan, karena tidak ada hewan lain yang menunjukkan lesi serupa. Selain itu, dalam studi karsinogenisitas oral, kejadian nefroblastoma spontan pada tikus F344/DuCrlCrlj jantan dilaporkan berkisar antara 0–2,0%10. Meskipun beberapa lesi terdeteksi secara sporadis pada organ lain, tidak ada perubahan signifikan yang terlihat tergantung pada pengobatan pada kejadian lesi ini.
Diskusi
Hingga saat ini, 24 bahan penyedap rasa, termasuk etanol 2-({2}}mentoksi) telah dievaluasi oleh JECFA sebagai zat yang secara struktural terkait dengan mentol, dan semuanya terdaftar sebagai "tidak ada masalah keamanan" pada tingkat perkiraan saat ini asupan1, 11. 2-(1-Mentoksi)etanol diklasifikasikan dalam subkelompok alkohol alisiklik atau eter dan dianggap terutama terkonjugasi dengan asam glukuronat, diikuti oleh ekskresi urin1. Meskipun nilai LD50 oral zat-zat ini pada hewan pengerat relatif tinggi, data dari studi toksisitas dosis berulang masih terbatas. Studi toksisitas dosis berulang selama 13-minggu telah mengungkapkan bahwa mentil pirolidon karboksilat (CAS No. 68127-22-0), suatu senyawa yang secara struktural terkait dengan mentol, dapat dikaitkan dengan peningkatan bobot relatif hati dan ginjal pada pria dan wanita Tikus Wistar. Akumulasi 2u-globulin di tubulus proksimal tikus jantan juga diamati pada dosis 1.111 mg/kg BB/hari, dan NOAEL ditentukan sebesar 109 mg/kg BB/hari1.
Dalam studi toksisitas subkronik 2-(1-mentoksi)etanol 13-minggu ini, tidak ada perubahan toksikologi pada kondisi umum, berat badan, dan asupan makanan yang diamati. Setelah penilaian hematologi, kami mengamati penurunan HGB (96,6% dari nilai rata-rata kontrol), HCT (96,3%), MCV (98,4%), dan KIA (98,2%) dan peningkatan PLT (111%) pada pria. Kelompok 250 mg/kg, yang dianggap sebagai pengaruh toksikologis dari pengobatan etanol 2-(1-mentoksi). Berat hati absolut (115% pada kedua jenis kelamin) dan relatif (119% pada pria dan 111% pada wanita) meningkat secara signifikan pada kedua jenis kelamin dalam kelompok 250 mg/kg. Meskipun tidak ada perubahan histopatologis pada hati, terjadi peningkatan kadar T-Chol serum (110% pada pria dan 121% pada wanita) dan TP (105% pada pria) dan penurunan TG (60,1% pada wanita) pada 250 pasien. kelompok mg/kg menunjukkan perubahan toksik yang terkait dengan metabolisme lipid dan sintesis protein di hati. Penurunan HGB dan MCH serta peningkatan PLT, T-Chol, dan TP pada pria serta penurunan TG dan peningkatan bobot hati absolut dan relatif pada kedua jenis kelamin juga terdeteksi, dengan signifikansi statistik dalam studi pendahuluan 28-hari (data tidak ditampilkan ), menguatkan bahwa perubahan parameter hematologi dan biokimia serum, serta bobot hati, bukan bersifat insidental tetapi merupakan uji efek terkait zat. Sebaliknya, peningkatan signifikan pada bobot hati relatif yang terdeteksi pada kelompok pria 60 mg/kg dalam penelitian ini tidak disertai dengan peningkatan bobot absolut atau perubahan parameter biokimia terkait, yang menunjukkan bahwa peningkatan ini merupakan perubahan adaptif.
CISTANCHE TUBULOSA ALAMI UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%
Peningkatan berat kelenjar adrenal absolut (120%) dan relatif (118%) secara signifikan pada kelompok pria 250 mg/kg dianggap terkait dengan bahan kimia uji. Selain itu, peningkatan bobot absolut dan relatif kelenjar adrenal pada kedua jenis kelamin menunjukkan ketergantungan dosis yang jelas dalam studi pendahuluan 28-hari (data tidak ditampilkan), yang menunjukkan hubungan dengan uji perlakuan kimia. Meskipun hipertrofi adrenal dapat disebabkan oleh stres, tidak ada temuan yang menunjukkan adanya stres, seperti penurunan berat badan atau atrofi timus dan organ limfoid lainnya, baik dalam penelitian ini maupun penelitian pendahuluan. Karena mungkin tidak ada perubahan histopatologis pada kelenjar adrenal bahkan dengan gangguan produksi glukokortikoid dalam kasus penghambatan enzim terkait steroidogenesis12, kemungkinan bahwa peningkatan berat kelenjar adrenal merupakan temuan toksik tidak dapat dikesampingkan. Sebaliknya, peningkatan bobot relatif limpa dan testis pada kelompok pria 250 mg/kg, yang tidak diamati dalam studi pendahuluan, dianggap tidak signifikan secara toksikologi karena tidak adanya lesi histopatologis atau peningkatan bobot absolut secara signifikan. Demikian pula, biokimia serum menunjukkan penurunan A/G dan peningkatan Ca pada kedua jenis kelamin, yang dianggap tidak memiliki signifikansi toksikologi, mengingat tidak ada kelainan yang terdeteksi pada parameter terkait. Selain itu, penurunan kadar Bil dan ALP pada kedua jenis kelamin serta penurunan AST dan ALT pada wanita berbeda dengan efek toksik yang diperkirakan dan dianggap tidak bermakna.
Nefropati kronis yang ditandai dengan tubulus basofilik, cetakan hialin, dan peradangan interstitial fokal diamati dengan signifikansi statistik pada laki-laki dari semua kelompok perlakuan. Selain itu, peningkatan Cre serum dan berat ginjal absolut dan relatif terdeteksi pada kelompok pria 60 dan 250 mg/kg; perubahan ini tidak diamati pada kelompok perlakuan perempuan. Dalam kasus ini, tingkat akumulasi butiran eosinofilik dalam sel epitel tubulus proksimal meningkat dengan cara yang bergantung pada dosis. Butiran ini dikonfirmasi sebagai 2u-globulin dengan imunohistokimia, menunjukkan terjadinya nefropati 2u-globulin. 2u-Globulin yang terikat pada bahan kimia tertentu, seperti d-limonena, terakumulasi dalam lisosom dan diamati di tubulus proksimal sebagai butiran eosinofilik atau hialin9. Akumulasi ini dapat merusak sel-sel epitel, menyebabkan nefropati progresif kronis dan akibatnya pembentukan tumor9. Jadi, meskipun NOAEL untuk etanol 2-({13}}mentoksi) yang terkait dengan nefropati 2u-globulin pada ginjal tikus jantan tidak teridentifikasi, jenis nefropati ini dilaporkan spesifik untuk tikus jantan dan karenanya tidak relevan untuk manusia. penilaian risiko13. Peningkatan risiko gagal ginjal yang dimediasi melalui mekanisme yang berhubungan dengan akumulasi 2u-globulin sangat kecil kemungkinannya, karena protein ini tidak ada pada manusia14. Oleh karena itu, dianggap masuk akal untuk mengecualikan perubahan yang terkait dengan nefropati kronis yang diamati pada pria dari penentuan NOAEL.
Sebagai kesimpulan, studi toksisitas subkronik 13-minggu ini menunjukkan bahwa pengobatan etanol 250 mg/kg BB/hari 2-(1-mentoksi) menyebabkan perubahan toksik pada hematologi, biokimia serum, dan berat organ pada tikus F344 jantan dan betina. Berdasarkan hasil pengamatan, NOAEL dari 2-(1-mentoksi)etanoldievaluasi sebagai 60 mg/kg BB/hari untuk kedua jenis kelamin.
CISTANCHE TUBULOSA ALAMI UNTUK MENINGKATKAN FUNGSI SEKSUAL PHGS75% ECH 30% ACT 12%
