Saat ini Penuaan Seluler Dianggap Sebagai Reaksi Umum Hampir Semua Jenis Sel yang Berkembangbiak

Mohon hubungi{0}}untuk informasi lebih lanjut

AbstrakPenghapusan sel-sel tua yang ditargetkan, analisis, adalah salah satu tren inti dalam terapi anti-penuaan. Glikosida jantung baru-baru ini terbukti senolitik spektrum luas. Di sini kami menguji sifat senolitik glikosida jantung terhadap sel punca mesenkim manusia (hMSCs). Glikosida jantung tidak memiliki kemampuan senolitik terhadap hMSC tua dari berbagai asal. Dengan menggunakan pendekatan biologis dan bioinformatika, kami membandingkan perkembangan penuaan pada 'hMSCs 'sensitif glikosida jantung' dan '-tidak sensitif'. Tidak adanya analisis ditemukan dimediasi oleh impor kalium yang efektif dan peningkatan resistensi apoptosis pada hMSC yang sudah tua. Melemahnya "pertahanan antiapoptosis" mempengaruhi hMSC untuk dianalisis. Kami mengungkapkan bahwa resistensi apoptosis, yang sebelumnya diakui sebagai karakteristik umum dari penuaan, pada kenyataannya, bukanlah fitur umum dari sel-sel tua. Selain itu, hanya sel tua apoptosis-prolin yang sensitif terhadap analisis yang diinduksi glikosida jantung. Dengan demikian, kita dapat berspekulasi bahwa efektivitas analisis mungkin bergantung pada apakah sel-sel tua memang menjadi resisten apoptosis dibandingkan dengan rekan-rekan mereka yang berkembang biak.

Kata kunciSel induk. Senolisis · Penuaan · Apoptosis · Ketahanan stres

KSL27

Silakan klik di sini untuk tahu lebih banyak

pengantar

Saat ini penuaan seluler dianggap sebagai reaksi umum dari hampir semua jenis sel yang berproliferasi, termasuk kanker dan sel punca, serta beberapa sel pasca-mitosis terhadap berbagai rangsangan stres [1-3]. Jenis penuaan seluler berikut dapat dibedakan sesuai dengan asal faktor pemicu: replikasi (karena kerusakan DNA pada ujung telomer yang memendek), induksi onkogen (sebagai respons terhadap aktivasi sinyal onkogenik yang menyimpang), induksi stres ( dimediasi oleh kerusakan DNA yang disebabkan oleh stres oksidatif, sengatan panas, radiasi UV dan y, dll.) dan yang diinduksi kemoterapi (diaktifkan dalam sel kanker sebagai respons terhadap obat kemoterapi)[4-7]. Ada heterogenitas dalam penanda yang diekspresikan oleh sel-sel tua tergantung pada kedua jenis sel dan penghinaan yang digunakan untuk menginduksi penuaan. Namun, ada beberapa fitur umum yang khas untuk sebagian besar jenis sel tua. Karakteristik penting dari penuaan untuk setiap jenis sel yang membelah adalah hilangnya proliferasi ireversibel [8].ekstrak cistanche tubulosaIreversibilitas dari penghentian siklus sel dikendalikan oleh inhibitor cyclin-dependent kinase (CDK) pl6 dan p21 dan sering diatur oleh protein supresor tumor p53 [8,9]. Fitur penting lainnya dari sel tua adalah aktivasi respons kerusakan DNA yang persisten; hipertrofi sel, yang sering muncul sebagai akibat dari gangguan biogenesis ribosom dan sintesis protein; gangguan degradasi lisosom dan disfungsi sistem degradasi lainnya; peningkatan aktivitas enzim lisosom spesifik terkait penuaan - -galaktosidase; berbagai perubahan mitokondria; akuisisi fenotipe sekretori terkait penuaan (SASP), terdiri dari faktor pro-inflamasi, enzim pendegradasi matriks, spesies oksigen reaktif, dll .; perubahan lanskap epigenetik dan kromatin, termasuk pembentukan fokus heterokromatik terkait penuaan dan distensi satelit terkait penuaan [8-10]. Dengan kata lain, sel tua mempertahankan aktivitas metabolisme dan vitalitas, tetapi fungsinya berubah secara signifikan dibandingkan dengan sel asal.

KSL28

Cistanche dapat anti-penuaan

Sekarang jelas bahwa sel-sel tua dapat memodifikasi lingkungan mikro di sekitarnya yang mempengaruhi sel-sel tetangga dan ceruk seluler, yang dapat menyebabkan kerusakan jaringan dan oleh karena itu mungkin terkait dengan perkembangan penuaan dan penyakit terkait usia [11,12]. Mengingat hal itu, hari ini lebih banyak perhatian difokuskan pada strategi untuk "membunuh" sel-sel tua yang ditargetkan[13-15]. Untuk tujuan ini, kelas obat baru yang disebut senolitik sedang berkembang secara aktif. Senolitik menargetkan jalur pensinyalan yang berkontribusi pada resistensi sel senescent terhadap apoptosis, sehingga menginduksi apoptosis secara istimewa pada sel senescent [16]. Daftar senolitik terus bertambah dengan agen baru. Senyawa yang paling dikenal dengan aktivitas senolitik yang dinyatakan adalah navitoclax (Bcl-2 inhibitor keluarga), kombinasi dasatinib (penghambat beberapa tirosin kinase) dan quercetin (flavonol alami), inhibitor Hsp90, inhibitor MDM2, FOXO{ {8}}p53 interfering peptide, pengurai protein keluarga BET, CAR-T spesifik uPAR, navitoclax terkonjugasi galakto, dan berbagai senyawa alami senolitik[16-24]. Baru-baru ini, menggunakan penyaringan obat dengan hasil tinggi, dua kelompok penelitian independen mengidentifikasi glikosida jantung, terutama ouabain, digoxin, dan bufalin, sebagai senolitik spektrum luas [25,26].ulasan cistanche tubulosaPerlu disebutkan bahwa hampir semua senolitik yang dinyatakan memiliki keterbatasan, seperti efek samping yang tidak diinginkan atau ketidakefektifan terhadap beberapa jenis sel. Sel punca mesenkimal (MSCs), ditemukan hampir di semua organ/jaringan pascakelahiran, dicirikan oleh kapasitas untuk memperbarui diri (pembelahan simetris) dan untuk berdiferensiasi, sehingga berkontribusi pada pemeliharaan dan regenerasi jaringan tempat tinggal [27]. Karena sifat unik ini, bersama dengan fungsi anti-inflamasi dan imunosupresif yang kuat, MSC secara luas diterapkan dalam terapi penggantian sel untuk pengobatan berbagai penyakit, termasuk diabetes Mellitus, multiple sclerosis, infark miokard, dan sebagainya [28]. Namun, mirip dengan turunannya yang terdiferensiasi dan sel unipoten lainnya, MSC dapat mengalami penuaan baik secara replikatif maupun prematur sebagai respons terhadap aktivasi onkogen dan rangsangan stres [29, 30]. Penuaan MSC memiliki banyak akibat yang tidak diinginkan, di antaranya adalah kelelahan kumpulan sel punca, berkurangnya pemeliharaan dan regenerasi jaringan, gangguan kapasitas diferensiasi, penyebaran penuaan yang diperantarai SASP, berkurangnya sifat angiogenik, modifikasi ceruk sel punca [29,31-33]. Mempertimbangkan signifikansi biologis dari fungsi MSC yang tepat, MSC tua dapat dianggap sebagai target penting untuk analisis. Sejalan dengan saran ini, sejumlah ulasan yang menyoroti kemungkinan hasil yang menguntungkan dari penghapusan MSC yang sudah tua telah diterbitkan selama setahun terakhir [29, 31,34,35]. Namun demikian, hanya ada beberapa data eksperimental mengenai masalah ini [36-40].

Dalam penelitian ini, kami menunjukkan untuk pertama kalinya bahwa glikosida jantung, yaitu ouabain dan bufalin, gagal menampilkan aktivitas hemolitik terhadap MSC manusia (hMSC) yang berasal dari endometrium (END-MSC), jaringan adiposa (AD-MSC), pulpa gigi (DP-MSCs) dan Warton jelly (WJ-MSCs). Selain itu, kami mengonfirmasi bahwa kedua glikosida jantung mampu menginduksi apoptosis secara istimewa pada A549 dan SK-HEP-1 senes-cent, seperti yang dijelaskan sebelumnya dalam studi percontohan [25,26]. Dengan menilai perubahan dalam homeostasis ionik yang disebabkan oleh pemblokiran Nat/K plus -ATPase dan tingkat ekspresi gen terkait, kami mengungkapkan bahwa tidak adanya analisis yang diinduksi ouabain mungkin dimediasi oleh peningkatan efektivitas kompensasi K plus impor di senescent END- MSC dibandingkan dengan A549 tua. Lebih lanjut, menggunakan bioinformatika canggih, kami menunjukkan bahwa penuaan END-MSCs, yang resisten terhadap analisis yang diinduksi ouabain, disertai dengan perolehan fenotipe yang resisten apoptosis, sedangkan penuaan A549 yang sensitif terhadap ouabain tidak. Yang penting, memblokir aktivitas protein antiapoptotic MCL-1 sebelum pengobatan glikosida jantung menghasilkan analisis END-MSCs tua yang resisten apoptosis. Oleh karena itu, kami memberikan bukti yang jelas bahwa resistensi-apoptosis bukanlah ciri umum sel-sel tua. Berdasarkan data yang diperoleh, kami menyimpulkan bahwa efektivitas pendekatan analitik mungkin bergantung pada apakah sel memang menjadi resisten apoptosis selama perkembangan penuaan.

Bahan dan metode

Sel

END-MSCs, WJ-MSCs, DP-MSCs, AD-MSCs, A549, dan SK-Help diperoleh dari Koleksi Kultur Sel Rusia (Institute of Cytology, Saint-Petersburg, Russia). Garis A549 dan SK-Help diautentikasi dengan tes kariologi, tumorigenisitas, isoenzim (LDH dan G6PD), dan analisis STR. Sel dikultur dalam media lengkap DMEM F12 (Gibco BRL) yang dilengkapi dengan 10 persen FBS (HyClone), 1 persen penisilin-streptomisin (Gibco BRL) dan 1 persen glutamat (Gibco BRL). Semua sel secara rutin diuji untuk kontaminasi mikoplasma.

Kondisi penuaan dan pemicu stres

Untuk penuaan yang diinduksi stres oksidatif, END-MSCs / WJ-MSCs diperlakukan dengan 200 uM / 100 uM H O (Sigma) selama 1 jam. Untuk penuaan yang diinduksi doxorubicin, DP-MSCs/A549 diobati dengan 1 M doxorubicin Veropharm） selama 3 hari. Dalam setiap kasus, sel dianggap senescent tidak lebih awal dari 14 hari setelah pengobatan. Untuk penuaan replikatif AD-MSC lebih awal dari bagian ke-4 diidentifikasi sebagai sel kontrol dan lebih lambat dari tanggal 10 sebagai sel yang sudah tua. Untuk penuaan yang diinduksi etoposide, A549/END-MSCs/SK-Help diobati dengan 2 uM/5 uM/3 uM etoposide (Veropharm) selama 3 hari dan dianalisis tidak lebih awal dari 7 hari setelah induksi penuaan. Dalam hal ini, desain perawatan sepenuhnya bertepatan dengan yang dijelaskan dalam penelitian dari mana data RNA-seq berasal (Wang et al., 2017). Dua glikosida jantung yang kami aplikasikan sebagai senyawa senolitik——Ouabain (Sigma) dan Bufalin (Calbiochem).

Untuk membandingkan ketahanan stres antara kontrol dan END-MSC atau A549 yang sudah tua, sel diperlakukan dengan 400/800 uM H O2 (Sigma) selama 1 jam atau dengan 0,3/1 uM staurosporin (Sigma). Viabilitas sel dianalisis 48 jam setelah induksi stres.

Untuk memblokir aktivitas MCL-1, END-MSC diberi perlakuan awal dengan 10 uM A-1210477(Sigma) selama 3 hari.

KSL29

Analisis aliran sitometri

Pengukuran viabilitas sel, proliferasi, ukuran sel, autofluoresensi, laju apoptosis, pembelahan caspase 3/7, potensial membran mitokondria, dan depolarisasi membran dilakukan dengan flow cytometry. Flow cytometry dilakukan dengan menggunakan CytoFLEX (Beckman Coulter) dan data yang diperoleh dianalisis menggunakan software CytExpert versi 2.0. Sel-sel yang melekat dibilas dua kali dengan PBS dan dipanen dengan tripsinisasi. Sel-sel yang terlepas dikumpulkan dan disuspensikan kembali dalam media segar dan kemudian dihitung dan dianalisis untuk autofluoresensi. Untuk mengakses viabilitas sel, 50ug/ml propidium iodida Life Technologies） ditambahkan ke setiap sampel sebelum analisis. Ukuran sel dievaluasi dengan hamburan cahaya maju sitometrik dari sel PI-negatif. Induksi apoptosis diverifikasi menggunakan pewarnaan bersama Annexin-V-APC (Invitrogen) dan DAPI (Sigma) mengikuti instruksi pabrik. Aktivitas caspase dinilai menggunakan CellEventTM Caspase-3/7 Green Flow Cytometry Assay Kit (Invitrogen) mengikuti protokol pabrik. Hilangnya potensi membran mitokondria dinilai menggunakan pewarna rasiometrik JC-1 (Invitrogen). Prosedur pewarnaan dilakukan sesuai dengan protokol pabrikan. Untuk depolarisasi membran, kami menggunakan probe fluoresen DiBAC4(3) (Invitrogen).

Pewarnaan -galaktosidase terkait penuaan

Pewarnaan terkait penuaan -Galaktosidase (SA- -Gal) dilakukan menggunakan kit pewarnaan penuaan -galaktosidase (Teknologi Pensinyalan Sel) sesuai dengan instruksi pabrik. Analisis kuantitatif gambar dihasilkan dengan aplikasi paket MatLab, sesuai dengan algoritma yang dijelaskan sebelumnya[41]. Untuk setiap titik percobaan, tidak kurang dari 50 sel yang dipilih secara acak dianalisis.

blotting barat

Western blotting dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [41]. Elektroforesis SDS-PAGE, transfer ke membran nitroselulosa, dan imunoblotting dengan deteksi ECL (Thermo Scientific) dilakukan sesuai dengan protokol standar pabrikan (Laboratorium Bio-Rad). Antibodi terhadap protein berikut digunakan: gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH)(klon 14C10), fosfo-p53(Ser15), p21(klon 12D1), fosfo-Rb (Ser807/811) , HMGB1(klon D3E5), serta IgG antirabbit kambing terkonjugasi peroksidase lobak. Tingkat pengenceran adalah 1:1000 untuk semua antibodi primer dan 1:7000 untuk antibodi sekunder. Semua antibodi dibeli dari Cell Signaling. Scion Image 4.0 (Scion Corporation) digunakan untuk memilih dan menentukan kerapatan pita yang dikurangi latar belakang di semua gel dan noda.

Analisis transkriptomik

Sampel dari tiga set data Gene Expression Omnibus (GEO)RNA-seq berikut digunakan dalam analisis: GSE102639(GSM2742113-GSM2742114 dan GSM2742121-GSM2742122untuk sel kontrol dan senescentA549, karenanya); GSE122081(GSM3454482-GSM3454484 dan GSM3454500-GSM3454502 untuk sel kontrol dan IMR tua-90; dan dataset kami GSE160702 (GSM4877895-GSM4877898 dan GSM4877907-GSM4877910 untuk kontrol dan END-MSC tua). Data untuk semua kumpulan data diproses dengan cara yang sama.

Data pembacaan mentah menjalani penyaringan kualitas dan pemangkasan adaptor melalui skrip FilterByTile dan BBDuk dari paket BBtools (versi 38.75) menggunakan opsi default. Bacaan yang tersisa juga disaring dan dipangkas dengan menggunakan skrip trimester dari paket FastqPuri (versi 1.0.7).cistanche InggrisOperasi pemangkasan diterapkan untuk kedua ujung bacaan jika mengandung N atau kualitasnya di bawah ambang batas kualitas yang ditetapkan ke 27, semua bacaan yang lebih pendek dari 25 basis dibuang. Kontrol kualitas pemangkasan dilakukan dengan perangkat lunak FastQC (versi 0.11.7) dan skrip FastqPuri. Pembacaan, setelah melewati semua operasi, terdiri tidak kurang dari 90 persen dari data awal.

Kelimpahan transkrip diperkirakan menggunakan pemetaan ringan Salmon (versi 1.1.0) yang berjalan dalam mode penyelarasan selektif. Daftar umpan dihasilkan berdasarkan genom referensi manusia Gencode GRCh38.p13 (rilis 33) dan digunakan lebih lanjut untuk membangun indeks pada file referensi transkriptom dan genom gabungan Gencode (rilis 33) menggunakan ukuran kmer 21. Operasi pemetaan dijalankan dengan flag tambahan——numBootstraps 30——payet——gcBias——memvalidasi pemetaan. Tingkat pemetaan yang dihasilkan sekitar 70 persen.

KSL30

Pemrosesan data lebih lanjut dilakukan menggunakan R versi 3.6.3 dengan kumpulan paket Tidyverse (versi 1.3.0). Perkiraan jumlah gen, metadata, dan rentang transkrip dimuat ke dalam R dan diringkas ke tingkat gen menggunakan tximeta (versi 1.4.5). Matriks jumlah yang dihasilkan disaring untuk memuat baris yang memiliki setidaknya 5 perkiraan jumlah di semua sampel, matriks yang dihasilkan berisi 20.400 gen.

Untuk representasi PCA dan peta panas, jumlah pembacaan dinormalisasi menggunakan transformasi log dari paket DESeq2 (versi 1.26.0).cistanche wirkungPeta panas dibuat dengan menggunakan paket filter gen (versi 1.38.0) dan peta panas(versi 1.0.12)R. Validasi sampel divisi berdasarkan variabel penuaan dilakukan melalui subset jumlah baca yang dinormalisasi oleh gen yang terkait dengan istilah Ontologi Gen "Penuaan Seluler"(GO 0090398). Analisis ekspresi diferensial dan estimasi perubahan lipatan log dihitung menggunakan DESeq2 untuk variabel terakhir dalam formula desain yang mengontrol status penuaan sel, reaksi pengobatan ouabain, dan interaksi faktor-faktor yang ditunjukkan. Untuk memperkuat pengujian ekspresi diferensial, koreksi perubahan lipatan log menggunakan kombinasi penaksir penyusutan adaptif dari paket palm (versi 1.8.0) dan menetapkan ambang batas perubahan lipatan log tambahan yang sama dengan 0,667 diterapkan. Estimasi menyusut yang dihasilkan digunakan lebih lanjut untuk peringkat gen dan menjalankan Analisis Pengayaan Gen Set menggunakan profil cluster (versi 3.14.3) dan paket sekering (versi 1.12.0)R dengan nilai p yang disesuaikan untuk beberapa perbandingan menurut metode Benjamin-Hochberg. Sampel microarray Affymetrix untuk kontrol dan AD-MSC senes-sen diperoleh dari database GEO (GSE66236) dan diproses dengan aplikasi web Phantasus dengan normalisasi log2 dan hitungan kuantil. Analisis Pengayaan Gen Set dilakukan dengan menggunakan paket sekering (versi 1.12.0)R.

Ekstraksi RNA, transkripsi terbalik, dan PCR waktu nyata

Ekstraksi RNA, transkripsi terbalik, dan PCR real-time dilakukan seperti yang dijelaskan dalam penelitian kami sebelumnya [32]. Reagen untuk ekstraksi RNA (ExtractRNA reagen), reverse transcription (MMLV RT kit), dan real-time PCR (HS SYBR kit) diperoleh dari Evrogen. Tingkat ekspresi gen dinilai menggunakan real-time PCR BioRad CFX-96 amplifier (BioRad) dengan program berjalan berikut untuk semua gen yang diselidiki: 40 siklus peleburan selama 10 detik pada 95 derajat, anil selama 15 detik pada 57,5 derajat , dan sintesis selama 15 detik pada 72 derajat . Analisis kurva leleh diterapkan untuk mengontrol spesifisitas reaksi. Analisis data yang diperoleh berikut ini dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Bio-Rad CFX Manager (BioRad) dengan metode kuantifikasi 2deltaCt standar dengan menggunakan ekspresi GAPDH sebagai referensi. Urutan primer tercantum dalam Tabel 1.

Analisis statistik

Untuk mendapatkan signifikansi perbedaan antara kedua kelompok digunakan uji-t Student atau uji-t Welch. Untuk beberapa perbandingan antar kelompok, ANOVA dengan HSD Tukey digunakan. Kecuali dinyatakan lain, semua data kuantitatif ditampilkan sebagai mean±SD dan tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan sebagai berikut: ns, tidak signifikan,*p<0.05,><><0.001. statistical="" analysis="" was="" performed="" using="" r="">

Hasil

H2O2-MSC END yang dirawat memasuki penuaan dini

Dalam penelitian ini, kami menggunakan sel punca mesenkim manusia yang diisolasi dari deskuamasi endometrium (END-MSCs), yang memenuhi kriteria minimum yang disarankan oleh ISCT untuk mendefinisikan hMSCs [41]. Sebelumnya, kami telah mengembangkan model eksperimental yang andal untuk mempelajari berbagai aspek penuaan dini END-MSCs [30]. Yaitu, kami telah menunjukkan bahwa END-MSC yang mengalami stres oksidatif subletal secara bertahap memperoleh semua fitur khas sel tua, termasuk fokus kerusakan DNA persisten dan respons kerusakan DNA aktif, penghentian siklus sel ireversibel yang dimediasi oleh p53/p21/Rb klasik jalur, hilangnya proliferasi, hipertrofi sel, munculnya SA- -Pewarnaan Gal dan perkembangan fenotipe sekretori terkait penuaan [30, 32, 42]. Di sini kami menerapkan model yang dirancang untuk mempelajari efek senolitik ouabain serta untuk mengungkapkan perubahan intraseluler yang mendasari homeostasis ion. Awalnya, dengan memperkirakan parameter yang paling umum, kami mengkonfirmasi bahwa pengobatan dosis tunggal 1 jam, 200 M H O sudah cukup untuk menginduksi penuaan pada END-MSCs. Yang penting, END-MSC yang stres dianggap tua dua minggu setelah stres oksidatif; oleh karena itu, semua penanda penuaan dinilai tidak lebih awal dari 14 hari setelah pengobatan H-Oz. Memang, pengobatan H-Oz END-MSC menyebabkan blok proliferasi, hipertrofi sel seperti yang ditunjukkan oleh peningkatan ukuran sel, akumulasi lipofuscin yang terdeteksi oleh peningkatan autofluoresensi, munculnya SA- -Gal, aktivasi Jalur p21/Rb dan hilangnya HMGB1 bersama-sama mendukung pembentukan penuaan di bawah kondisi eksperimental yang dipilih (Gbr. ac, e, f).

Efek paling berbahaya dari sel-sel tua pada tingkat jaringan dan organisme diyakini sebagai konsekuensi dari vitalitas mereka yang berkepanjangan. Sejalan dengan poin ini, END-MSC yang dirawat dengan H O mempertahankan viabilitas tinggi bahkan pada tahap akhir perkembangan penuaan (viabilitas END-MSC tua dinilai 17 hari (14 hari ＋ 3 hari) setelah stres oksidatif awal) (Gbr.1d ). Singkatnya, pengobatan sublethal HO2-pada END-MSCs adalah model yang tepat dari penuaan dini dan relevan untuk menyelidiki efek senyawa senolitik pada END-MSCs.

Glikosida jantung ouabain tidak memiliki aktivitas senolitik terhadap END-MSC tua dalam rentang konsentrasi yang luas

Bukti terbaru menunjukkan bahwa glikosida jantung, termasuk ouabain, digoxin, dan bufalin, mewakili keluarga senyawa dengan aktivitas hemolitik [25,26]. Meskipun glikosida jantung saat ini dianggap sebagai senolitik spektrum luas, data mengenai efeknya pada hMSC tua masih kurang. Oleh karena itu, di sini kami menguji apakah ouabain memiliki potensi untuk menginduksi kematian secara selektif pada END-MSC yang sudah tua. Untuk melakukannya, kami menilai viabilitas kontrol dan END-MSC senes-cent setelah pengobatan dengan ouabain pada rentang konsentrasi yang luas (dari 10-' hingga 10~ M). Menariknya, tidak ada konsentrasi yang diterapkan menyebabkan penurunan nyata dalam kelangsungan hidup sel kontrol dan sel tua pada hari pertama setelah aplikasi ouabain (Gbr.2 dan Gambar Tambahan S1).

Namun, pada hari ketiga setelah pengobatan ouabain, kami mengungkapkan penurunan tergantung dosis yang signifikan dalam kelangsungan hidup kontrol END-MSCs (Gbr. 2a dan Gambar Tambahan. S1). Di luar dugaan, sel-sel tua ternyata lebih tahan terhadap ouabain pada setiap konsentrasi yang diuji. Sejalan dengan hasil ini,10-M ouabain menyebabkan kematian apoptosis yang lebih rentan pada sel kontrol (20,75 persen An plus /PI-dan 36,47 persen An plus /PI plus ) dibandingkan dengan sel tua (15,01 persen An＋/PI -dan 12,15 persen An plus /PI plus )(Gbr.2b). Hasil yang diperoleh dengan jelas menunjukkan bahwa dalam konteks END-MSC tua, ouabain tidak memiliki aktivitas senolitik.

Untuk mengecualikan kemungkinan efek yang terkait dengan variabilitas rangsangan pemicu penuaan pada tindakan senolitik ouabain, kami melakukan serangkaian eksperimen tambahan. Yaitu, kami memperlakukan END-MSCs dengan etoposide alih-alih stres oksidatif untuk menginduksi penuaan dini.bioflavonoid jerukEND-MSC yang diobati dengan etoposide menampilkan semua fitur yang khas untuk sel tua (Gbr.3a-e).

Yang penting, ouabain tidak memiliki tindakan hemolitik terhadap END-MSC tua yang diobati dengan etoposide (Gbr. 3f dan Gambar Tambahan S2). Data ini memberikan konfirmasi tambahan untuk hasil di atas dan bukti bahwa kurangnya analisis yang diinduksi ouabain bukanlah konsekuensi dari pemicu penuaan beton yang digunakan untuk menginduksi penuaan.

Gbr.1 Validasi model penuaan dini END-MSC yang diinduksi stres oksidatif. Senescent END-MSCs proliferasi longgar, b mengalami hipertrofi, c memperoleh peningkatan autofluoresensi, mempertahankan viabilitas sel yang tinggi d dan e menampilkan aktivitas SA- -Gal dibandingkan dengan yang kontrol. f Tingkat fosforilasi p53 dan Rb dan tingkat ekspresi protein p21 dan HMGBI dalam kontrol dan tua END-Ouabain tidak memiliki tindakan hemolitik terhadap sel punca mesenkim manusia dari berbagai asal Untuk memperluas pengamatan kami mengenai tidak adanya analisis yang diinduksi ouabain di END-MSCs , kami menganalisis efek ouabain pada hMSC yang diisolasi dari sumber lain termasuk jaringan adiposa, pulpa gigi, dan jeli Wharton. Untuk lebih memperkuat data kami, kami menerapkan model penuaan yang berbeda——penuaan replikatif untuk AD-MSC, penuaan yang diinduksi doxorubicin untuk DP-MSC, dan penuaan yang diinduksi stres oksidatif untuk WJ-MSC (Gbr.4a-f).

Seperti yang ditunjukkan pada Gbr.4g, berbagai jenis hMSC berbeda dalam viabilitas pada pengobatan ouabain, misalnya, DP-MSC kontrol dan tua jauh lebih tahan terhadap aksi ouabain daripada WJ-MSC (Gbr.4g dan Gambar Tambahan. S3b, c). Namun demikian, ouabain tidak mampu menginduksi senolisis pada kedua jenis hMSC tua (Gbr. 4g dan Gambar Tambahan. S3). Bersama-sama, data yang diperoleh menunjukkan tidak adanya analisis yang diinduksi ouabain adalah fitur umum untuk berbagai jenis hMSC. MSC. Nilai yang disajikan adalah mean±SD. Untuk beberapa perbandingan kelompok pada a dan d, diterapkan ANOVA satu arah, n=3, ns tidak signifikan,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="">

GAPDH digunakan sebagai kontrol pemuatan

Bufalin glikosida jantung gagal membunuh END-MSCS yang sudah tua

Untuk memverifikasi tidak adanya aksi senolitik glikosida jantung terhadap hMSC, kami menerapkan bufalin, senyawa lain dengan aktivitas senolitik yang dinyatakan milik keluarga glikosida jantung [25]. Bufalin hampir tidak berpengaruh pada kelangsungan hidup kontrol dan H2O2-MSC END-sensen yang diolah dalam rentang konsentrasi yang luas (dari 10-7 hingga 10-5 M) (Gbr. 5a dan Tambahan Gambar. S4a).

Mirip dengan apa yang kami amati untuk pengobatan ouabain, tidak adanya analisis pada bufalin tidak tergantung pada rangsangan yang memicu penuaan, karena kelangsungan hidup ESC yang mengalami penuaan baik sebagai respons terhadap stres oksidatif atau etoposide tidak terpengaruh (Gbr. 5a, b, Gambar Tambahan). .S4a, b). Hasil yang dijelaskan di atas mengkonfirmasi bahwa glikosida jantung ternyata tidak efektif untuk induksi kematian yang ditargetkan pada END-MSC yang sudah tua. MSC. Nilai yang disajikan adalah mean±SD. Untuk beberapa perbandingan kelompok pada a dan d, diterapkan ANOVA satu arah, n=3, ns tidak signifikan,***p<0.001. for="" pair="" comparisons="" at="" b,c="" and="" e="" welch's="" t-test="" was="" used,n="3" for="" b="" and="" c,n="50" for=""><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" um.="" gapdh="" was="" used="" as="" a="" loading="">

Bufalin glikosida jantung gagal membunuh END-MSCS yang sudah tua

Gbr.2 Ouabain tidak memiliki aktivitas hemolitik terhadap HO2-END-MSC yang dirawat dengan H2O dalam rentang konsentrasi yang luas. Viabilitas sel relatif ( persen ) dari kontrol dan END-MSC senescent dalam 3 hari setelah pengobatan dengan 1077,10~6,10-5 M ouabain. b Induksi apoptosis pada END-MSCs setelah 10-6 M ouabain dinilai dengan pewarnaan ganda Annexin V/DAPI. n=3 eksperimen independen. Semua data sesuai dengan mean±SD. Signifikansi statistik dinilai dengan uji-t Welch: ns tidak signifikan,***p<>

Baik glikosida jantung ouabain dan bufalin mampu menginduksi kematian sel secara selektif dalam sel A549 dan SK-Hep1 yang sudah tua

Mempertimbangkan fakta bahwa hasil kami tidak sesuai dengan bukti yang baru-baru ini diterbitkan mengenai aksi senolitik spektrum luas dari glikosida jantung, kami memutuskan untuk mereproduksi efek ini menggunakan model seluler yang dijelaskan dalam studi yang relevan [25,26]. Dengan demikian, kami melakukan serangkaian percobaan menggunakan kontrol dan sel karsinoma paru A549 tua. Penuaan dalam sel A549 diinduksi oleh pengobatan etoposida. Penuaan sel A549 yang diinduksi oleh etoposide adalah model yang sering digunakan dan dengan demikian dicirikan dengan baik dari penuaan yang diinduksi oleh terapi [4]. Juga, ouabain terbukti secara selektif membunuh sel A549 tua yang diobati dengan etoposide [25]. Untuk membuktikan penuaan pada A549, kami menilai tingkat proliferasi, ukuran sel, akumulasi lipo-fine, SA - - pewarnaan Gal, status aktivasi dari jalur p53/p21/Rb, dan tingkat ekspresi HMGB1 (Gbr. 6a-e).

Untuk memverifikasi aktivitas hemolitik ouabain terhadap sel kanker tua, pertama-tama kami memperkirakan viabilitas sel yang bergantung pada dosis. Sejalan dengan hasil kami yang dijelaskan di atas, kami tidak dapat mendeteksi penurunan yang signifikan dalam jumlah sel kontrol yang layak atau sel A549 tua dalam 24 jam setelah aplikasi ouabain (Gambar Tambahan S5a). Namun, dalam 3 hari setelah pengobatan ouabain secara signifikan mengurangi viabilitas sel A549 tua dengan cara yang bergantung pada dosis, sementara jumlah sel A549 kontrol menurun ke tingkat yang jauh lebih rendah (Gbr.7a dan Gambar Tambahan. S5a). Yaitu, sekitar 90 persen sel kontrol mempertahankan viabilitas pada 10- M ouabain dibandingkan dengan 50 persen sel A549 tua yang diobati dengan dosis yang sama (Gbr.7a). Selain itu, sel A549 tua lebih rentan terhadap kematian sel yang diinduksi bufalin daripada rekan kontrolnya (Gbr.7b) (Gbr.5b dan Gambar Tambahan S5b).

Menurut data yang dipublikasikan, ouabain memicu caspase-3-apoptosis yang bergantung pada sel A549 tua [26]. Memang, kami mengungkapkan peningkatan yang signifikan dalam fraksi positif ganda dan/atau PI dalam sel kanker tua yang diobati dengan 10-6M ouabain (Gbr.7c). Selanjutnya, dengan menggunakan uji fluoresen, kami mengamati aktivasi caspase-3 dalam sel A549 tua yang dirawat dengan ouabain (Gbr.7d). Secara keseluruhan, hasil ini sepenuhnya konsisten dengan data yang dijelaskan oleh penulis lain dan mengkonfirmasi aktivitas hemolitik ouabain terhadap A549.

Juga, kami menggunakan doxorubicin daripada etoposide untuk menyebabkan penuaan pada A549 (Gbr.8a-e). Seperti yang diharapkan, A549 tua yang diobati dengan doxorubicin, serta diobati dengan etoposida menunjukkan sensitivitas yang lebih tinggi baik terhadap ouabain dan bufalin dibandingkan dengan rekan kontrol mereka (Gbr. 8g dan Gambar Tambahan S6). Yang terakhir menegaskan bahwa efek senolitik glikosida jantung tidak tergantung pada rangsangan yang menginduksi penuaan. Dengan demikian, glikosida jantung memang memiliki senolitik

Gbr.3 Ouabain tidak dapat menginduksi senolisis pada END-MSC tua yang diobati dengan etoposide. Validasi model penuaan yang diinduksi episode untuk END-MSC: kemampuan proliferasi, ukuran sel b, tingkat autofluoresensi c dan aktivitas d SA- -Gal, tingkat fosforilasi Rb dan tingkat ekspresi protein p21 dan HMGBI. f Viabilitas sel relatif ( persen ) dari sel kontrol dan sel tua setelah pengobatan dengan 10-6 ouabain. Nilai adalah mean±SD. Untuk perbandingan beberapa kelompok pada ANOVA satu arah diterapkan, n=3, ns tidak signifikan,***p<0.001.for pair="" comparisons="" at="" b,c,d,f="" welch's="" t-test="" was="" used,="" n="3" for="" b,="" c,f="" n="50" for="" d,="" ns="" not="" significant,=""><0.05,><0.001. scale="" bars="" for="" images="" are="" 500="" μm.="" gapdh="" was="" used="" as="" loading="" control="" activity="" towards="" a549,="" but="" these="" compounds="" turned="" out="" to="" be="" ineffective="" for="" targeted="" death="" induction="" in="" senescent="">

Akhirnya, kami memutuskan untuk mereproduksi eksperimen analisis pada sel kanker hati yang diobati dengan etoposide SK-Help, model sel lain dengan efek senolitik yang terbukti dari glikosida jantung menurut Guerrero et al. studi [25] (Gbr.9a-e). SK-Help tua yang diobati dengan etoposide menunjukkan sensitivitas yang lebih tinggi terhadap kedua agen dibandingkan dengan rekan kontrol mereka, membuktikan aksi hemolitik glikosida jantung terhadap jenis sel ini (Gbr.9f dan Gambar Tambahan. S7).

Bersama-sama data ini membuktikan bahwa selektivitas hemolisis yang diinduksi oleh glikosida jantung lebih bergantung pada sifat sel daripada pada pemicu penuaan beton.

Artikel ini disarikan dari Cellular and Molecular Life Sciences (2021) 78:7757–7776 https://doi.org/10.1007/s00018-021-03980-x