Efek Pemutih Kulit Ectoine Melalui Penekanan Melanogenesis yang Dirangsang -MSH Dan Aktivasi Jalur Antioksidan Nrf2 pada Keratinosit yang Disinari UVA

Kontak: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:{0}}

You-Cheng Hseu 1,2,3,4, Xuan-Zao Chen 1, Yugandhar Vudhya Gowrisankar 1,Hung-Rong Yen 3,4,5,6, Jing-Yuan Chuang 7 dan Hsin-Ling Yang 8,*

Abstrak:Ultraviolet A (UVA)-produksi spesies oksigen reaktif (ROS) yang diinduksi radiasi memediasi berlebihanmelanogenesisdalam sel-sel kulit yang menyebabkan pigmentasi. Kami mendemonstrasikan efek depigmentasi dan anti-melanogenik dari Ectoine, osmolit bakteri alami, dalam keratinosit manusia yang disinari UVA (HaCaT), dan mekanisme molekuler yang mendasarinya telah dijelaskan. Sel HaCaT diberi perlakuan awal dengan ektoin konsentrasi rendah (0.5-1,5 M) dan diuji untuk berbagai parameter depigmentasi dan anti-melanogenik. Pra-perawatan ini secara signifikan menurunkan regulasi generasi ROS, produksi hormon perangsang -melanosit (-MSH), dan ekspresi proopiomelanocortin (POMC) dalam sel HaCaT yang disinari UVA. Juga,antioksidanheme oksigenase-1 (H2O-1),NAD(P)H dehidrogenase [quinone 1] (NQO-1), dan -glutamat-sistein ligase catalytic subunit( -GCLC) ekspresi protein dimediasi melalui translokasi nuklir faktor nuklir eritroid2-terkait faktor 2 (Nrf2) yang knockdownnya memang mengganggu efek ini yang menandakan pentingnya jalur Nrf2. Ectoine memediasi aktivasi Nrf2 melalui jalur p38, protein kinase B (juga dikenal sebagai AKT), protein kinase C (PKC), dan kasein kinase II protein kinase (CKII). Media terkondisi yang diperoleh dari sel HaCaT pra-perlakuan Ectoine dan UVA menurunkan regulasitirosinase, protein terkait tirosinase-1 dan -2 (TRP-1/-2), protein kinase AMP siklik (c-AMP), protein pengikat elemen c-AMPresponse (CREB ), dan ekspresi faktor transkripsi terkait mikroftalmia (MITF) yang mengarah ke sel melanoma B16F10 yang menghambat sintesis melanin. Menariknya, efek anti-melanogenik dalam sel B16F10 yang dirangsang -MSH ini hanya dapat diamati pada 50-400 Mkonsentrasi Ectoine, menandakan peran kunci yang dimainkan oleh keratinosit yang diobati dengan Ectoine (0,5-1 M) di kulit.pemutihefek. Kami menyimpulkan bahwa Ectoine dapat digunakan sebagai agen kosmetik alami topikal yang efektif dengan kemanjuran depigmentasi dan anti-melanogenik.

Kata kunci:ektoin; keratinosit;melanogenesis; tirosinase; -MSH; Nrf2

Cistanche memiliki efek anti-oksidasi.

1. Perkenalan

Mengekspos kulit manusia pada radiasi UVA memicu pembentukan ROS dan juga memproduksi melanin secara berlebihan di dalam sel-sel kulit. Produksi ROS yang tidak terkontrol dapat menyebabkan kondisi melanoma juga. Kebanyakan agen pemutih kulit menargetkan dan mencoba meminimalkanmelanogenesisproses melalui penghambatan -MSH dantirosinaseproduksi [1]. Kebanyakan krim pencerah warna kulit terdiri dari hidrokuinon [2] atau hidrokortison [3], yang diketahui dapat menurunkan pembentukan melanin butare juga terkait dengan efek samping yang parah. Misalnya, jerawat, kulit bersisik dan gatal, perubahan warna kulit menjadi biru dan hitam, ochronosis, iritasi kulit seperti terbakar dan menyengat, bahkan peradangan.pemutihagen dari sumber alami, misalnya, asam Kojic (turunan jamur yang diperoleh dari spesies Penicillium dan Aspergillus) juga dilaporkan menyebabkan 'dermatitis kontak' pada individu yang memiliki kulit sensitif. Pada orang-orang ini, lebih dari 1 persen asam kojic dapat menyebabkan efek samping hipersensitif yang parah [4,5]. Oleh karena itu, hanya beberapa kulit yang diturunkan secara alamipemutihproduk (oleosin, ekstrak licorice, asam askorbat, protein kedelai, N-asetil glukosamin, dll) saat ini sedang digunakan dalam industri kosmetik [6]. Namun, produk perawatan kulit yang pada prinsipnya menargetkan sifat depigmentasi terkadang gagal untuk fokus dalam menangkal efek buruk yang ditimbulkan oleh produksi ROS yang dimediasi oleh radiasi UVA.melanogenesisdalam sel kulit.

Ectoine adalah 'ekstremolyte alami' yang dihasilkan dari beberapa spesies mikroorganisme dalam kondisi stres [7,8]. Senyawa ini pertama kali diisolasi dari spesies bakteri Ectothiorhodospira yang hidup di gurun Mesir. Kaskade gen ect operon (ectA, ectB, ectC, atau ectD) terlibat dalam produksi senyawa ini. Ektoin secara kimia disebut sebagai 1,4,5,6-tetrahidro-2-metil-4-asam pirimidinkarboksilat [9]. Sebagai pengikat kelembaban, Ectoine membantu dalam, restrukturisasi membran sel kulit [10], perlindungan dari kerusakan dan polusi UV [11,12], melembabkan kulit [13], menunda penuaan kulit dini [14], dll. Selain itu untuk peran pelindung kulit, Ectoine telah terbukti berguna dalam pengobatan dermatitis atopik [15], Alzheimer [16], serta penghambatan replikasi HIV [17], radio dan kemoterapi [18], dan sirosis hati [ 19].Ektoin berspekulasi untuk menunjukkan sifat depigmentasi dan pemutih kulit tanpa menyebabkan efek samping yang tidak diinginkan [20]. Sebaliknya, mekanisme molekuler yang ditimbulkan oleh Ectoine tidak diketahui. Oleh karena itu, tujuan dari penelitian ini adalah untuk menggambarkan depigmentasi yang dimediasi oleh Ectoine dan mekanisme anti-melanogenik yang ditimbulkan pada keratinosit manusia yang diiradiasi UVA (HaCaT) sebagai sistem model seluler. Efek dari sekresi agen pelindung kulit yang diinduksi Ectoine dari sel HaCaT ke media kultur (media terkondisi) juga diuji menggunakan garis sel melanoma khas (B16F10) juga.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Reagen dan Antibodi

Ectoine (Produk no: 81619, kemurnian Lebih besar dari atau sama dengan 95 persen ) dibeli dari Sigma-Aldrich (Taufkichen, Jerman). Fetal bovine serum (FBS), penisilin/streptomisin, Dulbecco's modified Eagle'smedium (DMEM) dan l-glutamine dibeli dari Invitrogen/Gibco BRL (Carlsbad, CA,USA). l-DOPA, melanin, 3-4,5-dimetil-2-yl-2,5-difenil tetrazolium bromida (MTT), dan -MSH diperoleh dari Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, AS). N-acetylcysteine ​​(NAC) dan20,70-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH2-DA) diperoleh dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,USA). Semua inhibitor farmakologis yang diperlukan untuk JNK (SP600125), ERK1/2 (PD98059), p38 (SB203580), PKC (GF109203X), dan CKII diperoleh dari Calbiochem (La Jolla, CA, USA) PI3K/AKT inhibitor (LY294002) diperoleh dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Semua antibodi untuk POMC, CREB, -aktin,tirosinase, Nrf2, p-CREB, NQO-1, PKC, protein terkait ECH mirip Kelch-1 (Keap-1), danTRP-1, TRP-2 diperoleh dari Santa Cruz Biotechnology Inc. (Heidelberg, Jerman). Antibodi terhadap -GCLC dan HO-1 diperoleh dari Gene Tex Inc. (San Antonio, TX, USA). Kami memperoleh antibodi terhadap protein kinase c-AMP dan CKII dari Abcam (Cambridge, MA, USA). Histon, MITF, p-p38, p38, p-AKT, dan AKT diperoleh dari Teknologi Sinyal Sel (Beverly, MA, USA). Reagen deteksi chemiluminescence (ECL) yang ditingkatkan diperoleh dari Millipore, (Billerica, MA, USA). Semua reagen lainnya (pada tingkat HPLC) dibeli dari Sigma-Aldrich atau Merck & Co.,Inc. (Darmstadt, Jerman).

2.2. Budaya sel

Kami memperoleh sel HaCaT keratinosit kulit manusia yang diabadikan dan sel murine melanoma B16F10 dari Cell Line Services (CLS, Eppelheim, Jerman) dan American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA). Sel-sel dikultur dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10 persen FBS yang diaktifkan panas, 1 persen streptomisin/penisilin, dan 2 mM L-glutamin dalam inkubator yang dilembabkan yang dilengkapi dengan 5 persen CO2 pada 37 C.

2.3. Perawatan Sel dan Iradiasi UVA

Sebelum iradiasi UVA, sel-sel itu pra-perawatan dengan Ectoine (0.5-1,5 M selama 24 jam) atau kendaraan (PBS). Pasca inkubasi, sel yang dicuci dengan PBS diekspos ke 3 J/cm2 radiasi UVA (selama 27 menit, maks, 365 nm, tidak ada emisi yang terdeteksi di bawah 320 nm) menggunakan UV CROSS-LINKER CL-508 (UVItec,Cambridge, Inggris) (21).

2.4. Uji ROS intraseluler

Sel HaCaT diunggulkan dengan kepadatan 1,5 × 105 dalam ruang Lab Teck 8-yang mengandung DMEM yang dilengkapi dengan 10 persen FBS dan ditumbuhkan hingga 80 persen pertemuan. Sel-sel ini pertama kali dirawat dengan 1,5 M Ectoine, diikuti dengan paparan iradiasi UVA 3 J/cm2 selama waktu yang ditentukan. Sel dicuci dengan PBS dan metode DCFH2-DA digunakan untuk menentukan produksi ROS intraseluler menggunakan perangkat lunak solusi Perangkat Lunak Olympus untuk setiap kondisi [21].

2.5. Kuantifikasi Melanin

Dalam 6-well plate, sel murine melanoma B16F10 diunggulkan dengan kepadatan 2,5 × 105 sel/sumur. Sel-sel tersebut diberi perlakuan awal dengan 100, 200, dan 400 M Ectoine selama 2 jam tanpa atau adanya -MSH (1 M). Protokol yang digunakan untuk kuantifikasi melanin mengikuti metode yang dijelaskan sebelumnya [21]. Kami mengukur kandungan melanin dengan pembaca lempeng mikro ELISA dengan panjang gelombang serapan 470 nm.

cistanche menghambat melanin.

2.7. Western Blot

Sel HaCaT (1 × 106sel/10 cm piringan) atau sel B16F10 (1 × 106sel/10 cm piringan) telah diberi perlakuan awal dengan berbagai konsentrasi Ectoine (0,5, 1, dan 1,5 M) atau -MSH (1 M) diikuti dengan penyinaran jika tidak ada atau ada UVA selama waktu yang ditentukan. Sel-sel yang dicuci PBS dipanen, kandungan protein (nuklear dan sitosol) diisolasi setelah perawatan. Kemudian, sel-sel menjadi sasaran metode Western blot yang digunakan sebelumnya untuk penentuan ekspresi berbagai protein nuklir dan sitosolik [21].

2.8. Ekstraksi RNA dan RT-PCR

Ektoin pra-perawatan (1,5 M, 24 jam) sel HaCaT menjadi sasaran reagen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad) untuk isolasi RNA total dari sel-sel ini. 1 g RNA total dan reagen yang dipasok oleh kit SuperScript-III One-Step RT-PCR platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad) digunakan dalam percobaan PCR dengan instrumen PCR Bio-Rad iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA, Amerika Serikat). Primer maju dan mundur untuk Nrf2 yang digunakan adalah: F: 50-AAACCAGTGGATCTGCCAAC-30,R-50-GCAATGAAGACTGGGCTCTC-30. Primer maju dan mundur untuk GAPDH yang digunakan adalah: F: 50-GCATCCTGGGCTACACTGA-30, R: 50-CCACCACCCTGTTGCTGTA-30. Pada akhir percobaan, produk PCR dianalisis menggunakan gel agarosa 1 persen. Kemudian divisualisasikan dengan pewarnaan etidiumbromid. Sebagai pengendalian internal, kami menggunakan GAPDH [22].

2.9. Uji Imunofluoresensi

Sel HaCaT dikultur dengan kepadatan 1 × 104 sel/sumur dalam suplemen DMEM dengan 10 persen FBS dalam ruang Tek Lab 8-sumur (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Kami melakukan pra-perlakuan terhadap sel dengan 1,5 M Ectoine untuk waktu yang ditunjukkan diikuti dengan penyinaran tanpa atau adanya UVA. Sel-sel menjadi sasaran uji imunofluoresensi, yang menggunakan metode yang telah dijelaskan sebelumnya [21].

2.10. Analisis statistik

Kami menggunakan mean ± standar deviasi (mean ± SD) untuk semua hasil yang digunakan dalam penelitian ini. Semua data dianalisis dengan analisis varians (ANOVA), diikuti dengan uji Dunnett untuk perbandingan berpasangan dan disajikan sebagai mean ± SD tiga atau lebih eksperimen independen. Signifikansi statistik ditetapkan pada * p < 0.05;="" **="" p="">< 0.01;="" ***="" p="">< 0.001="" bila="" dibandingkan="" dengan="" sel="" kontrol="" yang="" tidak="" diberi="" perlakuan,="" dan="" #="" p="">< 0,05;="" ##="" p="">< 0,01;="" ###="" p="">< 0,001="" bila="" dibandingkan="" dengan="" sel="" hacat="" yang="" terpapar="" uva="" atau="" sel="" b16f10="" yang="" diberi="" perlakuan="">

3. Hasil

3.1. Ectoine Menghambat Generasi ROS yang Diinduksi UVA dalam Sel HaCaT

Pertama, kami menguji efek sitotoksik Ectoine (Gambar 1A) pada sel HaCaT yang disinari UVA. Data MTT kami menunjukkan bahwa jika dibandingkan dengan sel kontrol yang tidak diobati, Ectoine pra-perawatan (0.5-1,5 M) dan 3 J/cm2 sel HaCaT yang terpapar UVA tidak dapat menunjukkan penurunan selviabilitas yang signifikan (Gambar 1B). Selanjutnya, pretreatment Ectoine melemahkan kematian sel yang diinduksi UVA (3 J/cm2) dengan cara yang bergantung pada dosis (Gambar 1B). Selain data fluoresensi kami, yang menunjukkan bahwa, jika dibandingkan dengan sel kontrol, iradiasi UVA 3 J/cm2 dan perawatan Ectoine saja (1,5 M) secara signifikan meningkatkan kadar ROS sebesar 5- dan 2-kali lipat, masing-masing. Namun, dalam kasus tingkat ROS Ectoinepretreatment secara signifikan diturunkan dan kami dapat menyimpulkan bahwa Ectoine memilikiantioksidanefek terhadap radiasi UVA. Ini juga menginduksi tingkat basal ROS dalam sel HaCaT (Gambar 1C, D).

3.2. Ekspresi POMC dan -MSH yang Ditekan oleh Ectoine dalam Sel HaCaT yang Diiradiasi UVA

Keratinosit yang terpapar UVA dirangsang untuk POMC yang dimediasi ROS-p53 dan juga hormon peptida kecil -MSH yang diturunkan dari POMC [23]. Oleh karena itu, kami menentukan perubahan pola ekspresi -MSH, POMC, dan protein terkait lainnya dalam sel HaCaT pra-perawatan Ectoine dan kemudian memaparkannya ke UVA (3 J/cm2). Data Western blot menunjukkan bahwa upregulasi ekspresi -MSH dan POMC yang diinduksi UVA diturunkan regulasinya oleh pretreatment Ectoine; sedangkan, pengobatan Ectoine tanpa iradiasi UVA telah sepenuhnya menghambat ekspresi -MSH dan POMC dari sel HaCaT non-iradiasi (Gambar 2A). Kemudian, kami menguji efek 'media-terkondisi' (pelat 10 mL/100 mm), yang diperoleh dari sel HaCaT pra-perawatan Ectoine dan UVA yang diiradiasi, padamelanogenesissel melanoma B16F10. Gambar 2B menunjukkan media yang dikondisikan ini menurunkan regulasitirosinase, TRP-1, TRP-2, c-AMP protein kinase, p-CREB, CREB, dan tingkat MITF dalam sel B16F10.

3.3. Ekspresi Melanin dan Tyrosinase Ectoine Downregulated dalam Sel B16F10 yang Distimulasi -MSH

Sel melanoma B16F10 pertama kali dikenai konsentrasi Ectoine yang lebih tinggi dan efek sitotoksisitas ditentukan menggunakan uji MTT. Gambar 3A menunjukkan bahwa Ectoine tidak memiliki dampak signifikan pada kelangsungan hidup sel B16F10 pada konsentrasi yang lebih tinggi (100–400 M selama 72 jam). Namun, viabilitas sel tidak terpengaruh pada 24 dan 48 jam pengobatan Ectoine (data tidak ditampilkan). Oleh karena itu, konsentrasi ini digunakan untuk menentukan efek Ectoine pada -MSH-stimulatedmelanogenesisdalam sel B16F10. Data kuantifikasi melanin menunjukkan bahwa, dibandingkan dengan sel kontrol, pengobatan dengan -MSH (1 M) saja secara signifikan meningkatkan kadar melanin lebih dari 25 persen . Namun, dibandingkan dengan pengobatan -MSH saja, sel-sel yang terpapar pada peningkatan konsentrasi Ectoine (100-400 M pada 72 jam) tergantung dosis dan secara signifikan menurunkan persentase kandungan melanin dengan downregulation maksimum hanya 85 persen (atau 15 persen daripada yang tidak diobati. kontrol) diamati pada 400 M pretreatment Ectoine (Gambar 3B). Selain itu, data Western blot kami juga menunjukkan bahwa -MSH terstimulasitirosinase(24 jam) dan ekspresi p-CREB (2 jam) secara signifikan diturunkan regulasinya dengan meningkatnya konsentrasi pretreatment Ectoine dalam sel melanoma ini (Gambar 3C).

3.4. Ectoine Meningkatkan Ekspresi Protein H2O-1, NQO-1, dan -GCLC dalam Sel HaCaT

Untuk menentukan pengaruh waktu pada translokasi nuklir Nrf2 yang dimediasi oleh Ectoine dan ekspresi hilir protein H2O-1, NQO-1, dan -GCLC, sel HaCaT diekspos ke 1,5 M Ectoine dan protein seluler dipanen 0.5, 1, 2, 4, 8, atau 12 jam setelah perawatan Ectoine. Data Western blot menunjukkan bahwa kecuali untuk protein -GCLC, 1,5 M Ectoine menyebabkan ekspresi maksimum protein H2O-1, Nrf2, dan NQO-1 pada titik waktu 4 jam. -GCLC ditampilkan pada titik waktu 8 jam (Gambar 5A). Data yang diperoleh dari kurva waktu mengarahkan kami untuk menguji pengaruh konsentrasi ektoin pada ekspresiantioksidanprotein pada titik waktu 4 jam. Gambar 5B menunjukkan bahwa ketiga protein antioksidan menunjukkan ekspresi maksimum pada konsentrasi ektoin 1,5 M. Kemudian, efek pra-perlakuan Ectoine diuji pada ekspresi rasio Nrf2 dan Keap-1 dalam sel HaCaT yang disinari UVA. Analisis data Barat menunjukkan bahwa pra-perawatan dengan 1,5 M Ectoine menunjukkan peningkatan rasio Nrf2/Keap-1 dalam sel HaCaT yang disinari UVA (Gambar 5C). Kami juga melihat data yang konsisten dengan peningkatan ekspresi NQO Protein -1, HO-1, dan -GCLC dalam sel HaCaT pra-perlakuan Ectoine yang diiradiasi dengan UVA 3 J/cm2 (Gambar 5D). Data ini menyimpulkan bahwa pra-perawatan Ectoine memainkan peran protektif dalam sel HaCaT yang disinari UVA.

3.5. Berbagai Jalur Pensinyalan Terlibat dalam Aktivasi Nrf2 di Sel HaCaT yang Diperlakukan Ectoine

Kami menentukan jalur pensinyalan yang terlibat dalam translokasi nuklir Nrf2 yang dimediasi oleh Ectoine. Sel HaCaT telah diobati sebelumnya dengan inhibitor farmakologis jalur pensinyalan PI3K/AKT, ERK, p38, JNK, PKC, ROS, dan CKII, diikuti oleh 1,5 M Ectoine. Data Western blot dari Nrf2 nuklir menunjukkan bahwa jalur p38 MAPK, PI3K/AKT, PKC, dan CKII terlibat dalam mekanisme ini (Gambar 6A). Dari informasi yang diperoleh, kami juga menentukan efek pra-perawatan Ectoine pada peran yang dimainkan oleh jalur ini dalam ekspresi protein antioksidan. Gambar 6B menunjukkan bahwa penghambatan farmakologis jalur MAPK, p38, PI3K/AKT, CKII, dan PKC menurunkan regulasi ekspresi NQO-1, HO-1, dan -GCLCantioksidanprotein dalam sel HaCaT. Selain itu, waktu yang dibutuhkan untuk fosforilasi AKT, p38, dan ekspresi PKC dan CKII saat terkena Ectoine menunjukkan bahwa, kecuali untuk p-AKT, fosforilasi p38 dan ekspresi PKC dan CKII terjadi di kemudian hari. titik waktu saja (setelah 30 menit) (Gambar 6C). Dalam kasus AKT, fosforilasi diamati dari titik waktu 15 menit yang telah mencapai puncaknya pada 30 menit (Gambar 6C). Dalam kasus AKT, fosforilasi diamati dari titik waktu 15 menit yang telah mencapai puncaknya pada 30 menit (Gambar 6C). Hasil kumulatif ini menunjukkan bahwa jalur pensinyalan p38, AKT, PKC, dan CKII mengaktifkan translokasi nuklir yang dimediasi oleh Antioksidan Ectoine dari Nrf2 mengarah ke ekspresi protein antioksidan.

3.6. Efek Anti-Melanogenik yang Dimediasi Ectoine Ditekan karena Knockdown Nrf2

Peran Nrf2 dalam anti-melanogenesisditentukan dengan membungkam Nrf2 dalam sel HaCaT. Data dari Western blot menunjukkan bahwa sel knockdown Nrf2 yang terpapar 1,5 M Ectoine menunjukkan ekspresi minimum NQO-1, HO-1, dan -GCLCantioksidanprotein (Gambar 7A). Kemudian, kami menguji efek knockdown Nrf2 pada ekspresi level -MSH dalam sel HaCaT yang diradiasi UVA (3 J/cm2). Hasil Western blot menunjukkan bahwa untuk mengontrol sel yang ditransfeksi siRNA, penyinaran UVA signifikan dalam peningkatan regulasi ekspresi level -MSH dalam sel yang tidak terpapar Ectoine (Gambar 7B). Namun, 1,5 M Ectoine telah menekan efek ini. Untuk kasus lain, sel yang ditransfeksi dengan siNrf2 menunjukkan penurunan ekspresi level -MSH pada sel yang tidak diobati dan yang diobati (Gambar 7B). Mirip dengan data -MSH, data fluoresensi kami juga menunjukkan bahwa penyinaran UVA secara signifikan meningkatkan produksi ROS dalam sel siRNA kontrol Ectoine yang tidak diobati (Gambar 7C, D). Namun, efek ini ditekan secara signifikan ketika sel terpapar 1,5 M Ectoine. Di sisi lain, sel HaCaT yang ditransfeksi Nrf2 dan diradiasi UVA menunjukkan peningkatan sekitar 8-kali lipat tingkat ROS dibandingkan dengan sel yang ditransfeksi Nrf2 yang tidak diradiasi dengan UVA tetapi terpapar pengobatan Ectoine (Gambar 7C, D). Semua data ini menandakan peran protektif yang dimediasi oleh Ectoine yang dimainkan olehNrf2 dalam meminimalkan produksi melanin dalam sel HaCaT yang disinari UVA. Antioksidan 2020, 9, x FOR PEER REVIEW 11 dari 15 yang disinari dengan UVA tetapi terkena pengobatan Ectoine (Gambar 7C, D) . Semua data ini menandakan peran pelindung yang dimediasi Ectoine yang dimainkan oleh Nrf2 dalam meminimalkan produksi melanin dalam sel HaCaT yang disinari UVA.

manfaat cistanche: memutihkan kulit

4. Diskusi

Berbagai kulit-pemutihagen yang digunakan dalam industri kosmetik. Banyak dari agen ini berasal dari bahan kimia dan menderita keterbatasan menyebabkan berbagai efek samping termasuk kanker [24-26]. Oleh karena itu, identifikasi bahan pemutih kulit yang aman dan alami merupakan kebutuhan saat ini. Ectoine (Gambar 1A) telah diketahui digunakan sebagai bahan aktif dalam krim wajah dan bahan kosmetik lainnya. Ini bertindak sebagai agen pelembab kulit dan juga dianggap menunda penuaan kulit dini [27]. Hampir semua agen pemutih kulit yang dikenal menargetkan penurunan regulasitirosinaseaktivitas enzim dalam sel yang disinari UV yang menurunkanmelanogenesisdalam sel kulit.Yao et al. mendemonstrasikanpemutihsifat ectoine biosintesis dan menyarankan bahwa itu adalah agen pemutih aputatif. Dalam studi mereka, mereka menguji konsentrasi tinggi (500 µM) Ectoine untuk efek pemutihannya pada garis sel melanoma tikus (B16F0) dan melanoma manusia (A2058) dan menyimpulkan bahwa Ectoine aman dan agen potensial untuk aplikasi kosmetik dan klinis [20]. Namun, dalam penelitian ini, kami menguji lebih lanjut efek menguntungkan dari konsentrasi rendah Ectoine (0,5-1,5 M) pada sel HaCaT yang disinari UVA dan mekanisme molekuler yang mendasarinya diuraikan. Dalam penelitian kami, ditunjukkan bahwa Ectoine, melalui jalur Nrf2/ARE, tidak hanya menginduksi ekspresi ekspresi gen antioksidan tetapi juga menurunkan regulasi level -MSH dalam sel HaCaT yang diradiasi UVA melalui penekanan POMC. Penurunan kadar -MSH berkorelasi dengan penurunan regulasi aktivitas enzim tirosinase yang menyebabkan penurunan produksi melanin. Dari pengetahuan kami, ini adalah laporan pertama yang dibuktikan dengan mekanisme yang ditimbulkan oleh Ectoine dalam sel HaCaT yang disinari UVA. Studi ini menggambarkan mekanisme molekuler yang ditunjukkan oleh Ectoine dalam sel HaCaT sebagai sistem model seluler.

Kami pertama-tama menentukan konsentrasi sub-letal dari Ectoine serta efek radiasi UVA pada kelangsungan hidup sel HaCaT. Data MTT kami menunjukkan bahwa konsentrasi rendah Ectoine (0.5-1,5 M) tidak memiliki pengaruh yang signifikan terhadap kelangsungan hidup sel HaCaT (Gambar 1B). Pra-perawatan ektoin meningkatkan viabilitas 3 J/cm2 sel HaCaT yang disinari UVA (Gambar 1B). Berdasarkan pengamatan ini, kami melanjutkan percobaan lebih lanjut dengan menggunakan 1,5 M pra-perlakuan Ectoine dan penyinaran UVA pada dosis 3 J/cm2.

Produksi ROS yang diinduksi iradiasi UVA di keratinosit kulit adalah fakta yang sudah diketahui [28]. Oleh karena itu, kami juga menguji efek menguntungkan dari pra-perawatan Ectoine dalam produksi ROS yang diinduksi radiasi UVA dalam sel HaCaT. Data intensitas fluoresensi DCF kami menunjukkan bahwa pra-perawatan dengan 1,5 M Ectoine secara signifikan menurunkan regulasi inkeratinosit produksi ROS yang diinduksi radiasi UVA. Juga dapat diamati bahwa 1,5 M Ectoine dapat menyebabkan peningkatan level basal level ROS dalam sel HaCaT yang terbukti signifikan secara statistik (Gambar 1D, E).

Rousseau dkk. melaporkan bahwa POMC disekresikan oleh keratinosit epidermis manusia dan melanosit dan telah merangsangmelanogenesis[29]. Dengan mengingat hal ini, kami juga menguji efek iradiasi UVA dan pra-perawatan Ectoine pada protein terkait melanogenesis dalam sel HaCaT. Data Western blot kami menunjukkan penurunan regulasi yang bergantung pada dosis dari ekspresi protein -MSH dan POMC dalam sel HaCaT yang diiradiasi UVA disebabkan oleh pretreatment oleh Ectoine. Sebaliknya, pre-treatment Ectoine memiliki efek yang berbeda pada pola ekspresimelanogenesis- protein terkait Khususnya, hampir semua protein yang diuji (Tirosinase, TRP-1, TRP-2, c-AMP proteinkinase, CREB, dan MITF) menunjukkan penurunan ekspresi dengan meningkatnya konsentrasi perlakuan Ectoinepre dalam sel HaCaT yang disinari UVA (Gambar 2A, B). Data ini menandakan fakta bahwa Ectoine memiliki sifat anti-melanogenik dalam sel HaCaT yang disinari UVA.

Kemanjuran anti-melanogenik Ectoine diuji lebih lanjut dalam sel B16F10, garis sel melanoma terkenal yang digunakan dalammelanogenesisstudi [30]. Salah satu pengamatan penting dalam penelitian kami adalah bahwa, berbeda dengan sel HaCaT, konsentrasi tinggi Ectoine (100-400 M) diperlukan untuk menekan sintesis melanin dalam sel B16F10 yang distimulasi -MSH (Gambar 3B). Data Western blot kami menunjukkan bahwa Ectoine yang bergantung pada dosis menurunkan regulasi ekspresitirosinasedan p-CREBprotein dalam sel B16F10 yang dirangsang -MSH, yang mengarah ke efek tersebut di atas (Gambar 3C). Oleh karena itu, kami juga menguji apakah konsentrasi Ectoine yang tinggi ini dapat mempengaruhi viabilitas sel B16F10. Hasil MTT kami menunjukkan bahwa konsentrasi tinggi Ectoine (100-400 M) tidak berpengaruh pada kelangsungan hidup sel B16F10 (Gambar 3A). Hasil ini menandakan bahwa keratinosit memainkan peran kunci dalam ectoine-mediatedanti-melanogenesisdan efek depigmentasi.

Peran faktor transkripsi Nrf2 dalam metabolisme sel kulit didokumentasikan dengan baik [31]. Oleh karena itu, kami menguji lebih lanjut mekanisme yang dimainkan oleh jalur Nrf2/Keap-1 dalam efek yang dimediasi Ectoine dalam keratinosit. Gambar 4A menunjukkan bahwa ektoin yang bergantung pada dosis dan secara signifikan meningkatkan rasio Nrf2/Keap-1 dengan efek maksimum yang diamati pada konsentrasi ektoin 1,5 M. Juga diamati bahwa 1,5 M Ectoine mendukung translokasi nuklir protein Nrf2 dengan ekspresi maksimum Nrf2 dari fraksi protein inti yang diamati pada titik waktu 2 jam (Gambar 4B). Data yang diperoleh dari pewarnaan imunofluoresensi sel HaCaT juga mendukung efek ini (Gambar 4D).

Dalam melanosit manusia dan keratinosit, Marrot et al. dan lain-lain telah menjelaskan pentingnya jalur pertahanan Nrf2 dalam respon stres foto-oksidatif [32]. Kami juga mempelajari efek ekspresi protein antioksidan yang dimediasi Ectoine dalam sel HaCaT. Data kurva waktu kami menunjukkan bahwa ekspresi yang dimediasi Ectoine dari ketiga protein anti-oksidan (H O-1, NQO-1, -GCLC), dan Nrf2 ditunjukkan untuk diekspresikan secara bifasik dengan bertambahnya waktu ({{ 8}}.5–12 jam) dengan efek yang dapat diamati dicatat pada titik waktu 4 jam (Gambar 5A). Dari sini, kurva konsentrasi yang mengukur pengaruh ektoinkonsentrasi padaantioksidanekspresi protein juga ditentukan pada titik waktu 4 jam. Gambar 5B menunjukkan bahwa dibandingkan dengan sel-sel yang tidak diobati, pengobatan Ectoine telah tergantung dosis meningkatkan ekspresi protein H2O-1, NQO-1, -GCLC. Kami juga mengukur bagaimana konsentrasi Ectoine menunjukkan efek protektif dalam sel HaCaT yang terpapar radiasi UVA. Data Western blot menunjukkan bahwa Ectoine yang bergantung pada dosis meningkatkan ekspresi protein anti-oksidan dengan peningkatan regulasi yang dramatis dalam rasio Nrf2/Keap-1 juga (Gambar 5C, D). Hasil ini menunjukkan bahwa Ectoinepretreatment (1,5 M, 4 jam) memiliki efek potensial untuk menginduksi ekspresi protein antioksidan dalam sel HaCaT yang dapat melawan efek merusak yang ditimbulkan oleh paparan UVA.

antioksidan cistanche

5. Kesimpulan

Dari data di atas, kami menyimpulkan bahwa konsentrasi rendah Ectoine (0.5–1,5 M) dapat menurunkan regulasi -MSH dan produksi melanin melalui penekanan POMC dantirosinasejalur dalam sel HaCaT yang disinari UVA, menunjukkan anti-melanogenesiskemanjuran. Selain itu, Ectoine juga terlibat dalam penekanan produksi ROS intraseluler dalam sel HaCaT. Tidak seperti sel HaCaT, ektoin konsentrasi tinggi (50-400 M) mampu menunjukkan efek serupa pada sel melanoma B16F10 yang menandakan fakta bahwa keratinosit dapat memainkan peran kunci dalam anti-inflamasi yang dimediasi Ectoine.melanogenesisdan kulit-pemutihefek pada sel kulit. Yang paling penting, efek menguntungkan yang dimediasi Ectoine melalui aktivasi jalur Nrf2, yang menginduksi ekspresiantioksidanprotein H2O-1, NQO-1, dan -GCLC. AKT terbukti menjadi jalur pensinyalan pertama yang memulai aktivasi Nrf2 diikuti oleh jalur lain (p38, PKC, dan CKII). Akhirnya, pembungkaman Nrf2 secara langsung memberikan bukti bahwa Nrf2 memainkan peran kunci dalam regulasi ROS intraseluler serta produksi -MSH. Kami menyimpulkan bahwa mekanisme pemutihan utama Ectoine seharusnya disebabkan oleh penghambatan jalur ROS-p53/POMC- -MSH dalam sel HaCaT yang disinari UVA. Oleh karena itu, Ectoine atau turunannya dapat menjadi bahan aktif dalam pelembab dan lotion. yang digunakan sebagai kulit potensial dan berbahan dasar alamipemutihagen di industri kosmetik.

suplemen antioksidan cistanche