RNA M6 A Reader YTHDF2 Mengontrol Antitumor Sel NK dan Imunitas Antiviral Bagian 3

YTHDF2 diperlukan untuk kelangsungan hidup, proliferasi, dan fungsi efektor sel NK yang dimediasi IL-15

IL-15 adalah salah satu, jika bukan sitokin terpenting untuk fungsi pleiotropik sel NK. Kami dan orang lain sebelumnya menemukan bahwa IL-15 memainkan peran kunci dalam mengatur homeostasis sel NK, kelangsungan hidup, dan fungsi efektor (Becknell dan Caligiuri, 2005; Carsonet al., 1997; Carson et al., 1994; Wang et al., 2019b;Yu dkk.,2013).

Pleiotropi sel mengacu pada kemampuannya untuk melakukan fungsi berbeda di lingkungan berbeda. Pleiotropi sel berkaitan erat dengan imunitas karena banyak sel dalam sistem imun dapat memainkan berbagai peran berbeda.

Dalam sistem kekebalan tubuh, sel T adalah jenis sel yang sangat penting. Mereka mengenali dan menyerang patogen, sekaligus mengatur aktivitas sel kekebalan lainnya. Pleiotropi sel T sangat penting karena ketika sistem kekebalan tubuh bertemu dengan patogen baru, sel T perlu memainkan peran berbeda dalam waktu singkat agar dapat merespons secara efektif. Misalnya, ketika sistem kekebalan menghadapi infeksi bakteri, sel T perlu berperan membunuh bakteri, dan ketika sistem kekebalan menghadapi infeksi virus, sel T perlu berperan mengatur sel kekebalan lainnya.

Selain itu, dalam sistem kekebalan, sekelompok sel yang disebut makrofag juga memiliki efek pleiotropik. Mereka dapat memfagositosis dan menghancurkan patogen asing, dan juga dapat mengaktifkan sel kekebalan lainnya untuk menyerang patogen. Pleiotropi makrofag penting karena mereka perlu memainkan peran berbeda di lingkungan berbeda. Misalnya, pada infeksi virus, makrofag perlu mengeluarkan beberapa zat untuk melawan virus, sedangkan pada infeksi bakteri, makrofag perlu menelan dan mencerna bakteri untuk membersihkan patogen.

Singkatnya, ada hubungan erat antara pleiotropi seluler dan imunitas. Sel pleiotropik dapat memainkan peran berbeda di lingkungan yang terinfeksi oleh patogen berbeda, sehingga meningkatkan kemampuan sistem kekebalan untuk merespons dan meningkatkan kekebalan tubuh terhadap berbagai patogen. Oleh karena itu, kita harus memperhatikan pleiotropi sel dan juga memperkuat budidaya kekebalan untuk menjaga kesehatan manusia. Terlihat bahwa kita perlu meningkatkan daya ingat, dan Cistanche deserticola dapat meningkatkan daya ingat secara signifikan, karena Cistanche deserticola juga dapat mengatur keseimbangan neurotransmiter, seperti meningkatkan kadar asetilkolin dan faktor pertumbuhan. Zat-zat ini sangat penting untuk daya ingat dan pembelajaran. Selain itu, Cistanche deserticola juga dapat meningkatkan aliran darah dan meningkatkan pengiriman oksigen, yang dapat memastikan otak menerima nutrisi dan energi yang cukup, sehingga meningkatkan vitalitas dan daya tahan otak.

Klik tahu cara untuk meningkatkan daya ingat Anda

Dalam penelitian saat ini, kami menunjukkan bahwa IL-15 meningkatkan regulasi mRNA dan kadar protein YTHDF2 dalam sel NK (Gambar 6 A; dan Gambar 1, D–F). Oleh karena itu, kami berspekulasi bahwa YTHDF2 diperlukan untuk kelangsungan hidup yang dimediasi IL-15 dan fungsi efektor sel NK.

Kami pertama kali mencoba mengidentifikasi faktor transkripsi potensial di bagian hilir pensinyalan IL-15 yang secara langsung mengatur ekspresi YTHDF2. Kami menganalisis Ensiklopedia Elemen DNA menggunakan University of California, Santa Cruz, Genome BrowserDatabase (https://genome.ucsc.edu), yang memberikan prediksi situs pengikatan di seluruh genom, dalam kombinasi denganJASPAR (http://jaspar.genereg .bersih).

Kami menemukan bahwa STAT5, yang merupakan faktor hilir utama IL-15 dalam sel NK, memiliki empat situs pengikatan dalam 2 kb hulu dari situs awal transkripsi (TSS) Ythdf2, yang menunjukkan bahwa IL-15 mungkin positif mengatur transkripsi Ythdf2 dalam sel NK tikus melalui STAT5.

Dengan menggunakan penghambat STAT5 STAT5-IN-1 (Müller et al., 2008), kami menunjukkan bahwa penghambatan STAT5 mengakibatkan penurunan Ythdf2 pada tingkat mRNA dan protein dalam sel murine NK (Gbr. S4, A dan B). Untuk memastikan lebih lanjut bahwa YTHDF2 adalah faktor hilir yang diatur oleh STAT5, kami menggunakan tikus Stat5fl/fl Ncr1-iCre (selanjutnya disebut sebagai tikus Stat5ΔNK), dengan STAT5 secara khusus dihapus dalam sel NK tikus (Wiedemann et al., 2020).

Kami merawat sel limpa NK dari tikus Stat5WT dan Stat5ΔNK dengan IL-15. Kami menemukan bahwa YTHDF2 secara substansial menurunkan sel NK dari tikus Stat5ΔNK dibandingkan dengan sel NK dari tikus Stat5WT pada tingkat RNA dan proteinnya (Gambar 6, B dan C; dan Gambar. S4, C dan D).

Uji reporter Luciferase menunjukkan bahwa STAT5a dan STAT5b mengaktifkan transkripsi gen Ythdf2 secara langsung (Gambar 6, D, dan E). Hasil imunopresipitasi kromatin (ChIP) –qPCR menunjukkan bahwa STAT5 memiliki pengayaan yang signifikan pada empat lokasi pada kontrol IgG normal, yang menunjukkan pengikatan langsung pada sel NK tikus (Gbr. 6 F). Bersama-sama, hasil kami menunjukkan bahwa ekspresi YTHDF2 diatur oleh STAT5 di hilir sinyal IL-15 dalam sel NK.

Kami kemudian bertanya-tanya apakah sel NK yang kekurangan Ythdf2-adalah cacat dalam responsnya terhadap IL-15. Kami mengisolasi sel NK limpa dari tikus Ythdf2ΔNK dan tikus Ythdf2WT dan membiakkannya secara in vitro dengan adanya IL-15. Kami menemukan bahwa pertumbuhan sel NK menurun secara signifikan pada tikus Ythdf2ΔNK dibandingkan dengan tikus Ythdf2WT (Gambar 6 G). Uji pelabelan CellTrace Violet (CTV) menunjukkan bahwa proliferasi sel NK terganggu oleh defisiensi Ythdf2 (Gambar 6 H).

 Analisis distribusi siklus sel menunjukkan peningkatan fraksi sel NK secara signifikan dari tikus Ythdf2ΔNK pada fase G0/G1 tetapi terjadi penurunan fraksi sel NK secara signifikan dari tikus Ythdf2ΔNK pada fase S (Gambar 6 I), menunjukkan bahwa defisiensi Ythdf2 menyebabkan dalam penghentian fase G0/G1 dalam sel NK.

Selain itu, ada peningkatan dua hingga tiga kali lipat dalam sel NK apoptosis (annexin V+Sytox-Blue+/−) dari tikus Ythdf2ΔNK dibandingkan dengan sel dari tikus Ythdf2WT (Gambar 6 J), yang menunjukkan rusaknya kelangsungan hidup sel NK setelah hilangnya sel NK. Ythdf2. Hasil ini menunjukkan bahwa YTHDF2 mengatur respons sel NK terhadap IL-15 in vitro. Karena IL-15 diterjemahkan dengan buruk dan disekresikan secara in vivo pada kondisi stabil (Corbel et al., 1996; Fehniger et al.,2001), untuk mengeksplorasi apakah sel NK yang kekurangan Ythdf2-rusak dalam responsnya menjadi IL-15 in vivo, kami memperlakukan tikus dengan IL-15.

Kami menemukan bahwa kekurangan Ythdf2-dibandingkan sel WT NK menunjukkan penurunan proliferasi sel secara signifikan dan peningkatan apoptosis sel ketika tikus diobati dengan IL-15 (Gambar 6 K; dan Gambar. S4, E–J). Data ini menyarankan bahwa YTHDF2 mengatur respons sel NK terhadap IL-15, terutama dalam beberapa kondisi dengan IL-15 tingkat tinggi. Kami juga menemukan bahwa tingkat mRNA dan protein IFN-, granzyme B, dan perforin berkurang secara signifikan pada sel Ythdf2ΔNK NK dibandingkan dengan sel Ythdf2WT NK sebagai respons terhadap IL-15 (Gbr. 6, L–N), menunjukkan bahwa YTHDF2 juga berkontribusi terhadap fungsi efektor sel NK yang dimediasi IL-15 secara in vitro.

Secara kolektif, data kami menunjukkan bahwa YTHDF2 diperlukan untuk kelangsungan hidup, proliferasi, dan fungsi efektor sel NK yang dimediasi IL-15. Selanjutnya, kami menyelidiki mekanisme hilir dimana YTHDF2 mengatur kelangsungan hidup, proliferasi, dan fungsi efektor NK yang dimediasi IL-15. Kami menemukan bahwa sel NK dari tikus Ythdf2ΔNK dan tikus Ythdf2WT memiliki tingkat reseptor IL-15CD122 (IL-15R ) dan CD132 (IL-15R c; Gambar. S4 K) yang serupa. Pensinyalan IL-15 dimediasi oleh setidaknya tiga jalur pensinyalan hilir dalam sel NK: Ras–Raf–MEK–ERK, PI3K–AKT–mTOR, dan JAK1/3–STAT3/5 (Mishra et al., 2014).

Untuk menyelidiki jalur pensinyalan mana yang diatur oleh YTHDF2 dalam sel NK, kami memeriksa tingkat fosforilasi ERK, AKT, S6, STAT3, dan STAT5 dalam sel NK dari tikus Ythdf2ΔNK atau tikus Ythdf2WT setelah stimulasi dengan IL-15.

Hasilnya menunjukkan bahwa defisiensi Ythdf2 tidak mempengaruhi fosforilasi ERK, AKT, S6, dan STAT3 pada stimulasi IL-15(Gambar S4, L dan M) tetapi secara signifikan menghambat aktivasi STAT5, sebagaimana dibuktikan dengan penurunan tingkat fosforilasi STAT5 di Ythdf{{ 7}}kekurangan sel NK dibandingkan sel NK dari tikus Ythdf2WT (Gbr. 6 O), menunjukkan bahwa YTHDF2 diperlukan untuk pensinyalan IL-15/STAT5 yang optimal dalam sel NK yang diaktifkan.

Karena kami menunjukkan bahwa STAT5 terfosforilasi di bagian hilir IL-15berikatan dengan promotor Ythdf2 (Gbr. 6, D–F), dan di sini kami menunjukkan bahwa YTHDF2 diperlukan untuk fosforilasi STAT5 yang optimal, data kami menunjukkan loop umpan balik positif STAT5–YTHDF2 di bagian hilir IL-15 yang dapat mengontrol kelangsungan hidup sel NK, proliferasi, dan fungsi efektor.

Analisis transkriptom luas mengidentifikasi Tardbp sebagai target YTHDF2 dalam sel NK

Untuk mengatasi mekanisme molekuler di mana YTHDF2 mengatur sel NK, pertama-tama kami melakukan pengurutan RNA (seq) dalam sel IL-2–yang memperluas sel Ythdf2WT dan Ythdf2ΔNK NK. Penghapusan Ythdf2 dalam sel NK menghasilkan 617 gen yang diekspresikan secara berbeda, termasuk 252 gen yang diregulasi dan 365 gen yang diregulasi ke bawah (Gambar S5 A).

Analisis ontologi gen (GO) menunjukkan bahwa gen yang diekspresikan secara berbeda diperkaya secara signifikan dalam siklus sel, pembelahan sel, dan proses terkait pembelahan sel, termasuk mitosissitokinesis, segregasi kromosom, spindel, nukleosom, bagian tengah tubuh, dan kromosom (Gbr. 7 A).

Analisis pengayaan set gen (GSEA) menunjukkan pengayaan yang signifikan terhadap target E2F, G2/Mcheckpoint, dan set gen ciri gelendong mitosis dalam sel Ythdf2ΔNKNK (Gbr. S5 B). Gen yang berhubungan dengan siklus sel dan pembelahan sel, termasuk Aurka, Aurkb, Cdc20, Cdc25b, Cdc25c, Cdk1, E2f2, dan Plk1 (Bertoli et al., 2013), mengalami penurunan sel NK secara signifikan dari tikus Ythdf2ΔNK (Gbr. 7 B ).

Gen segregasi spindel dan kromosom seperti Anln, Aspm, Birc5, Bublb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3, dan Tpx2 (Gorbsky, 2015) juga diturunkan regulasinya secara signifikan dalam sel NK dari tikus Ythdf2ΔNK dibandingkan dengan sel NK dari tikus Ythdf2WT (Gbr. 7 C).

Selain itu, gen kelangsungan hidup sel, termasuk Birc5 (Niu et al., 2010), Septin4 (Larisch et al., 2000), dan Rffl (Yanget al., 2007), secara signifikan mengalami penurunan sel NK dari tikus Ythdf2ΔNK (Gbr. 2). 7D). Gen fungsi efektor sel NK, termasuk Klrk1, Ncr1, CD226, dan Gzma (Bezman et al., 2012), juga diturunkan regulasinya secara signifikan dalam sel NK dari tikus Ythdf2ΔNK (Gbr. 7 D).

Data ini mendukung peran YTHDF2 kami dalam mengatur proliferasi, kelangsungan hidup, dan fungsi efektor sel NK. Kami kemudian melakukan m6A-seq pada sel NK yang diperluas IL-2 dari tikus Ythdf2WT dan Ythdf2ΔNK. Analisis komponen utama menunjukkan bahwa tiga ulangan biologis dari masing-masing genotipe berkumpul bersama (data tidak ditampilkan), menunjukkan kemampuan pengulangan yang baik dari sampel m6A-seq.

Analisis optimasi hipergeometri pengayaan motif (HOMER) mengidentifikasi motif konsensus m6A (GGAC), yang menunjukkan keberhasilan pengayaan transkrip yang dimodifikasi m6A (Gbr. 7 E). Modifikasi m6A sebagian besar terletak di transkrip pengkode protein, dan puncaknya diperkaya di 59 daerah yang tidak diterjemahkan (UTR) dan 39UTR, terutama di sekitar kodon start dan stop (Gambar 7 F dan Gambar. S5 C).

Analisis pengayaan gen dengan puncak m6A mengungkapkan bahwa sebagian besar transkrip bertanda m6A dalam sel NK diperkaya dalam jalur yang terlibat dalam siklus sel dan proliferasi sel (Gambar S5 D).

For more information:1950477648nn@gmail.com