Jalan Menuju Kemajuan Studi Praklinis Penyakit Neurodegeneratif Terkait Usia: Perspektif Pada Model Hewan Pengerat Dan Turunan HiPSC Bagian 2

Selain model transgenik yang dikembangkan oleh masing-masing laboratorium akademik, Institut Kesehatan Nasional (NIH) saat ini memimpin Proyek Penemuan Target dan Validasi Praklinis Accelerating Medicines Partnership-AD (AMP-AD), yang merupakan konsorsium hibah multi-institusi dan multi-disiplin. yang secara kolektif bermaksud untuk mempercepat jalur penemuan obat untuk AD (https://www.nia.nih.gov/research/dn/amp-ad-target-discovery-and-preclinicalvalidation-project).

Dengan pesatnya perkembangan bioteknologi, teknologi transgenik secara bertahap diterapkan pada bidang biologi. Teknologi transgenik merupakan teknologi rekayasa genetika yang memasukkan gen asing ke dalam organisme agar menunjukkan ciri-ciri tertentu. Namun, terdapat kontroversi mengenai hubungan antara model transgenik dan memori.

Beberapa peneliti percaya bahwa model transgenik dapat memberikan efek positif pada memori. Misalnya, beberapa percobaan hewan transgenik menunjukkan bahwa dengan mengubah gen tertentu, kemampuan belajar dan memori hewan dapat ditingkatkan. Hasil eksperimen tersebut menunjukkan bahwa teknologi transgenik berpotensi meningkatkan kemampuan kognitif manusia.

Meskipun hasil penelitian ini sangat menarik, kita juga perlu berhati-hati karena hasil setelah proses eksperimen ini bukanlah hasil promosi manusia atau penerapan yang tergesa-gesa. Kita perlu melakukan lebih banyak penelitian mengenai teknologi ini untuk memahami potensi risikonya terhadap lingkungan dan manusia, serta untuk mengukur kemungkinan dampak sosialnya. Pada saat yang sama, kita juga harus mengakui bahwa peningkatan daya ingat tidak hanya bergantung pada gen tetapi juga pada kesehatan fisik dan kebiasaan hidup sehat dapat mencapai keadaan daya ingat yang baik melalui jalur normal.

Singkatnya, kita harus melihat aspek-aspek positif dari teknologi transgenik dan mengatur serta mengevaluasinya dengan baik. Melalui penggunaan teknologi transgenik secara rasional, kita dapat mengubah genom kita, yang akan membantu kita memecahkan beberapa masalah medis dan lingkungan sekaligus mendorong kemajuan manusia di banyak bidang, termasuk peningkatan daya ingat. Terlihat bahwa kita perlu meningkatkan daya ingat, dan Cistanche dapat meningkatkan daya ingat secara signifikan karena memiliki efek antioksidan, anti-inflamasi, dan anti-penuaan, yang dapat membantu mengurangi reaksi oksidasi dan inflamasi di otak, sehingga melindungi kesehatan otak. sistem saraf. Selain itu, Cistanche juga dapat mendorong pertumbuhan dan perbaikan sel saraf, sehingga meningkatkan konektivitas dan fungsi jaringan saraf. Efek tersebut dapat membantu meningkatkan daya ingat, kemampuan belajar, dan kecepatan berpikir, serta dapat mencegah terjadinya disfungsi kognitif dan penyakit neurodegeneratif.

Klik tahu cara meningkatkan fungsi otak

Yang paling relevan dengan tinjauan ini adalah cabang AMP-AD, yang diberi nama inisiatif Model Organism Development and Evaluation for LOAD (MODEL-AD). MODEL-AD bertujuan untuk menghasilkan garis tikus transgenik baru yang secara akurat memodelkan fenotip AD dan berfungsi sebagai platform yang lebih baik untuk jalur pengembangan obat dan model yang lebih dapat diterjemahkan dan relevan secara biologis untuk validasi DMT praklinis.

Inisiatif MODEL-AD terdiri dari Pusat di Fakultas Kedokteran Universitas Indiana, Laboratorium Jackson, Sage Bionetworks, Fakultas Kedokteran Universitas Pittsburgh, dan pusat di Universitas California Irvine.

Bersama-sama, konsorsium ini bermaksud untuk membangun model AD in vivo generasi berikutnya berdasarkan data manusia dengan cara yang ketat dan terkontrol. Dengan demikian, hal ini bertujuan untuk menyelaraskan fitur patofisiologis model AD dengan tahapan penyakit klinis yang sesuai dengan menggunakan biomarker yang dapat diterjemahkan sebagai sarana untuk meningkatkan kemampuan penerjemahan temuan praklinis.57

Hingga saat ini, 54 model tikus AD telah dihasilkan, termasuk tikus fAD, APOE, APP, MAPT/tau, serta model LOAD berdasarkan akumulasi Ab dan varian terkait LOAD lainnya yang diidentifikasi sebelumnya (https://www.model-ad.org /strain-table/), yang tersedia melalui JAX/IU/Pitt AD Precision ModelsCenter.

Model Kimia-Toksin AD

Selain model transgenik yang lebih baru, model hewan pengerat AD secara historis didasarkan pada paparan senyawa beracun yang menyebabkan degenerasi saraf selektif yang menyebabkan gangguan kognitif dan perilaku serupa dengan yang diamati pada pasien AD.

Meskipun berbagai model paparan racun telah digunakan dalam studi AD dan PD, model AD sebagian besar telah digantikan oleh model transgenik yang lebih baru yang dibahas di atas.

Model AD berbasis kimia Menginduksi patologi mirip AD dengan menggunakan senyawa yang secara selektif dan reversibel mengganggu aktivitas neuron kolinergik atau racun yang secara permanen mengganggu proses homeostasis seluler yang menyebabkan kematian sel, seperti asam okadaat dan berbagai kelas logam berat 58 (Tabel 2). Meskipun model ini menghasilkan beberapa defisit neurologis dan perilaku yang menyerupai gejala AD, termasuk gangguan pembelajaran dan memori, model ini sebagian besar tidak memiliki lesi patologis AD (misalnya plak Ab dan NFT).

Model hewan yang fokus secara eksplisit pada gangguan neuron kolinergik didasarkan pada hipotesis kolinergik AD yang sudah ketinggalan zaman.59 Dalam model tersebut, antagonis reseptor muskarinik, misalnya senyawa skopolamin, dikirim ke wilayah otak yang ditargetkan, seperti HP, untuk memblokir aktivitas asetilkolin endogen dan menginduksi gangguan kognitif dalam pembelajaran dan memori.60

Model intervensi kimia lainnya pada AD melibatkan pemberian neurotoksin lokal atau perifer yang menyebabkan kematian sel saraf nonspesifik (Tabel 2).

Model Transgenik PD

Seperti kasus AD, model PD pada tikus transgenik memungkinkan studi gambaran penyakit klinis yang diinduksi melalui manipulasi lokus genetik yang terkait dengan bentuk penyakit Mendel, dan ratusan galur unik kini tersedia secara komersial untuk dibeli.

Seperti halnya AD, sebagian besar kasus PD klinis diklasifikasikan sebagai sporadis, dengan bentuk penyakit yang diwariskan berjumlah kurang dari 1% dari seluruh kasus.89 Perubahan genetik pada gen SNCA, LRRK2, dan UCH-L1 terkait dengan bentuk penyakit autosomal dominan. PD, sedangkan pergantian gen PRKN, PINK1, dan DJ-1 dikaitkan dengan bentuk resesif autosomal90 (Tabel 1).

Dua gen yang paling sering menjadi target dalam model PD transgenik adalah SNCA dan LRRK2.91,92 Mutasi pada gen ini menyebabkan PD familial dan juga dikaitkan dengan bentuk PD sporadis melalui GWAS.93

Selain itu, peran ekspresi berlebih SNCA pada PD familial (kasus tri/duplikasi) dan sporadis telah diketahui dengan baik.94

Sampai saat ini, sebagian besar model transgenik yang memanipulasi SNCA tidak hanya memperkenalkan mutasi missense familial tetapi juga menggunakan strategi ekspresi berlebih dengan memasukkan banyak salinan gen SNCA manusia atau tikus untuk meniru peningkatan produksi a-synuclein (a-syn), baik sendiri atau dalam kombinasi, dengan a-synuclein (a-syn). mutasi missense keluarga.95–97

Mutasi missense pada LRRK2 adalah mutasi yang paling sering dilaporkan terkait dengan PD familial,98 dan beberapa garis tikus transgenik telah dihasilkan berdasarkan berbagai mutasi LRRK2 yang diketahui.

Mutasi GS2019S, misalnya, menghasilkan mutasi peningkatan fungsi dengan peningkatan aktivitas kinase.99 Model lain, seperti mutasi R1441C/G, T1348N, dan A2016T, melaporkan perubahan dalam ekspresi atau agregasi syn dan dalam beberapa kasus, defisit motorik nominal; namun, defisit yang tepat dan gambaran klinis sangat bervariasi antar model.89,92,100

Selain gen SNCA dan LRRK2, beberapa jalur transgenik lainnya telah dihasilkan yang menargetkan gen terkait PD lainnya (Tabel 1). Meskipun banyak dari model ini berhasil mengubah ekspresi dan agregasi a-syn, sebagian besar menunjukkan sedikit atau tidak ada degenerasi saraf, dan akibatnya, fungsi motorik relatif tidak terganggu92 (Tabel 1).

Analisis cermat terhadap agregat a-syn yang dihasilkan di banyak garis transgenik ini telah mengungkapkan lebih lanjut bahwa inklusi yang terbentuk tidak menyerupai badan Lewy (LB) yang terjadi secara alami yang diamati pada otak PD postmortem, melainkan menampilkan komposisi struktural yang unik.101

Kegagalan model transgenik untuk mereproduksi aspek molekuler dan neurodegeneratif dari PD kemungkinan besar disebabkan oleh kombinasi beberapa faktor. Kekhawatiran utama dari hal ini adalah sifat dan tingkat keterlibatan gen terkait keluarga, dan bentuk penyakit sporadis yang lebih umum masih belum jelas, sehingga menimbulkan pertanyaan mengenai relevansi model berdasarkan manipulasi gen terhadap sebagian besar kasus PD.

Keterbatasan lainnya adalah bahwa model transgenik menghasilkan ekspresi transgen berlebih yang tidak menyerupai tingkat fisiologis sehingga dapat menimbulkan artefak. Selain itu, bentuk penyakit yang sporadis kemungkinan besar melibatkan perubahan pada banyak gen, dan kerentanannya lebih dipengaruhi oleh komponen lingkungan, sehingga menunjukkan bahwa model transgenik monogenik mungkin memiliki kegunaan yang terbatas.

Secara keseluruhan, banyak permasalahan yang sama yang mengganggu model transgenik AD juga terjadi pada model PD: saat ini terdapat kurangnya pemahaman tentang peran gen terkait keluarga dalam etiologi PD dan sejauh mana gen tersebut berkontribusi terhadap bentuk penyakit yang sporadis.

Masalah-masalah ini membuat sangat sulit untuk menghasilkan model PD atransgenik, yang dengan tepat mereproduksi akumulasi a-syn dan pembentukan LB, yang pada gilirannya, mengarah pada pola degenerasi saraf dan gangguan perilaku yang sesuai dengan yang diamati pada populasi klinis.

Model transgenik yang ada saat ini hanya merangkum beberapa ciri-ciri tersebut dan sebagai hasilnya, terbukti hanya memiliki sedikit validitas prediktif untuk menilai efektivitas DMT potensial. Sebaliknya, model PD dengan toksin kimia masih banyak digunakan karena kemampuannya mereproduksi karakteristik degenerasi saraf DA selektif dari PD.

Model Kimia-Toksin PD

Selama setengah abad terakhir, berbagai macam senyawa beracun telah digunakan untuk memodelkan pola degenerasi saraf yang diamati pada PD. Dari keempat model tersebut, empat model cedera kimia telah muncul sebagai model yang paling banyak digunakan untuk penelitian praklinis, dan dampaknya telah dikarakterisasi secara luas.

Ini termasuk 6-hidroksidopamin (6-OHDA), analog katekolamin; 1-metil-4-fenil1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), analog opioid sintetik;rotenon, pestisida; dan paraquat, suatu herbisida102 (Tabel 2). Model PD nontransgenik lainnya didasarkan pada injeksi fibril yang telah dibentuk sebelumnya (PFF; protein a-syn monomerik rekombinan yang diubah menjadi bentuk agregat fibrilar) ke dalam otak hewan, yang memicu hiperfosforilasi protein a-syn endogen dan menimbulkan patologi mirip LB di SN. pars compacta (SNpc)87,88 (Tabel 2).

Model berbasis toksin ini dapat menginduksi, dengan tingkat yang berbeda-beda, agregasi a-syn dan neurodegenerasi selektif neuron DA di jalur nigrostriatal, sebuah kelemahan penting dibandingkan model transgeniknya.

Jalur yang terlibat dalam memicu kematian sel dan tingkat hilangnya neuron DA, bagaimanapun, sangat bervariasi antar model, yang telah ditinjau secara rinci di tempat lain.103 Pada akhirnya, akibat dari hilangnya sel DA pada PD adalah inti motorik striatum tidak lagi mampu mempertahankan fungsi fisiologis normal sehingga menyebabkan berbagai gangguan kemampuan motorik.

Namun, hilangnya neuron DA nigrostriatal, dengan sendirinya, bukanlah model PD itu sendiri melainkan meniru Parkinsonisme yang lebih umum yang ditandai dengan spektrum gejala motorik yang lebih luas.104

Sampai saat ini, meskipun beberapa model berbasis toksin, termasuk PFF, MPTP kronis, dan pemberian rotenon, dapat menginduksi agregat a-syn dan pembentukan mirip LB, model tersebut berbeda dari karakteristik inklusi LB pada PD, dan distribusi keseluruhan dari agregat ini. tidak mencerminkan pola yang diamati di PDbrains.102

Model-model ini juga terbatas kemampuannya untuk memodelkan sifat progresif dari PD dan penyebaran patologi ke wilayah otak lain, karena pasien PD juga menderita degenerasi saraf di daerah subkortikal dan akhirnya kortikal pada tahap akhir penyakitnya.105

Singkatnya, model berbasis paparan toksin menunjukkan beberapa kesamaan dengan patologi yang diamati pada PD; Namun, mekanisme kematian sel yang disebabkan oleh toksin kemungkinan besar berbeda dengan mekanisme yang mendasari hilangnya neuron pada PD.106,107 Sebagai catatan, jadwal pemberian dosis tipikal untuk model toksin kimia pada PD terjadi selama beberapa hari hingga beberapa minggu, sedangkan perjalanan penyakit PD berkembang selama beberapa dekade dan berlangsung selama beberapa dekade. bertahun-tahun.

Keterbatasan ini menunjukkan bahwa model berbasis paparan toksin yang bertujuan untuk menginduksi kematian neuron DA selektif pada jalur nigrostriatal memberikan gambaran PD yang tidak lengkap dan memberikan penjelasan mengapa upaya untuk mengidentifikasi DMT dalam model tersebut gagal efektif dalam uji klinis.12

Model Vektor Viral untuk PD dan ADAKelebihan Sistem Vektor Viral

Sistem penyampaian vektor virus menawarkan beberapa keuntungan yang sulit dicapai dengan pendekatan lain.108 Pertama, sistem vektor virus memberikan kontrol yang kuat terhadap ekspresi temporal dari gen yang diteliti.

Kedua, penuaan merupakan faktor risiko utama gangguan spektrum AD-PD, dan kemungkinan untuk menularkan vektor pada titik mana pun dalam masa hidup hewan merupakan keuntungan besar dalam desain penelitian. Ketiga, vektor virus mendukung penghantaran dan ekspresi transgen lokal, sehingga memungkinkan terjadinya penargetan yang akurat dan spesifik pada wilayah otak yang diminati.

Keempat, manipulasi dosis yang tepat dapat dengan mudah dicapai dengan penggunaan vektor virus. Kelima, model yang menarik dapat diciptakan pada berbagai spesies hewan, mulai dari hewan pengerat kecil hingga primata besar yang bukan manusia.

Keenam, variasi gen yang berbeda dapat dengan mudah dibuat untuk memperoleh fenotip yang diinginkan. Ketujuh, fleksibilitas dan fleksibilitas berbagai platform vektor yang digunakan untuk transfer gen yang dimediasi virus ke dalam sistem saraf pusat sangatlah luas.

Sistem virus, termasuk vektor terkait adeno rekombinan (UAV) dan vektor lentiviral (LV), secara efisien dan kuat mendukung ekspresi gen jangka pendek dan jangka panjang, baik secara lokal maupun global. Terakhir, sistem berbasis vektor virus secara signifikan lebih ekonomis. , baik dari segi upaya maupun biaya, dibandingkan dengan model penyakit lainnya.

Model Vektor Viral AD dan PD: AAV dan LV

Pendekatan vektor virus untuk memodelkan fenotip AD dan PD in vivo telah digunakan oleh beberapa kelompok berbeda dengan menggunakan rAAV atau LV. Sejak pertama kali digunakan pada awal milenium, berbagai model berbasis virus telah dikembangkan dan digunakan untuk DA.

Model awal tauopati AAV mengeksploitasi AAV2/2 untuk mengekspresikan protein humantau P301L di otak mencit.109,110 Dalam penelitian ini, vektor AAV-tau-P301L disuntikkan ke otak depan basal tikus dewasa yang menyebabkan peningkatan kadar tauopati. selama minimal 8 bulan pasca transduksi. Secara signifikan, agregat tauand hiperfosforilasi yang menyerupai NFT ditemukan pada 3 hingga 4 minggu pascatransduksi.110,111

Studi-studi ini memberikan bukti konsep pertama bahwa injeksi tau AAV-P301L dapat menghasilkan ekspresi protein yang persisten dan agregasinya pada tikus dan mencit.

Secara konsisten, injeksi AAV-wild-type (WT) atau triple-mutant APP menghasilkan pembentukan plak Ab tetapi tidak terjadi degenerasi saraf yang nyata. Temuan ini berbeda dengan pengamatan di atas yang menyatakan bahwa AAV-WTtau atau AAV-P301L tau mampu menyebabkan degenerasi saraf yang signifikan pada neuron piramidal HP.112

Dalam percobaan yang lebih baru, AAV2/5 digunakan untuk mengirimkan WT tau dan vektor kontrol GFP ke dalam HP dorsal tikus Fischer 344 yang sudah tua.113 Kedua virus tersebut diekspresikan dengan kuat di neuron HP dan menyebabkan struktur aksonal yang menyimpang, degenerasi aksonal, dan fragmentasi tau di dalam sel. Akson HP dibandingkan dengan akson yang mengekspresikan GFP kontrol tampak normal.

Dalam model lain, tau P301L yang diekspresikan dari promotor sinapsin I manusia dikirimkan oleh vektor AAV2/9 ke korteks entorhinal lateral, yang memungkinkan penulis untuk mendeteksi berbagai bentuk varian tau terfosforilasi dan teragregasi sebelum hilangnya sinapsis jalur perforan dan degenerasi saraf.114

Data ini mendukung kegunaan pendekatan berbasis AAV pada AD, khususnya dalam memodelkan perubahan patologis awal, seperti degenerasi dan degradasi aksonal. Beberapa penelitian menggunakan model berbasis virus yang bertujuan untuk menginduksi aspek patologis lain dari LOAD.115,116 Misalnya, AAV-BRI-Ab42dan Vektor AAV-BRI-Ab40 digunakan untuk mengontrol ekspresi dan sekresi peptida Ab pada hewan pengerat HP.116

Khususnya, hewan yang disuntik AAV-BRIAb42-menunjukkan bahwa vektor ini mampu menginduksi pembentukan plak, namun hal ini tidak terlihat pada ekspresi rAAV2/1-BRIAb40.

Dalam penelitian lain, AAV2/2 digunakan untuk mengirimkan Ab40 dan Ab42, sebuah fragmen terminal-C dari APP yang mengandung peptida Ab (C100), dan mutan V717F dari C100 ke tikus HP dan otak kecil.

Menariknya, mutan Ab42 dan V717F menunjukkan induksi mikrogliosis dan gangguan sawar darah-otak (BBB) ​​yang lebih besar dibandingkan dengan bentuk Ab40 tetapi tidak mengaktifkan pembentukan plak, induksi astrosit, atau degenerasi saraf. Penggunaan teknologi AAV dan LV untuk mengekspresikan berbagai bentuk Ab dan prekursornya akan terus menjadi metode penting untuk mempelajari peran mereka dalam LOAD.117

Baru-baru ini, LV telah digunakan untuk mengekspresikan TDP-43,Ab42, atau keduanya di korteks motorik tikus, yang mengungkap bahwa hilangnya TDP-43 berimplikasi pada mikroglia sebagai penyebab degenerasi sinaptik yang diamati pada LOAD. 118

Selain itu, lenti-TDP-43 memicu perubahan dalam pemrosesan APP yang terkait dengan produksi Ab42 dan menginduksi aktivitas caspase dan peradangan saraf, yang juga diamati dengan lenti-Ab42.

Kombinasi ekspresi protein TDP-43 dan Ab42 menghasilkan hasil yang mirip dengan TDP-43 saja tetapi dengan fitur tambahan berupa hilangnya neuron, yang menunjukkan kemungkinan efek sinergis antara kedua faktor tersebut. Studi lain yang menggunakan LV untuk mengekspresikan TDP-43 di korteks motorik menemukan perubahan metabolisme asam amino, stres oksidatif, dan kematian neuron.119

Hasil-hasil ini bersama-sama menunjukkan kegunaan sistem model AD berbasis LV untuk menjelaskan faktor-faktor patogen utama yang terkait dengan disfungsi protein yang terlibat dalam AD, sedangkan Ab dan tau telah diuji secara ekstensif dalam LOAD, konsisten dengan gagasan lama bahwa Ab adalah tersangka utama dalam patogenesis AD. . Namun demikian, kegagalan yang terus berlanjut dalam uji coba obat yang bertujuan untuk menurunkan kadar amiloid memerlukan upaya untuk memfokuskan kembali upaya pada penyebab potensial lainnya.

Beberapa penelitian terbaru menunjukkan bahwa APOEε4 mungkin berkontribusi terhadap toksisitas yang terkait dengan fenotip AD, dan hingga saat ini, APOE tetap menjadi faktor risiko genetik yang paling signifikan dan dapat ditiru untuk AD.120

Mengingat peran APOEε4 dalam patogenesis AD dan potensi efek perlindungan dari isoform ε2, Hu dan rekan121 menghasilkan model tikus menggunakan isoform AAV8-APOE yang digerakkan oleh promotor GFAP yang secara khusus diekspresikan dalam astrosit di semua wilayah otak, yang menghasilkan peningkatan keseluruhan dalam tingkat APOE di seluruh otak tikus.

Ekspresi berlebih APOEε4 yang dimediasi virus pada tikus APOEε4-TR meningkatkan partikel lipoprotein APOE dengan lipidasi buruk dan menurunkan kolesterol terkait APOE pada tikus APOEε4-TR. Sebaliknya, ekspresi berlebih APOEε2 pada APOEε4-TR tikus meningkatkan lipidasi APOE dan kolesterol terkait.

Lebih lanjut, ekspresi berlebih dari APOEε4 meningkatkan kadar Ab endogen, sedangkan ekspresi berlebih APOEε2 cenderung menurunkan Ab endogen. Berdasarkan data ini, penulis menyarankan bahwa peningkatan APOEε2 pada pembawa APOEε4 adalah strategi yang bermanfaat untuk mengobati DA, sedangkan peningkatan APOEε4 pada pembawa APOEε4 berbahaya. Dalam penelitian lain, injeksi intraserebral langsung dilakukan menggunakan AAV untuk mengekspresikan APOEε2.

Studi ini melaporkan bahwa ekspresi berlebih APOEε2 secara nyata mengurangi kadar Ab larut dalam otak (termasuk oligomer) dan -tidak larut, serta beban amiloid, pada dua model amiloidosis otak tikus yang patologinya bergantung pada ekspresi isoform APOEε4 tikus atau manusia.122

Zhao et al.122 lebih lanjut menunjukkan bahwa pengurangan Ab otak secara luas dapat dicapai melalui suntikan tunggal virus melalui pengiriman AAV yang mengekspresikan APOEε2 intra-talamus.

Secara kolektif, data ini menunjukkan bahwa pengiriman gen AAV dari APOEε2, menggunakan AAV, dapat menyelamatkan efek merugikan dari APOEε4 pada patologi amiloid otak; dengan demikian, pendekatan ini mungkin mewakili jalan terapi yang layak untuk mengobati atau mencegah LOAD.

For more information:1950477648nn@gmail.com