Abstrak:Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk memperkirakan, melalui analisis diferensial, berbagai aktivitas biologis kandungan fenolat total dalam ekstrak alkohol dari tiga varietas kurma yang sensitif atau tahan terhadap Fusarium oxysporum. sp albidinis. Di sini, produk stilben dengan kapasitas antioksidan dan bioaktif dibuktikan pada varietas tahan Taabdount (TAAR). Selanjutnya, fraksi metanol dari varietas kurma tahan TAAR mengandung produk yang signifikan, ditentukan oleh LCMS/MS dan 1H, 13C NMR, milik keluarga hidroksi stilbenes, yang menunjukkan kapasitas antioksidan, menghambat aktivitas tirosinase jamur, dan mengaktifkan dan memberikan efek perlindungan pada kerusakan yang diinduksi hipoklorit pada proteasome 20S dari sel-sel berumur fibroblast kulit manusia. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa hidroksitoluena yang ada dalam Phoenix dactylifera L. yang resisten harus dipelajari untuk memahami cara stilbene dapat mengerahkan kemampuan anti-penuaan.

Glikosida cistanche juga dapat meningkatkan aktivitas SOD di jaringan jantung dan hati, dan secara signifikan mengurangi kandungan lipofuscin dan MDA di setiap jaringan, secara efektif mengais berbagai radikal oksigen reaktif (OH-, H₂O₂, dll.) dan melindungi dari kerusakan DNA yang disebabkan oleh radikal OH. Cistanche phenylethanoid glycosides memiliki kemampuan pemulungan radikal bebas yang kuat, kemampuan reduksi yang lebih tinggi daripada vitamin C, meningkatkan aktivitas SOD dalam suspensi sperma, mengurangi kandungan MDA, dan memiliki efek perlindungan tertentu pada fungsi membran sperma. Polisakarida Cistanche dapat meningkatkan aktivitas SOD dan GSH-Px dalam eritrosit dan jaringan paru-paru tikus tua yang disebabkan oleh D-galaktosa, serta mengurangi kandungan MDA dan kolagen dalam paru-paru dan plasma, dan meningkatkan kandungan elastin, memiliki efek pemulungan yang baik pada DPPH, memperpanjang waktu hipoksia pada tikus tua, meningkatkan aktivitas SOD dalam serum, dan menunda degenerasi fisiologis paru-paru pada tikus tua eksperimental Dengan degenerasi morfologi seluler, percobaan telah menunjukkan bahwa Cistanche memiliki kemampuan antioksidan yang baik dan berpotensi menjadi obat untuk mencegah dan mengobati penyakit penuaan kulit. Pada saat yang sama, echinacoside di Cistanche memiliki kemampuan yang signifikan untuk mengais radikal bebas DPPH dan memiliki kemampuan untuk mengais spesies oksigen reaktif dan mencegah degradasi kolagen yang diinduksi radikal bebas, dan juga memiliki efek perbaikan yang baik pada kerusakan anion radikal bebas timin.

Klik pada manfaat rou cong rong

【Untuk info lebih lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Kata kunci:Phoenix dactylifera L.; Fusarium oxysporum. sp Albidinis (FoA); aktivitas antioksidan; aktivitas anti-tirosinase; aktivasi proteasome; analisis LC-MS/MS; turunan stilben

1. Perkenalan

Kurma (Phoenix dactylifera L.) adalah monokotil abadi dari keluarga Arecaceae. Pohon ini sangat penting dalam kehidupan populasi Sahara Maroko Selatan dan Tenggara, baik secara ekonomi maupun sosial. Penyakit Bayoud yang disebabkan oleh jamur tanah Fusarium oxysporum f. sp Albidinis (FoA) [1], telah secara signifikan mengurangi hasil kurma Maroko dalam beberapa tahun terakhir [2]. Diperkirakan bahwa FoA menghilang dari dua pertiga warisan phoenicicole Maroko tetapi terus menghancurkan antara 4,5 persen hingga 12 persen dari kultivar komersial kurma berkualitas tinggi [2]. Banyak upaya telah dilakukan untuk memerangi penyakit ini dan menguraikan beberapa mekanisme pertahanan tanaman kurma [3]. Studi pertama tentang kemungkinan mekanisme pertahanan kurma telah menyoroti peran senyawa fenolik dan kapasitas antioksidan dalam toleransi terhadap FoA [4,5]. Analisis biokimia kultivar senyawa fenolik akar yang tahan dan sensitif adalah studi biokimia pertama yang menjelaskan manfaat mekanisme pertahanan kurma. Memang, literatur menunjukkan bahwa kultivar akar tahan lebih kaya 5-asam caffeoyl shikimic dan isomer posisinya daripada kultivar akar sensitif [5]. Senyawa ini secara efektif menunjukkan potensi aktivitas antijamur in vitro terhadap FoA [6].

Kapasitas besar antioksidan alami untuk mengais radikal bebas adalah apa yang mendorong meningkatnya popularitas mereka dalam penelitian makanan dan medis [7-10].

Misalnya, spesies oksigen reaktif merupakan faktor yang memberatkan dalam cedera sel dan proses penuaan [11] dan dengan demikian terhubung ke banyak penyakit. Akibatnya, molekul antioksidan dapat membantu kesehatan manusia dengan mencegah penyakit degeneratif dan memperlambat konsekuensi penuaan [12]. Dalam studi ini, kami tertarik pada kemampuan antioksidan untuk mempromosikan aktivasi 20S-proteasome dan melindunginya dari kerusakan oksidatif. Proteasom memang berkontribusi pada pemeliharaan homeostasis seluler dengan mengaktifkan proses pembersihan sel dari protein yang rusak dan penghancuran terkontrol dari protein berumur pendek [13]. Oleh karena itu, mengaktifkan proteasome dengan antioksidan dapat menjadi strategi anti-penuaan baru [14]. Lebih lanjut, karya ini bermaksud untuk mengeksplorasi potensi kandungan fenolik akar resisten terhadap FoA sebagai senyawa biologis aktif.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Sampel Tanaman

Penelitian dilakukan untuk setiap sampel dengan bahan dari 10 kultivar kurma dewasa (Phoenix dactylifera L.) yang ditanam dari bidang yang terkontaminasi atau tidak terkontaminasi yang berlokasi di Palmaria Figuig, Maroko Tenggara. Akar utama (termasuk akar penghirup udaranya) berdiameter 0,5 hingga 2 cm dari varietas yang rentan, seperti charas Bouffegous terinfeksi (BI) atau yang tidak terinfeksi (BNI). Selain itu, kultivar Taabdount (TAAR) yang tahan FoA dikumpulkan, dan daun dari dua tanaman obat digunakan secara lokal sebagai pengobatan filaktik terhadap FoA. Selanjutnya, rosemary (R, Rosmarinus officinalis) dan delima (G, Punica granatum L.) [15] juga dikumpulkan dalam paket tidak terkontaminasi yang sama dimana mereka dianalisis dan digunakan sebagai kontrol. Sampel diambil selama dua periode dalam setahun, pada bulan September dan akhir Januari (antara 2013 dan 2015), dan disimpan secara kedap udara pada suhu kamar. Karena sampel diperoleh dari palmer, mereka disertifikasi (identifikasi dan klasifikasi) oleh Menteri Pertanian Maroko [16].

2.2. Persiapan Ekstrak

Setelah dicuci secara ekstensif dengan air, akar atau daunnya dikeringkan di tempat teduh, lalu digiling dengan blender. Untuk masing-masing sampel (BI, BNI, TAAR, R, dan G), ditambahkan 10 mL metanol ke dalam 1 g bahan kering dan dibiarkan diaduk selama 4 jam pada suhu kamar. Kemudian, disaring dan diuapkan pada suhu 37 ◦C dengan rotary-vap. Ekstrak kering ditempatkan dalam larutan metanol dengan konsentrasi akhir 10 mg/mL atau 50 mg/mL (kemudian digunakan untuk menguji aktivitas biologis secara in vitro). Tiga ekstraksi independen untuk setiap sampel dilakukan untuk pengujian aktivitas biologis.

2.3. Aktivitas Biologis

2.3.1. Kandungan Fenolik dan Aktivitas Antioksidan

Prosedur yang diuraikan oleh Nacoulma et al. diterapkan untuk mengevaluasi total fenolat dan kandungan flavonoid total dari setiap ekstrak [17], dengan adaptasi akhir volume pada 200 µL untuk digunakan pada pembaca pelat mikro. Absorbansi masing-masing pada 760 nm dan 510 nm, ditentukan terhadap blanko metanol. Kurva kalibrasi standar asam galat (0–300 mg/L) (y=0.0083x ditambah 0,9106, r2=0.978) dan quercetin (0–100 mg/L) (y {{14 }}.0008x plus 0.0597, r2=0.994), masing-masing, digunakan.

Memanfaatkan radikal bebas 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil, aktivitas pemulungan antioksidan diselidiki (DPPH). Menggunakan adaptasi akhir volume masing-masing pada 300 µL dan 275 µL, untuk menggunakan pembaca pelat mikro, kapasitas ekstrak untuk menurunkan zat besi (III) dinilai, seperti yang dijelaskan oleh Nacoulma et al. [17]. Dibandingkan dengan blanko metanol, absorbansi diukur masing-masing pada 517 nm dan 700 nm. Kemudian, dengan menggunakan persamaan berikut, aktivitas penangkapan radikal bebas dari masing-masing larutan diperkirakan sebagai persentase penghambatan:

Kurva kalibrasi standar diperoleh dengan menggunakan asam askorbat ({{0}}–100 mg/L) sebagai standar antioksidan (y=0.0014x ditambah 0,0875, r2=0.998).

2.3.2. Uji Penghambatan Pertumbuhan FoAMyc helium

Dengan sedikit modifikasi, metode yang dijelaskan oleh Neri et al. [18] digunakan untuk menentukan sejauh mana bahan kimia murni menghambat pertumbuhan miselium FoA. Kultur FoA 7-yang berusia sehari memiliki lima milimeter cakram miselium yang ditempatkan di cawan Petri dengan media PDA yang dilengkapi dengan bahan kimia murni yang tercantum di atas pada 50, 75, dan 100 µg/mL. Pelat diinkubasi selama 5 hari pada suhu 28 ◦C. Diameter rata-rata koloni yang diukur pada dua sudut kanan digunakan untuk menilai penghambatan pertumbuhan miselium FoA. Setiap perlakuan terdiri dari tiga pengujian menggunakan tiga galur FoA yang berbeda: FoA 41818, FoA 41814 (BCCM, Belgia), dan FoA Lokal (Palemeraie of Figuig, Maroko), serta kontrol negatif menggunakan media yang belum ditambahkan.

2.3.3. Viabilitas Sel dan Aktivitas Proteasome 20S

Fibroblas kulit manusia normal dari {{0}}pria berusia satu tahun (NHDF) (Promocell, Heidelberg, Jerman) digunakan di mana sel ditempatkan pada kepadatan 100,{{3 }} sel/mL dalam RPMI 10 persen ditambah dengan 10 persen (b/v) FBS, 1 persen (b/v) L-glutamin, 100 unit/mL penisilin, dan streptomisin 100 µg/mL. Mereka disimpan dalam pelat microwell 96-microwell putih atau transparan selama 24 jam pada suhu 37 ◦C dalam inkubator dengan lingkungan yang dilembabkan dengan 5 persen CO2. Untuk uji aktivitas proteasom, serta untuk evaluasi efek perlindungan pada kerusakan akibat hipoklorit, sel kemudian diperlakukan dengan bahan uji (senyawa murni dari 5 hingga 50 µg/mL, kontrol positif pada 0,5 dan/atau 1 µM, dan ekstrak tumbuhan metanol dari 15 sampai 50 µg/mL) selama 24 jam dengan maksimum 0,3 persen DMSO pada konsentrasi akhir, secara simultan, tanpa perubahan, mengenai kontrol negatif. Menyelidiki efek protektif ekstrak TAAR atau senyawa murni pada aktivitas proteasome berarti bahwa sel fibroblas kemudian dikenakan 50 µM OCl− selama 35 menit (dipilih sebagai optimal, tanpa toksisitas sel, penghambat oksidan dari kondisi proteasome 20S) [19]. Tahapan eksperimen berikut diselesaikan oleh metodologi pemasok (Proteasome-Glo Chymotrypsin-Like Cell-Based Assay, Promega Corporation, USA): Pertama, eksperimen viabilitas sel bersamaan menggunakan uji kolorimetri kristal violet atau MTT yang dilakukan dalam kondisi yang benar-benar mirip digunakan untuk menormalkan uji bioluminesensi sel ini. Penyimpangan standar dan fluoresensi rata-rata dalam sampel rangkap tiga dari dua pengujian terpisah (n=6) ditampilkan. Semua pengukuran dan percobaan independen (n=2) dilakukan dua kali.

2.3.4. Efek Penghambatan pada Tirosinase Jamur Bebas Sel

Untuk menyelidiki efek pada aktivitas enzim, bahan uji (antioksidan murni atau ekstrak tanaman metanol) diinkubasi dengan enzim dalam buffer fosfat pada suhu kamar. Singkatnya, 300 mL larutan L-DOPA 5 mM pada buffer fosfat 50 mM (pH 6,5) dengan atau tanpa bahan uji dalam berbagai konsentrasi ditambahkan ke 96-piring mikro dengan baik bersama dengan 100 mL larutan berair tirosinase jamur (20 unit). Selama 40 menit, campuran uji diinkubasi pada 25 ◦C. Setelah inkubasi, tingkat produksi dopakrom campuran reaksi diukur secara spektrofotometri pada 492 nm [20]. Kurva kalibrasi standar diplot menggunakan asam galat (0–1000 µg/mL) (y=−0,087 × ditambah 0,45; r2=0.97). Setiap pengukuran dan percobaan independen (n=2) dilakukan dua kali.

2.4. Prosedur Analisis, Isolasi, dan Elusidasi Struktur

Akar tanah (20 g) diekstraksi dengan 200 mL metanol, diaduk selama 24 jam pada suhu sekitar, disaring, disentrifugasi pada 10,000× g selama 15 menit, dan kemudian diuapkan pada suhu 35 ◦C menggunakan alat putar peralatan penguapan vakum. Ekstrak kasar diencerkan dengan 20 mL air suling, diekstraksi kembali dengan 2 × 20 mL etil asetat, kemudian dipekatkan menggunakan sistem rotary vacuum evaporation pada suhu 35 ◦C. Produk utama dimurnikan dengan HPLC preparatif menggunakan kolom Waters C18 (SymmetryPrep 150 × 19 mm, ukuran partikel 7 µm) dengan kondisi gradien LC yang sama seperti yang digunakan di atas dan laju alir 5 mL/menit. Puncak di RT adalah antara 38,8 dan 40,8 menit, dikumpulkan antara 39,2 dan 40,2 menit; koleksi volume total diliofilisasi untuk menghasilkan 27 mg senyawa. MS dan NMR 1H dan 13C kemudian mengidentifikasinya.

Analisis dilakukan dengan sistem seri LC 1200 beresolusi cepat menggunakan diode array detector (DAD) yang digunakan untuk memantau spektrum UV pada 320 nm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Pemisahan senyawa dilakukan pada kolom Beckman C18 (ULTRASPHERE 250 mm × 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm) menggunakan gradien 47 menit 10 mM amonium asetat/0,2 persen asam format dalam air (v/v), pH 2,9 ({{ 13}}pelarut A), dan 30/70 campuran asetonitril/metanol (=pelarut B). Laju alir adalah 0,8 mL/menit, dan pelarut B dinaikkan dari 5 menjadi 35 persen dalam 45 menit dan diseimbangkan kembali selama 2 menit. Dalam seri dengan DAD, seri ESI-QTOF 6520 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) digunakan untuk MS resolusi tinggi dan analisis tandem MS (MS/MS) yang ditargetkan. Spektrum diperoleh dalam mode akuisisi negatif dan resolusi tinggi (4 GHz).

Spektra 1H NMR dan 13C NMR direkam pada spektrometer Bruker Avance 300 yang beroperasi pada 300 MHz. Peluruhan induksi gratis diproses dengan suite MestreNova 5.3.2 NMR dari MestreLab Research SL.

2.5. Analisis statistik

Semua percobaan independen dilakukan dalam rangkap tiga. Semua data disajikan sebagai nilai rata-rata ± SD. Menggunakan program GraphPad Prism versi 6, hasilnya dianalisis menggunakan uji nonparametrik Kruskal–Wallis bersama dengan uji perbandingan berganda Dunn. p-Values ​​0.05 dan lebih rendah dianggap signifikan.

3. Hasil dan Pembahasan

3.1. Total Kandungan Fenolik dan Flavonoid dari Ekstrak Metanol

Karena sifat redoksnya, senyawa fenolik tanaman diketahui memiliki berbagai dampak biologis, termasuk aktivitas antioksidan [21]. Tabel 1 menggambarkan kandungan total fenolik ekstrak akar metanol (500 µg/mL) varietas rentan ghagras Bouffegous yang terinfeksi (BI) dan tidak terinfeksi (BNI) oleh FoA atau tahan sebagai Taabdount (TAAR). Konsentrasinya bervariasi dari 171 ± 14 hingga 253 ± 47 mg asam galat eq./g. Jumlah senyawa tersebut paling banyak terdapat pada varietas BNI, sedangkan konsentrasi terendah berasal dari ekstrak akar metanol BI. Jumlah flavonoid dalam ekstrak yang sama (Tabel 1)) bervariasi dari 240 ± 25 hingga 406 ± 66 mg quercetin eq./g, dan, sekali lagi, jumlah tertinggi dikaitkan dengan varietas BNI. Ada kehilangan sekitar 1/3 dari jumlah total polifenol dan flavonoid antara varietas tidak terinfeksi (BNI) dan varietas terinfeksi (BI) atau tahan (TAAR) terhadap FoA. Oleh karena itu, penting untuk memeriksa bagaimana hilangnya senyawa, yang digambarkan sebagai penting untuk kapasitas antioksidan tanaman, dapat mempengaruhi aktivitas biologis yang menjadi perhatian kita.

3.2. Potensi Antioksidan Ekstrak Metanol

Aktivitas scavenging radikal DPPH adalah metode yang banyak digunakan untuk menyaring aktivitas antioksidan ekstrak tumbuhan [22]. Tes ini menentukan apakah bahan kimia antioksidan yang ditemukan dalam ekstrak mampu mengais spesies radikal DPPH yang stabil. Data eksperimen (Gambar 1) mengungkapkan bahwa semua ekstrak metanol (pada 100 atau 500 µg/mL) cenderung memiliki efek pemulungan radikal bebas dengan aktivitas pemulungan DPPH tertinggi yang diamati pada akar TAAR (87,0 persen penghambatan DPPH). Aktivitas antioksidan tampaknya tidak bergantung pada jumlah total senyawa polifenol atau flavonoid. Namun, aktivitas yang lebih baik dari ekstrak metanol akar TAAR mungkin karena lebih banyak komponen penyumbang hidrogen yang terkandung di dalam ekstrak.

Daya pereduksi dievaluasi dengan kemampuan ekstrak metanol untuk mengubah Fe(III) menjadi Fe(II). Kemampuan untuk mereduksi Fe(III) ini dapat dikaitkan dengan jumlah dan posisi gugus hidroksil yang terdapat dalam senyawa fenolik dan kapasitasnya untuk mendonorkan hidrogen [23]. Tabel 2 menunjukkan aktivitas reduksi ekstrak metanol sampel tanaman kami dibandingkan dengan asam askorbat sebagai standar. Ekstrak metanol akar TAAR mengandung reduksi tinggi (95 ± 1 mg asam askorbat eq./g), sedangkan kandungan terendah diperoleh dari ekstrak akar BNI (27 ± 2 mg asam askorbat eq./g).

Analisis regresi dilakukan untuk mengkorelasikan hasil yang diperoleh (koefisien korelasi (R)). Korelasi linier yang signifikan ditemukan antara kandungan total fenolik dan flavonoid (R {{0}}.849, p < 0.05) dan antara DPPH dan uji daya reduksi (R=0. 816, p <0,05), tetapi tidak ada antara kandungan fenolik atau flavonoid dari ekstrak metanol dan aktivitas antioksidannya. Akhirnya, semua ekstrak metanol menunjukkan aktivitas antioksidan yang signifikan terhadap aktivitas pemulungan radikal DPPH dan uji daya reduksi, tetapi aktivitas antioksidan ini tampaknya tidak terkait dengan kandungan fenolik atau flavonoid total. Oleh karena itu, temuan ini menyiratkan bahwa jenis bahan kimia tertentu, daripada jumlah senyawa fenolik atau flavonoid yang ditemukan dalam beragam ekstrak kami, kemungkinan besar bertanggung jawab atas aktivitas antioksidan dari ekstrak tumbuhan yang ditinjau. Beberapa komponen fenolik yang telah dijelaskan sebelumnya dan merupakan individu yang sangat aktif juga dapat berdampak pada aktivitas antioksidan ekstrak tumbuhan: Terlepas dari konsentrasinya, senyawa fenolik yang ditemukan dalam anggur merah tua dapat menunjukkan berbagai sifat antiradikal yang terkait dengan aspek strukturalnya [ 24].

Varietas tahan TAAR FoA menunjukkan aktivitas antioksidan tertinggi di antara berbagai varietas kurma. Mengacu pada literatur, perkembangan resistensi pada pohon kurma tertentu ini mungkin dianggap berasal dari peningkatan jumlah isomer posisi yang berbeda dari asam caffeoyl shikimic [5].

3.3. Aktivitas Tirosinase Jamur

Aktivitas tyrosinase diphenolase jamur mengkatalisis oksidasi dua turunan dopaquinone yang mengarah ke sintesis melanin. Hasil yang disajikan pada Tabel 3 menunjukkan kemampuan senyawa yang ada dalam ekstrak metanol TAAR, BI, dan BNI untuk mengganggu hidroksilasi l-DOPA melalui penghambatan aktivitas tirosinase jamur. Selanjutnya, hasil ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol TAAR secara statistik lebih aktif daripada ekstrak BI (p <{2}}.05) dan BNI (p < 0,05) pada aktivitas tirosinase jamur. Jadi, kapasitas ekstrak akar kurma untuk menghambat aktivitas tirosinase tampaknya mengikuti tren yang sama dengan kemampuan antioksidannya.

Tirosinase terutama terkait dengan pigmentasi kulit, mata, dan rambut. Memang, tirosinase adalah enzim melanogenesis yang terlibat dalam langkah pertama biosintesis melanin, dan melanin dikaitkan dengan perlindungan terhadap radiasi ultraviolet (UV), matahari, atau gamma, penurunan kerentanan seluler, dan resistensi dinding sel terhadap enzim hidrolitik [20]. Sebaliknya, kelebihan produksi melanin dapat berperan dalam anomali kulit atau penyakit yang lebih serius seperti kanker (misalnya Melanoma), dan kelebihan dopaquinone dapat menyebabkan penyakit neurodegeneratif (misalnya penyakit Parkinson) [20,25]. Selain itu, melanogenesis telah dilaporkan menghasilkan hidrogen peroksida dan ROS lainnya, mengekspos melanosit manusia pada stres oksidatif tingkat tinggi [26]. Beberapa senyawa antioksidan alami (fenolat, flavonoid, dan lain-lain) yang diperoleh dari tumbuhan dapat menghambat aktivitas tirosinase fenolase [27,28]. Di sini, ekstrak TAAR sepertinya mengandung senyawa yang rentan menghambat penuaan kulit dan melanogenesis.

3.4. Aktivitas Proteasome dari Ekstrak Kurma Akar Metanolik

Telah dilaporkan bahwa peningkatan kadar proteasome 20S menyebabkan peningkatan toleransi terhadap stres oksidatif [13]. Oleh karena itu, regulasi aktivitas proteasom oleh ekstrak akar kultivar BI, BNI, dan TAAR diselidiki. Aktivitas proteasome 20S yang diukur terkait dengan aktivitas seperti chymotrypsin (CT-L) dalam sel berumur NHDF (lihat Bahan dan Metode). Seperti yang diilustrasikan pada Gambar 2A, sel yang diberi perlakuan dengan 50 µg/mL ekstrak metanol selama 24 jam menunjukkan aktivasi CT-L yang signifikan untuk ekstrak BI dan TAAR dan penghambatan untuk BNI tanpa menghasilkan lebih dari 30 persen toksisitas sel. Ekstrak akar TAAR menunjukkan aktivasi proteasome yang menarik dibandingkan dengan 1µM asam lipoat (Ct plus ) (masing-masing 212 persen dan 248 persen ). Proteasome adalah kompleks proteinase silinder yang mengandung inti dari empat cincin bertumpuk yang bertanggung jawab untuk menghilangkan proteasome yang terdegradasi secara tidak normal (26S) dan protein yang rusak secara oksidatif (kompleks inti proteolitik 20S) (Ciechanover, 1998). Seperti yang disajikan dalam karya Hwang [29], disfungsi proteasome mungkin menjadi kontributor penuaan kulit manusia. Memang, penuaan dan replikasi sel tua telah terbukti mengalami penurunan aktivitas proteasome serta tingkat protein subunit proteasome. Fakta bahwa protein seluler teroksidasi dan / atau rusak terakumulasi lebih sering dalam sel-sel ini menunjukkan bahwa jalur degradasi protein ubiquitin-proteasome terlibat dalam proses penuaan intrinsik. Gambar 2B, dan C menunjukkan kemampuan ekstrak metanol TAAR untuk melindungi sel-sel berumur NHDF dari penghambatan aktivitas proteasom 20S oleh oksidan OCl−. Memang, oksidan OCl− menghambat 50 persen aktivitas proteasome dari sel kontrol (Ct), sedangkan aktivator 20S-proteasome tertinggi (asam lipoat pada 1 μM, Ct plus ) dengan lebih dari 50 persen aktivitas penghambatan gagal membalikkan penghambatan. aktivitas proteasome 20S oleh OCl−, sedangkan semua konsentrasi lain yang diuji (15, 50, dan 75 µg/mL) dari ekstrak metanol TAAR tampaknya membalikkan penghambatan ini (0 hingga 19 persen penghambatan). Hasil ini menunjukkan bahwa ekstrak akar TAAR mungkin mengandung molekul yang dapat menunda penuaan kulit tidak hanya dengan meningkatkan aktivitas proteasome tetapi juga dengan menangkal efek penghambatan agen pengoksidasi. Di antara molekul-molekul ini, asam caffeoyl shikimic kemungkinan besar ada, serta senyawa lainnya. Selanjutnya, analisis LC-DAD-MS (MS) dan NMR telah dilakukan untuk mengidentifikasi senyawa utama dari ekstrak dan dengan ini dibahas pada bagian selanjutnya.

3.5. Analisis Spektrometri

3.5.1. LC-DAD-MS Analisis Ekstrak Metanol

Studi komparatif akar kurma mengungkapkan tidak ada perbedaan kualitatif, tetapi sebaliknya, perbedaan semi-kuantitatif (dalam kromatogram DAD dan MS) antara kultivar (Gambar 3A, D) dicatat sampai tingkat tertentu. Memang, hasil ini tidak memungkinkan adanya hubungan antara ketahanan pohon kurma dengan peningkatan jumlah isomer posisi yang berbeda dari asam caffeoyl shikimic karena kultivar tahan (TAAR) menunjukkan kelimpahan relatif terendah dari senyawa ini (Gambar 3C). Ketiga isomer posisi asam caffeoyl shikimic (m/z=335.0768 dengan kesalahan 1,2 ppm) diidentifikasi oleh spektrum MS/MS (Gambar S6) dengan fragmen pada m/z 179.0340, sesuai dengan fragmen asam kafeat A (C9H7O4) dan fragmen pada m/z 135.0443, sesuai dengan dekarboksilasi asam kafeat (C8H7O2). Meskipun demikian, senyawa lain yang tidak sesuai dengan asam caffeoyl shikimic (Gambar 3C) dan yang waktu retensinya adalah 29 menit dengan m/z=259.0607 (atau 373.0543 untuk adukan TFA), tampaknya dapat dibedakan dengan jelas antara kultivar yang berbeda. (Gambar 3D). Perbedaan akumulasi senyawa ini pada akar kultivar sensitif dan tahan (0,135 persen ), dengan rasio sekitar 1:35 (dari m/z=259.06, data MS), dapat menjelaskan faktor biologis yang menonjol. aktivitas yang diamati untuk ekstrak metanol akar ini.

【Untuk info lebih lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】