Status Perlindungan Saraf Saat Ini pada Penyakit Jantung Bawaan Bagian 1

Abstrak:

Kehadiran DNA ektopik dalam sitoplasma menyebabkan peradangan dan kematian sel. Telah banyak dilaporkan bahwa kebocoran DNA inti ke dalam sitoplasma terutama dapat dirasakan oleh siklikGMP-AMP sintase (cGAS).

DNA adalah molekul yang menentukan informasi genetik setiap orang dan ditemukan di setiap sel kita. Penelitian terbaru menunjukkan bahwa DNA dapat bocor ke sitoplasma melalui jalur tertentu dan memengaruhi ingatan kita.

Fenomena ini umum terjadi pada orang lanjut usia dan orang dengan gangguan kognitif. Ketika DNA bocor ke dalam sitoplasma, hal itu mengganggu fungsi normal di dalam sel dan meningkatkan risiko kehilangan memori dan gangguan kognitif.

Namun, kita tidak perlu merasa tertekan dan putus asa akan hal ini. Ada banyak cara untuk meningkatkan daya ingat dan kemampuan kognitif untuk membantu kita menjaga kesehatan otak.

Pertama, Anda harus menjaga gaya hidup sehat. Ini termasuk makan makanan seimbang, cukup tidur, berolahraga ringan, dan mengurangi stres. Praktik-praktik ini meningkatkan kesehatan otak, sehingga menghindari kebocoran DNA dan meningkatkan daya ingat.

Kedua, pelatihan kognitif diperlukan. Hal ini dapat mencakup bermain game matematika, membaca, mempelajari keterampilan baru, dll. Aktivitas ini dapat membantu menstimulasi otak dan mendorong neurogenesis untuk menghindari kebocoran DNA.

Terakhir, pertahankan sikap positif. Ketidakstabilan emosi dan stres berlebihan dapat menyebabkan perubahan kimia otak yang memicu kebocoran DNA. Oleh karena itu, kita perlu belajar menghadapi tantangan hidup secara positif dan menjaga sikap optimis.

Singkatnya, meskipun kebocoran DNA ke dalam sitoplasma dapat memengaruhi daya ingat, kita dapat meningkatkan kesehatan otak, menghindari kebocoran DNA, dan pada akhirnya meningkatkan daya ingat kita dengan menerapkan gaya hidup yang benar, melakukan pelatihan kognitif, dan mempertahankan pola pikir positif. Memori dan kemampuan kognitif. Terlihat bahwa kita perlu meningkatkan daya ingat, dan Cistanche deserticola dapat meningkatkan daya ingat secara signifikan karena Cistanche deserticola merupakan bahan obat tradisional Tiongkok yang memiliki banyak khasiat unik, salah satunya meningkatkan daya ingat. Khasiat Cistanche deserticola berasal dari berbagai bahan aktif yang dikandungnya, antara lain asam tanat, polisakarida, glikosida flavonoid, dll. Bahan-bahan tersebut dapat meningkatkan kesehatan otak melalui berbagai jalur.

improve memory

Klik tahu 10 cara meningkatkan daya ingat

Kami baru-baru ini melaporkan bahwa DNA untai ganda sitoplasma (dsDNA) yang diturunkan dari mitokondria yang telah lolos dari degradasi lisosom menginduksi sitotoksisitas yang signifikan dalam sel yang dikultur dan in vivo. DNA mitokondria sitoplasma diasumsikan terlibat dalam berbagai penyakit dan kelainan, dan semakin banyak makalah yang diterbitkan untuk mengkonfirmasi hal ini. Di sisi lain, metode yang ada saat ini untuk mengevaluasi DNA mitokondria dalam sitoplasma mungkin tidak bersifat kuantitatif.

Di sini, kami memperkenalkan secara rinci metode untuk mengevaluasi sel DNA mitokondria ektopik. Metode ini berguna dalam penelitian dasar serta studi tentang penuaan, penyakit Parkinson, penyakit Alzheimer, gagal jantung, penyakit autoimun, kanker, dan kondisi lainnya.

Kata kunci: DNA ektopik; DNA mitokondria; faktor transkripsi mitokondria A (TFAM); penyakit Parkinson.

1. Perkenalan

DNA mengandung informasi penting untuk kelangsungan hidup dan pewarisan, dan perlu dilindungi dari berbagai pemicu stres, termasuk oksidan dan mutagen. Sel eukariotik mengandung mitokondria, yang menghasilkan energi, bersama dengan banyak spesies oksigen aktif, melalui respirasi aerobik.

Jadi, dalam sel eukariotik, DNA ada di dalam nukleus atau mitokondria, masing-masing dikemas di dalam membran inti atau membran mitokondria. Namun, DNA dapat ada di sitoplasma dalam kondisi tertentu, seperti selama infeksi virus atau non-virus [1– 4].

Bahkan dalam beberapa kondisi non-infeksi (misalnya, penuaan atau berbagai kelainan terkait usia atau kanker), DNA mungkin bocor ke dalam sitoplasma dari nukleus atau mitokondria [5-7].

DNA dalam sitoplasma dapat bersifat inflamasi dan beracun bagi sel. Telah banyak dilaporkan bahwa kebocoran DNA inti ke dalam sitoplasma menginduksi peradangan, sitotoksisitas, dan fenotip sekretori terkait penuaan (SASP), terutama melalui stimulator siklik GMP-AMP sintase (cGAS) dari jalur gen interferon (STING) [ 5,6].

Kami baru-baru ini melaporkan bahwa DNA untai ganda sitosol (dsDNA) asal mitokondria yang lolos dari degradasi lisosom terbukti menginduksi sitotoksisitas dan neurodegenerasi pada model seluler penyakit Parkinson [8]. Kehadiran atau peningkatan DNA ektopik sering kali ditunjukkan oleh gambar mikroskopis yang representatif dan bukti tidak langsung, bukan oleh peningkatan kebocoran DNA itu sendiri.

short term memory how to improve

Diharapkan evaluasi DNA ektopik ini menjadi semakin penting, tidak hanya untuk penelitian dasar tetapi juga untuk penelitian tentang penuaan dan penyakit lainnya, seperti penyakit Parkinson, penyakit Alzheimer, amyotrophic lateral sclerosis, gagal jantung, penyakit autoimun, diabetes, steatohepatitis non-alkohol (NASH), dan kanker. Jalur cGAS-STING telah dilaporkan penting tidak hanya pada penuaan namun juga pada patogenesis penyakit ini [8-17].

Mungkin karena keadaan oksidatif di sekitar mitokondria dan kurangnya sistem perbaikan DNA yang efisien untuk DNA mitokondria, DNA mitokondria jauh lebih rentan terhadap mutasi atau kerusakan dibandingkan DNA inti [18,19].

Tidak seperti DNA inti, DNA mitokondria terdapat dalam banyak salinan dalam satu sel dan disintesis sesuai kebutuhan. Oleh karena itu, DNA mitokondria mungkin memiliki peluang lebih besar untuk bocor ke sitoplasma selama penuaan atau dalam kondisi ganas seperti kelainan terkait usia, disfungsi mitokondria. , atau kanker.

Deteksi dan pengukuran DNA sitoplasma mitokondria dapat menjadi penting dalam memahami patogenesis berbagai penyakit dan penuaan serta dapat menjadi biomarker dan target terapi.

Kami mengembangkan metode semi-kuantitatif untuk mengevaluasi kebocoran DNA mitokondria ektopik ke dalam sitoplasma, dan di sini kami menjelaskan metode tersebut secara rinci. Makalah ini memungkinkan evaluasi obyektif kebocoran DNA mitokondria dan berguna dalam studi berbagai patologi penyakit.

2. Bahan-bahan dan metode-metode

2.1. Garis Sel, Perawatan siRNA, dan Analisis PCR Kuantitatif (qPCR).

Sel HeLa berasal dari sel kanker serviks pasien wanita (ATCC,CCL-2). Sel HeLa dikultur pada suhu 37 ◦C di bawah 5% CO2 di Dulbecco's Modified EagleMedium (DMEM) (Nacalai Tesque, Kyoto, Jepang) yang dilengkapi dengan 10% janin bovineserum (FBS) (Biowest, Nuaillé, Prancis) dan larutan penisilin-streptomisin ( 100 unit/mLpenisilin G dan 100 µg/mL streptomisin sulfat, Wako, Osaka, Jepang).

Sehari sebelum transfeksi, sel HeLa dilapis dengan kepadatan 600 sel/µL. Ekspresi gen yang menarik dibungkam dalam sel HeLa menggunakan Stealth RNAi siRNA (faktor transkripsi mitokondria A, TFAM: HSS144251, glucocerebrosidase, GBA: HSS178140, Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA) dalam Reagen Transfeksi Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) menurut instruksi pabriknya (konsentrasi RNA akhir 10 nM).

Tiga hari setelah siRNA knockdown, total RNA seluler diisolasi menggunakan reagen TRIzol sesuai dengan instruksi pabrik (Thermo Fisher Scientific). Templat cDNA disintesis dari RNA yang dimurnikan menggunakan Kit Sintesis cDNA First Strand ProtoScript II (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) dengan primer oligo (dT) 20. qPCR dilakukan menggunakan TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio, Kusatsu , Jepang) dan dianalisis dalam Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Takara Bio). Primer PCR yang digunakan dalam penelitian ini adalah GBA forward (TGCTGCTCTCAACATCCTTGCC), GBA reverse (TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC), TFAM forward (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC), TFAM reverse (GCATCTGGGTTCTGAGCTTTA), Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH) forward (CAGCCTCAAGATCATCAGCA), dan GAPDH terbalik (TGTGGTCATGAGTCCTTCCA).

Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism versi 9.3.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Uji-t Student dua sisi digunakan untuk membandingkan rata-rata aritmatika antara dua kelompok. Data disajikan sebagai rata-rata dan ± kesalahan standar rata-rata.

2.2. Deteksi Imunofluoresensi DNA Mitokondria Ektopik dan Analisis Gambar

Satu hari sebelum transfeksi, sel HeLa dilapisi dengan kepadatan 600 sel/µL. Ekspresi gen yang diinginkan dibungkam dalam sel HeLa menggunakan Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) dalam Reagen Transfeksi Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) menurut ke instruksi pabrik (konsentrasi RNA akhir 10 nM).

ways to improve memory

Tiga hari setelah siRNA knockdown, sel-sel menjadi sasaran pewarnaan imunofluoresensi. Untuk mendeteksi DNA mitokondria, antibodi anti-dsDNA (Abcam,Cambridge, UK, clone 35I9, Cat# ab27156, RRID: AB_470907 atau EMD Millipore, Billerica,MA, USA, clone AC-30-10 , Cat# CBL186, RRID: AB_11213573) menunjukkan rasio signal-to-noise yang lebih baik dibandingkan Hoechst 33258, DAPI, atau Picogreen. Di sini kami menggabungkan tiga antibodi utama: antibodi anti-dsDNA (DNA 35I9) (Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907), antibodi anti-histone-H2B (Abcam, Cat# ab134211), dan anti-panas- antibodi kejutan-protein-60 (Hsp60) (Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB_881444).

Antibodi lain dapat dipilih atau ditandai secara fluoresensi dengan histon, atau Hsp60 dapat digunakan sebagai alternatif, namun perlu mengoptimalkan kondisi pewarnaan rangkap tiga untuk setiap kombinasi.

Sel dicuci dua kali dengan saline fosfat (PBS) dan difiksasi dengan metanol dingin selama 10 menit pada suhu 4◦C. Alternatifnya, paraformaldehyde (PFA) 4% dapat digunakan untuk fiksasi, tetapi sinyal latar belakangnya tampak jauh lebih besar pada sampel yang difiksasi PFA. Setelah fiksasi, sel-sel dicuci tiga kali dengan larutan salin fosfat dengan Tween 20 (PBST) masing-masing selama 5 menit. Sel diresapi dengan PBS yang mengandung 0,2% (b/v) Triton X-100 selama 10 menit.

Setelah dicuci tiga kali dengan PBST selama 5 menit setiap kali, sel diinkubasi dengan 2% (b/v) bovine serum albumin (BSA) dalam PBST selama 30 menit. Sel-sel diinkubasi dengan antibodi primer tunggal, antibodi anti-histone-H2B (1/400, Abcam, Cat# ab134211) yang diencerkan dalam 2%(b/v) BSA dalam PBST O/N pada suhu 4 ◦C. Setelah dicuci tiga kali dengan PBST selama 5 menit setiap kali, sel diinkubasi dengan Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey anti-Chicken IgY(IgG) (H+L) (1/200, Wako, Cat# {{17 }}) diencerkan dalam 2% (b/v) BSA dalam PBST selama 1 jam pada suhu kamar (RT).

Setelah dicuci tiga kali selama 5 menit setiap kali dengan PBST, sel diinkubasi dengan antibodi primer, dan antibodi anti-dsDNA (35I9 DNA) (1/800, Abcam,Cat# ab27156, RRID: AB_470907) dan anti -Antibodi Hsp60 (1/400, Abcam, Cat# ab46798,RRID: AB_881444) diencerkan dalam 2% (b/v) BSA dalam PBST diaplikasikan selama 1 jam di RT atau semalaman (O/N) di 4◦C.

Setelah dicuci tiga kali dengan PBST selama 5 menit setiap kali, sel diinkubasi dengan Alexa Fluor 680-konjugasi Donkey anti-Kelinci IgG(H+L) yang teradsorpsi silang tinggi (1/200, Thermo Fisher Scientific, Cat# A10043 , RRID: AB_2534018) dan Donkeyanti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200, Abcam Cat# ab150108, RRID: AB_2732073)diencerkan dalam 2% (b/v) BSA di PBST selama 1 jam di RT.

memory enhancement