Status Perlindungan Saraf Saat Ini pada Penyakit Jantung Bawaan Bagian 2

Gambar mikroskopis kemudian dilakukan penghitungan gambar menggunakan perangkat lunak ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Sinyal Hsp60 dikalikan dengan “x”.

Hsp60 adalah molekul protein penting yang memainkan peran biologis penting dalam tubuh manusia. Penelitian beberapa tahun terakhir menunjukkan bahwa keberadaan Hsp60 erat kaitannya dengan ingatan manusia.

Hsp60 adalah protein pendamping molekuler yang terutama terlibat dalam pelipatan, pembukaan, stabilisasi, dan degradasi protein. Proses-proses ini sangat penting untuk metabolisme normal dan fungsi seluler tubuh manusia. Di saat yang sama, Hsp60 juga memiliki efek antioksidan, antiinflamasi, dan imunomodulator, serta berperan besar dalam menjaga kesehatan manusia dan keseimbangan sistem kekebalan tubuh.

Penelitian telah menemukan bahwa Hsp60 memainkan peran penting dalam pembentukan dan pemeliharaan memori. Selama proses belajar dan mengingat, sel otak menghasilkan molekul Hsp60 dalam jumlah besar. Molekul-molekul ini dapat melindungi sel dari gangguan dan kerusakan dari lingkungan luar untuk menjamin kelancaran kemajuan pembelajaran dan memori. Selain itu, Hsp60 juga dapat mempengaruhi pemikiran dan perilaku manusia dengan mengubah transduksi sinyal sel otak dan perkembangan neuron serta berdampak positif pada kognisi dan ketahanan terhadap stres.

Meskipun peran Hsp60 telah menunjukkan efek positif pada tubuh manusia, masyarakat juga perlu menyadari bahwa kelebihan dan kekurangan Hsp60 dapat berdampak negatif pada kesehatan manusia. Oleh karena itu, kita harus secara aktif mengeksplorasi dan mempelajari mekanisme Hsp60 dalam berbagai kondisi fisiologis dan patologis tubuh manusia untuk lebih memahami posisi dan peran Hsp60 dalam kesehatan manusia. Terlihat bahwa kita perlu meningkatkan daya ingat, dan Cistanche deserticola dapat meningkatkan daya ingat secara signifikan, karena Cistanche deserticola memiliki efek antioksidan, anti inflamasi, dan anti penuaan, yang dapat membantu mengurangi reaksi oksidasi dan inflamasi di otak, sehingga melindungi otak. kesehatan sistem saraf. Selain itu, Cistanche deserticola juga dapat mendorong pertumbuhan dan perbaikan sel saraf, sehingga meningkatkan konektivitas dan fungsi jaringan saraf. Efek ini dapat membantu meningkatkan daya ingat, kemampuan belajar, dan kecepatan berpikir, serta mencegah berkembangnya disfungsi kognitif dan penyakit neurodegeneratif.

Klik Tahu untuk meningkatkan memori jangka pendek

Nilai "x" ditentukan sebagai berikut: mengurangkan sinyal Hsp60 yang dilipat "x" dari sinyal DNA mitokondria pada kelompok kontrol membuat nilai DNA mitokondria kurang dari atau sama dengan nol. Sinyal histone H2B dikalikan dengan "y".

Nilai "y" ditentukan sebagai berikut: mengurangkan sinyal histone-H2B yang dilipat "y" dari sinyal DNA-nuklir pada kelompok kontrol membuat nilai DNA-nuklir kurang dari atau sama dengan nol. Jika sinyal latar belakang menjadi tinggi akibat perkalian, kontras gambar yang dikalikan dapat disesuaikan untuk kondisi yang sama di semua sampel.

Gambar pewarnaan dsDNA, dikurangi gambar yang disesuaikan dari perkalian Hsp60 dan histone H2B, digunakan untuk analisis selanjutnya. Dengan menggunakan fungsi "Adjust-Threshold", gambar-gambar ini dibinarisasi. Kami memilih puncta dsDNA dengan ukuran mulai dari 2 hingga 20 µm2 (kelilingan0,1–1,0), dan dihitung menggunakan fungsi "Analisis-Analisis Partikel".

2.3. Mikroskop elektron

Satu hari sebelum transfeksi, sel HeLa dilapisi dengan kepadatan 600 sel/µL. Ekspresi gen yang diinginkan dibungkam dalam sel HeLa menggunakan Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) dalam Reagen Transfeksi Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) menurut ke instruksi pabrik (dengan konsentrasi RNA akhir 10 nM).

Empat hari setelah siRNA knockdown, sel dikenakan fiksasi. Sampel kultur sel difiksasi dengan 2% PFA dan 2% glutaraldehid dalam 0.1 M phosphatebuffer, pH 7,4, pada suhu 37 ◦C, kemudian ditempatkan dalam wadah 4 ◦C lemari es selama 30 menit. Sampel difiksasi dalam 2% glutaraldehid dalam buffer fosfat 0.1 M semalaman pada suhu 4 ◦C. Sampel dicuci tiga kali dengan buffer fosfat 0,1 M selama 30 menit dan pasca-fiksasi dengan osmiumtetroksida 2% dalam buffer fosfat 0,1 M pada suhu 4 ◦C selama 1 jam.

Sampel adalah larutan etanol terdehidrasi yang didehidrasi, dipindahkan ke resin (Quetol-812, Nisshin EM Co., Tokyo, Jepang), dan dipolimerisasi pada suhu 60 ◦C selama 48 jam. Resin terpolimerisasi dipotong menjadi bagian ultra tipis 70-nm dengan pisau berlian menggunakan ultramicrotome (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) dan kemudian dipasang pada jaringan tembaga.

Bagian diwarnai dengan 2% uranil asetat di RT selama 15 menit dan dicuci dengan air suling, diikuti pewarnaan sekunder dengan larutan pewarna timbal (Sigma-Aldrich, Tokyo, Jepang) di RT selama 3 menit.

Grid diamati di bawah mikroskop elektron transmisi (JEM-1400Plus, JEOL Ltd., Tokyo, Jepang) pada tegangan akselerasi 80 kV (otak ikan zebra) atau 100 kV (sel), dan gambar direkam menggunakan kamera charge-kopling-device (CCD) (EM-14830RUBY2,JEOL Ltd.) .

2.4. Mikroskop Imunoelektron

Sampel pada cakram emas dibekukan dalam propana cair pada suhu −175 ◦C. Setelah sampel dibekukan, sampel tersebut disubstitusi beku dengan 1% asam tanat dalam etanol dan 2% air suling pada suhu −80 ◦C selama 24 jam.

Sampel kemudian disimpan pada suhu −20 ◦C selama 4 jam, diikuti dengan inkubasi pada suhu 4 ◦C selama 1 jam. Selanjutnya sampel didehidrasi dalam etanol anhidrat 3 kali selama 30 menit. setiap kali, dilanjutkan dengan infiltrasi dengan campuran etanol dan resin 50:50 (LR putih: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) pada suhu 4 ◦C selama 1 jam. Sampel dipindahkan ke resin 100% segar dan diinkubasi pada suhu 4 ◦C selama 30 menit, dan proses ini diulangi tiga kali.

Sampel dipindahkan ke resin 100% segar dan dipolimerisasi pada 50 ◦CO/N. Resin terpolimerisasi dipotong sangat tipis pada 90 nm dengan pisau berlian menggunakan ultramikrotom (Ultracut UCT; Leica), dan bagian tersebut ditempatkan pada kisi-kisi nikel. Grid diinkubasi dengan antibodi anti-dsDNA (35I9 DNA)(1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) dalam 1% BSA/PBS pada 4 ◦CO/N, diikuti dengan tiga kali pembilasan dengan 1% BSA/PBS masing-masing selama 1 menit.

Mereka kemudian diinkubasi dengan antibodi sekunder yang terkonjugasi dengan partikel emas berukuran {{0}}nm (antibodi poliklonal IgG anti-Tikus Kambing) selama 2 jam di RT. Setelah dibilas dengan PBS, grid ditempatkan dalam 2% glutaraldehid dalam buffer cacodylate 0,1 M.

Setelah itu, grid dikeringkan dan kemudian diwarnai dengan 2%uranil asetat selama 15 menit dan dengan larutan pewarna timbal (Sigma-Aldrich) di RT selama 3 menit. Grid diamati melalui mikroskop elektron transmisi (JEM-1400 plus; JEOLLtd.) pada tegangan akselerasi 100 kV. Gambar digital diperoleh dengan kamera CCD (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Hasil

3.1. Penurunan TFAM atau GBA Menginduksi Peningkatan DNA Mitokondria Ektopik

Pertama, kami menunjukkan contoh deteksi DNA sitoplasma yang diturunkan dari mitokondria dalam sel HeLa di mana protein TFAM dihancurkan oleh siRNA (Gambar 1A). TFAM adalah faktor transkripsi mitokondria utama dan juga berfungsi dalam replikasi dan perbaikan DNA mitokondria [20] .

Polimorfisme sekuens pada gen ini dilaporkan berhubungan dengan penyakit Parkinson [21,22]. Setelah 3 hari knockdown protein TFAM, banyak titik DNA untai ganda terdeteksi di sitoplasma sel HeLa.

Histon adalah penanda positif untuk DNA asal nuklir di sitoplasma, dan penanda negatif untuk DNA mitokondria dan DNA asal mitokondria di sitoplasma [23]. Titik-titik ini tidak berkolokasi dengan histon, sehingga menunjukkan bahwa mereka bukan DNA turunan nuklir. Selain itu, beberapa titik DNA ektopik sitoplasma ini tidak berkolokasi dengan Hsp60, penanda matriks mitokondria, yang menunjukkan bahwa titik-titik tersebut berada di luar mitokondria (Gambar 1B, C).

Mikroskop elektron juga menunjukkan bahwa DNA ektopik bocor dari mitokondria (Gambar 2A, B). Singkatnya, peningkatan titik DNA ektopik dalam sitoplasma oleh knockdown TFAM disebabkan oleh kebocoran DNA mitokondria dari mitokondria. Kedua, kami menunjukkan contoh lain dari deteksi DNA sitoplasma yang diturunkan dari mitokondria dalam sel HeLa di mana protein GBA dirobohkan oleh siRNA. (Gambar 1A).

GBA adalah gen penyebab penyakit Gaucher, namun mutasi GBA heterozigot juga merupakan faktor risiko penyakit Parkinson [24]. Banyak titik DNA untai ganda terdeteksi di sitoplasma sel HeLa setelah 3 hari penghancuran protein GBA. Beberapa titik DNA terlokalisasi bersama dengan histon, menunjukkan bahwa titik-titik tersebut adalah DNA yang berasal dari nuklir.

Titik-titik DNA lainnya tidak terlokalisasi bersama dengan histon, menunjukkan bahwa titik-titik tersebut bukanlah DNA yang berasal dari nuklir tetapi DNA yang berasal dari mitokondria (Gambar 1D). Singkatnya, peningkatan titik DNA ektopik di sitoplasma akibat knockdown GBA setidaknya sebagian disebabkan oleh kebocoran DNA mitokondria dari mitokondria.

For more information:1950477648nn@gmail.com