Kemanjuran Pembatasan Kalori Peka Usia Pada Biogenesis Mitokondria Dan Kerusakan MtDNA Pada Hati Tikus

Mohon hubungi{0}}untuk informasi lebih lanjut

Abstrak:Pembatasan kalori (CR) adalah pengobatan yang paling manjur untuk menunda timbulnya perubahan terkait usia seperti disfungsi mitokondria. Namun, sensitivitas penanda mitokondria terhadap CR dan batas kemanjuran CR terkait usia tidak sepenuhnya dijelaskan. Kami menggunakan sampel hati dari tikus yang diberi makan ad libitum (AL) yang dibagi menjadi:18-umur bulan (AL-18), 28-umur bulan (AL-28) , dan kelompok 32-bulan (AL-32), dan dari kelompok yang diberi CR (CR) 28-bulan (CR-28) dan 32- month-old(CR-32)bersama untuk menguji efek CR pada beberapa penanda mitokondria. Penurunan terkait usia dalam aktivitas sintase sitrat, dalam jumlah protein TFAM, MFN2, dan DRP1, dan dalam kandungan mtDNA dalam kelompok AL-28 dicegah pada rekan-rekan CR-28. Dengan demikian, CR mengurangi kerusakan mtDNA oksidatif yang dinilai melalui kejadian purin teroksidasi pada daerah mtDNA tertentu pada hewan CR-28. Temuan ini mendukung efek anti-penuaan CR hingga 28 bulan. Sebaliknya, jumlah protein LonP1, Cyt c, OGG1, dan APE1 dan konten penghapusan mtDNA 4,8 Kb tidak terpengaruh pada tikus CR-28. Tidak adanya perbedaan yang signifikan antara nilai AL-32 dan CR-32 menunjukkan batas CR yang berkaitan dengan usia pada usia ini.vitamin c puritanNamun, ini hanya sebagian membatasi manfaat CR dalam menangkal penurunan penuaan umum dan keterlibatan mitokondria terkait.

Kata kunci:hati tikus; penuaan; pembatasan kalori; biogenesis mitokondria; kerusakan mtDNA; kemanjuran CR . yang peka terhadap usia

KSL21

Silakan klik di sini untuk tahu lebih banyak

1. Perkenalan

Menurut kemajuan mengesankan dari studi menyelidiki proses penuaan, beberapa definisi yang berbeda dari proses telah disusun secara berurutan, dan satu set jalur dan mediator telah diidentifikasi sebagai apa yang disebut keunggulan penuaan [1,2]. Di antaranya, disfungsi mitokondria, stres oksidatif, dan kerusakan molekuler mitokondria telah muncul sebagai faktor penting. Fitur penting dari penuaan adalah spesifisitas jaringan yang telah disorot untuk keterlibatan mitokondria [3,4], perubahan epigenetik [5], dan perubahan lain seperti panjang telomer [6]. Di antara berbagai perawatan yang bertujuan untuk mencegah atau menunda timbulnya perubahan terkait usia, pembatasan kalori (CR) adalah strategi tertua yang diusulkan [7], dan masih merupakan standar emas untuk sejumlah besar efek menguntungkan yang disampaikan oleh intervensi ini. Memang, studi terbaru tentang mekanisme molekuler yang ditimbulkan oleh CR telah menunjukkan bahwa beberapa jalur dipengaruhi secara positif oleh intervensi nutrisi ini [8-10].sistancheSelanjutnya, temuan ini juga sangat mendukung keberadaan "plastisitas" penuaan [5,9,11,12] yang dapat dimodulasi melalui interaksi lingkungan seperti intervensi nutrisi atau farmasi atau kebiasaan gaya hidup. CR telah terbukti melawan perubahan terkait usia dari biogenesis mitokondria dan metabolisme di beberapa jaringan tikus dengan efek spesifik jaringan [3,13,14]. Lebih khusus lagi, penelitian sebelumnya oleh kelompok kami pada hati tikus, yang sangat dipengaruhi oleh penuaan pada tingkat mitokondria, memeriksa penanda organel menunjukkan efek positif CR pada perubahan terkait usia mitokondria. Faktanya, pada tikus berumur 28-bulan yang diobati dengan CR, kandungan DNA mitokondria (mtDNA), jumlah protein yang terlibat dalam biogenesis mitokondria atau peka ROS, dan tingkat pengikatan faktor transkripsi mitokondria A (TFAM) di wilayah mtDNA tertentu menunjukkan nilai yang berbeda secara signifikan dari rekan-rekan yang diberi makan ad libitum (AL) sesuai usia dan tidak berbeda secara statistik dari hewan yang diberi makan AL berusia 18-bulan yang lebih muda [15]. Baru-baru ini, analisis biogenesis mitokondria dan kerusakan mtDNA di hati dari tikus berusia AL (28-bulan) dan sangat tua (32-bulan), memungkinkan kami untuk mempelajari beragam parameter mitokondria dan untuk menunjukkan kecepatan penuaan yang berbeda dalam kaitannya dengan keterlibatan mitokondria, pada beberapa hewan yang secara alami mencapai umur panjang sehubungan dengan sebagian besar dari mereka yang menjadi tua [16,17]. Dengan premis ini, kami bertujuan untuk menilai kemanjuran CR pada sejumlah besar penanda mitokondria pada berbagai usia di hati tikus. Untuk tujuan ini, kami menggunakan hewan dari galur hibrida berumur panjang Fischer 344× Brown Norway, dimana 18-tikus yang diberi makan ad libitum (AL-18) berumur 18-bulan dipilih sebagai kontrol, untuk dibandingkan dengan hewan yang diberi makan ad libitum, berumur(AL-28) dan sangat tua(AL-32) dan hewan yang cocok dengan umur yang diberi perlakuan CR(CR-28 dan CR{ {39}}). Pada kelompok tikus ini, kami mengevaluasi: Aktivitas enzim mitokondria sitrat sintase, ekspresi satu set protein termasuk TFAM, Lon protease (LonP1) dan sitokrom c(Cyt c), enzim perbaikan mtDNA 8- oxo DNA glycosylase/apurinic atau apyrimidinic(AP) lyase (OGG1) dan apurinic/apyrimidinic endonuclease 1(APE1), dan protein dinamika mitokondria mitofusin 2 (MFN2) dan protein terkait dinamin 1 (DRP1). Akhirnya, kandungan mtDNA dan kerusakan oksidatif di wilayah tertentu juga ditentukan.

2. Hasil

2.1.Eoevaluasi Usia dan Efek CR pada Penanda Fungsi Mitokondria

Aktivitas sintase sitrat, yang juga merupakan penanda massa mitokondria, ditentukan pada kelima kelompok tikus untuk mengevaluasi sensitivitas fungsi mitokondria terhadap penuaan dan CR (Gambar 1).

Penurunan signifikan secara statistik terkait usia dalam aktivitas sitrat sintase diamati pada tikus AL-28(-41 persen ) dan AL-32(-40 persen ) dibandingkan dengan AL{{ 5}} kontrol usia. Tidak ditemukan perbedaan yang signifikan secara statistik antara kelompok AL-28 dan AL-32. Efek CR ditunjukkan oleh aktivitas enzim yang secara signifikan lebih tinggi (ditambah 40 persen) pada tikus CR-28 dibandingkan dengan nilai tikus AL-28 yang sesuai usia. Selanjutnya, aktivitas CR-28 serupa dengan yang diamati pada tikus kontrol AL-18 yang lebih muda (Gambar 1). Efek ini malah tumpul pada hewan CR-32. Faktanya, pada usia yang lebih tua dari 32 bulan, tidak ada perbedaan statistik yang dapat diamati antara kelompok AL dan CR.

KSL22

cistanche dapat anti-penuaan

Untuk memperdalam analisis usia dan efek CR pada fungsionalitas mitokondria, jumlah protein TFAM dan LonP1 ditentukan dalam mitokondria yang diisolasi dari semua kelompok tikus dengan analisis Western blot, di mana protein dari membran luar mitokondria VDAC digunakan sebagai kontrol pemuatan internal (Gambar 2).

Gambar 2. Jumlah protein TFAM dan LonP1 dalam mitokondria hati yang diisolasi dari AL-18, AL-28, CR-28, AL-32, dan CR-32-bulan -tikus tua. (SEBUAH). Jumlah protein TFAM dalam mitokondria hati yang diisolasi dari kelompok tikus yang berbeda. Pada inset, Western blot representatif dilakukan pada satu tikus dari masing-masing kelompok yang diuji. Pita imunoreaktif, dari atas ke bawah, masing-masing mewakili sinyal dari TFAM dan VDAC. Histogram menunjukkan kuantifikasi intensitas pita TFAM, dinormalisasi dengan intensitas VDAC.(B). Jumlah protein LonP1 dalam mitokondria hati yang diisolasi dari kelompok tikus yang berbeda. Pada inset, Western blot representatif dilakukan pada satu tikus dari masing-masing kelompok yang diuji. Dari atas ke bawah, pita imunoreaktif masing-masing mewakili sinyal dari LonP1 dan VDAC.apa itu cistanche?Histogram menunjukkan kuantifikasi intensitas pita LonP1, dinormalisasi dengan intensitas VDAC.(A, B)Data mewakili hasil dari percobaan Western blot rangkap tiga dan dianalisis menggunakan uji One-way ANOVA dan uji perbandingan ganda Tukey . Batang mewakili nilai rata-rata dan SD untuk lima kelompok eksperimen. Data dinormalisasi terhadap nilai tikus AL-18, ditetapkan sebagai 1.*p<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.="" n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" aging="" led="" to="" a="" statistically="" significant="" (-31%)decrease="" in="" the="" tfam="" amount="" comparing="" al-18="" control="" rats="" with="" both="" al-28="" and="" al-32="" animals,="" whereas="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" values="" of="" al-28="" and="" al-32="" groups.="" as="" an="" effect="" of="" cr,="" the="" cr-28="" rats="" had="" a="" tfam="" amount="" significantly="" higher(+39%)="" than="" that="" of="" the="" age-matched="" al="" counterparts="" and="" not="" different="" from="" that="" of="" the="" younger="" al-18="" controls.="" conversely,="" such="" diet="" effect="" was="" not="" visible="" anymore="" in="" the="" cr-32="" animals="" that="" showed="" a="" tfam="" amount="" not="" statistically="" different="" from="" that="" of="" the="" age-matched="" al="" group="" and="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" al-18="" rats.="" as="" for="" the="" lonp1="" amount,="" there="" was="" a="" statistically="" significant="" (-65%)="" age-related="" decrease="" in="" the="" al-28="" group="" with="" respect="" to="" the="" al-18="" value.="" the="" age="" progression="" made="" the="" statistically="" significant="" decrease="" in="" the="" lonp1="" amount,="" with="" respect="" to="" the="" al-18="" rats,="" more="" marked(-75%)in="" the="" al-32="" group.="" interestingly,="" there="" was="" no="" evident="" effect="" of="" cr="" on="" the="" lonp1="" amount="" since="" the="" comparison="" between="" the="" al-28="" value="" and="" the="" cr="" age-matched="" counterpart="" did="" not="" show="" any="" significant="" difference="" and="" the="" same="" occurred="" for="" the="" comparison="" between="" the="" al-32="" and="" cr-32="">

KSL23

Untuk mengevaluasi efek penuaan dan CR pada fungsi metabolisme mitokondria lain yang merupakan inisiasi jalur apoptosis intrinsik mitokondria, kami menentukan, dengan eksperimen Western blot, jumlah Cyt c intra-mitokondria (Gambar 3).

Gambar 3. Jumlah protein Cyt c dalam mitokondria hati yang diisolasi dari AL-18, AL-28, CR-28, AL-32, dan CR-32-bulan- tikus tua. Pada inset, Western blot representatif dilakukan pada satu tikus dari masing-masing kelompok yang diuji. Dari atas ke bawah, pita imunoreaktif masing-masing mewakili sinyal dari Cyt c dan VDAC. Histogram menunjukkan kuantifikasi intensitas pita Cyt c yang dinormalisasi dengan intensitas VDAC. Semua data mewakili hasil dari percobaan Western blot rangkap tiga dan dianalisis menggunakan uji ANOVA satu arah dan uji perbandingan ganda Tukey. Batang mewakili nilai rata-rata dan SD untuk lima kelompok eksperimen. Data dinormalisasi terhadap nilai tikus AL-18, ditetapkan sebagai 1.* p<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.="" n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" the="" age-related="" effect="" on="" the="" intra-mitochondrial="" cyt="" c="" amount="" was="" peculiar="" since="" there="" was="" a="" marked(-44%)statistically="" significant="" decrease="" passing="" from="" the="" al-18="" rats="" to="" the="" al-28="" animals,="" but="" such="" decrease="" was="" partially="" prevented="" in="" the="" al-32="" group="" showing="" a="" small(-13%)="" decrease="" in="" comparison="" with="" the="" al-18counterpart="" and="" a="" significant="" marked="" (+55%)="" increase="" in="" comparison="" with="" the="" al-28="" rats.="">Cistanche anti penuaanEfek CR tidak relevan sama sekali karena tidak ada perbedaan yang signifikan dalam jumlah protein Cyt c antara kelompok AL dan CR yang sesuai usia pada 28 serta pada 32 bulan. Penurunan terkait usia dalam jumlah Cyt c pada kedua kelompok menunjukkan tren yang serupa dengan yang diamati pada kelompok AL-28 dan AL-32 dengan penurunan yang lebih relevan pada hewan CR-28 sebagian dicegah pada tikus CR-32 yang lebih tua.

2.2.Evaluasi Usia dan Efek CR pada Enzim Perbaikan mtDNA

Karena penuaan sebagian besar terbukti terkait dengan akumulasi kerusakan mtDNA, kami mengukur, dengan eksperimen Western blot, dalam mitokondria hati yang terisolasi, ekspresi dua enzim perbaikan mtDNA utama, yaitu 8-oxo DNA glycosylase/apurinic atau apyrimidinic(AP)lyase (OGG1) dan apurinic/apyrimidinic endonuclease 1(APE1), keduanya terlibat dalam perbaikan eksisi dasar (BER) yang merupakan mekanisme perbaikan mtDNA yang lazim (Gambar 4).

Gambar 4. Jumlah protein OGG1 dan APEl dalam mitokondria hati yang diisolasi dari AL-18, AL-28, CR-28, AL-32, dan CR-32-bulan -tikus tua. (A). Dalam inset, Western blot yang representatif dilakukan pada satu tikus dari masing-masing kelompok yang diuji. Pita imunoreaktif, dari atas ke bawah masing-masing mewakili sinyal dari OGGl dan VDAC. Histogram menunjukkan kuantifikasi intensitas pita OGG1 yang dinormalisasi ke intensitas VDAC.(B). Pada bagian dalam, Western blot yang representatif dilakukan pada satu tikus dari masing-masing kelompok yang diuji.manfaat cistancheDari atas ke bawah, pita imunoreaktif masing-masing mewakili sinyal dari APE1 dan VDAC. Histogram menunjukkan kuantifikasi intensitas pita APE1 yang dinormalisasi dengan intensitas VDAC. (A, B) Data mewakili hasil dari percobaan Western blot rangkap tiga dan dianalisis menggunakan uji ANOVA satu arah dan uji perbandingan ganda Tukey. Batang mewakili nilai rata-rata dan SD untuk lima kelompok eksperimen. Data dinormalisasi terhadap nilai AL-18 tikus, ditetapkan sebagai 1. n: Jumlah hewan yang dianalisis.

KSL24

Jumlah protein intra-mitokondria dari kedua enzim memiliki tren yang sama seperti untuk usia dan efek CR. Secara khusus, OGG1 dan APE1 tidak menunjukkan perubahan terkait usia yang signifikan secara statistik pada kelompok AL dan CR yang menunjukkan tidak ada efek usia sama sekali. Tanpa diduga, CR juga tidak menyebabkan efek yang signifikan pada jumlah OGG1 dan APE1 dalam kelompok CR-28 dibandingkan dengan hewan AL yang sesuai usia, serta antara kelompok berusia 32-bulan.

2.3. Evaluasi Usia dan Efek CR pada Dinamika Mitokondria

Setelah sebelumnya melaporkan efek usia yang ditandai pada ekspresi protein yang terlibat dalam fusi (MFN2) dan fisi (DRP1) [16], kami mengevaluasi di sini efek CR selama rentang waktu yang lama pada penanda ini. Oleh karena itu, jumlah protein MFN2 dan DRP1 ditentukan, dengan percobaan Western blot, dalam mitokondria hati yang terisolasi dari semua kelompok tikus (Gambar 5).

Gambar 5.Jumlah protein MFN2 dan DRP1 dalam mitokondria hati yang diisolasi dari AL-18, AL-28, CR-28, AL-32, dan CR-32-bulan -tikus tua. (A). Dalam inset, Western blot yang representatif dilakukan pada satu tikus dari masing-masing kelompok yang diuji. Dari atas ke bawah, pita imunoreaktif masing-masing mewakili sinyal dari MFN2 dan VDAC. Histogram menunjukkan kuantifikasi intensitas pita MFN2 yang dinormalisasi ke intensitas VDAC.(B). Pada inset, Western blot representatif dilakukan pada satu tikus dari masing-masing kelompok yang diuji. Pita imunoreaktif, dari atas ke bawah masing-masing mewakili sinyal dari DRP1 dan VDAC. Histogram menunjukkan kuantifikasi intensitas pita DRP1 yang dinormalisasi ke intensitas VDAC.(A, B)Data mewakili hasil dari percobaan Western blot rangkap tiga dan dianalisis menggunakan uji ANOVA satu arah dan uji perbandingan ganda Tukey. Batang mewakili nilai rata-rata dan SD untuk lima kelompok eksperimen. Data dinormalisasi terhadap nilai tikus AL-18, ditetapkan sebagai 1. *p<0.05 versus="" al-18=""><0.05 versus="" al-28="" rats.n:="" number="" of="" analyzed="">

Kami menemukan penurunan terkait usia yang signifikan secara statistik (-43 persen) di MFN2 pada tikus AL-28 dibandingkan dengan kontrol AL-18. Penurunan tersebut dicegah pada tikus AL-32 yang menunjukkan efek usia yang kompleks, mirip dengan yang dilaporkan untuk Cyt c. Namun, berbeda dari Cyt c, CR memiliki efek yang sangat positif pada hewan berumur 28-bulan, mencegah pada tikus CR-28 penurunan terkait usia hewan AL-28 dan mengarah ke peningkatan nyata yang signifikan (ditambah 52 persen) di MFN2 dibandingkan dengan rekan usia AL yang cocok. Lebih lanjut, jumlah MFN2 pada tikus CR-28 tidak berbeda dengan nilai pada kontrol AL-18, yang menunjukkan pencegahan efektif dari efek terkait usia. Tidak ada perbedaan signifikan yang ditemukan antara kelompok AL-32 dan CR-32, sehingga menunjukkan efek terbatas CR pada hewan tertua. Selain itu, tidak ada efek terkait usia yang ditemukan untuk MFN2 pada kelompok AL-32 dibandingkan dengan rekan AL-18. Demikian pula, jumlah protein DRP1 menunjukkan penurunan terkait usia yang ditandai (-49 persen ) pada tikus AL-28 dibandingkan dengan kelompok AL-18 yang dicegah oleh CR di {{29 }}hewan berumur sebulan. Memang, kelompok CR-28 menunjukkan perbedaan positif ( ditambah 50 persen ) dibandingkan dengan kelompok AL-28, menunjukkan efek CR yang kuat. Namun, tidak adanya perbedaan antara AL-32 dan CR-32 untuk jumlah protein DRP1 selanjutnya menunjukkan kemanjuran CR yang terbatas dalam penuaan yang diperpanjang. Sekali lagi, tidak ada efek usia yang jelas juga untuk jumlah DRP1 yang berpindah dari grup AL-18 ke grup AL-32. Kemudian, kami menentukan nilai indeks fusi (FI sebagai rasio antara MFN2/DRP1 untuk masing-masing tikus yang diperiksa (Gambar 6).

Nilai FI dalam kelompok AL{{0}} mencakup rentang yang sempit mulai dari 1,37 hingga 2,64, sedangkan pada kelompok AL-28 semua nilai lebih tinggi mulai dari 2,20 hingga 8,24 . Nilai FI kelompok CR{{10}} berkisar antara 0,99 hingga 5,14 dan sangat mirip dengan tikus AL-18. Pada hewan AL-32, nilai FI berkisar antara 0,70 hingga 2,27, sehingga mencakup interval yang serupa dengan kelompok AL-18 yang menunjukkan tidak adanya efek usia yang nyata. Dalam kelompok CR-32, nilai FI berkisar antara 0,87 hingga 2,02 dan sebanding dengan nilai hewan AL-32, sehingga mendukung gagasan bahwa penuaan yang diperpanjang (32 bulan) mungkin kurang sensitif terhadap CR dari penuaan (28 bulan).

Analisis statistik nilai FI dari semua kelompok disajikan pada Gambar 7. Dalam perbandingan antara kelompok AL-18 dan AL-28, nilai FI yang lebih tinggi dari yang terakhir menunjukkan perubahan terkait usia dari keseimbangan dinamis. Sedangkan untuk tikus yang diberi CR, nilai kelompok CR-28 tidak berbeda dari tikus AL-18 dan mendukung kemanjuran diet dibandingkan dengan tikus yang diberi makan AL sesuai usia. . Menganalisis nilai AL-32 dan CR-32 dari FI, tidak adanya perbedaan yang signifikan di antara mereka terbukti, memperkuat gagasan pengurangan kemanjuran diet pada hewan yang secara alami mencapai penuaan yang diperpanjang. Lebih lanjut, nilai FI dari kedua kelompok berumur 32-bulan tidak berbeda dari pasangan AL-18, mendukung tidak adanya efek usia yang nyata pada hewan tertua.