Metabolit Sekunder Cyanobacteria Sebagai Bahan Bioteknologi dalam Kosmetik Anti Penuaan Alami

Mohon hubungi{0}}untuk informasi lebih lanjut

2.3.Aktivitas Biologis

2.3.1.Aktivitas Pemulungan Radikal

Radikal anion superoksida adalah radikal bebas fisiologis yang sangat penting bagi tubuh manusia. Ketika ada kelebihan produksi ROS ini selama respirasi aerobik, atau ketika mekanisme detoksifikasi endogen gagal atau tidak mencukupi, ada peningkatan risiko kerusakan oksidatif dengan efek merusak yang serius. Dalam hal ini, menemukan mekanisme untuk menghambat efek merusak dari Oz* adalah sangat penting, tidak hanya di bidang kosmetik tetapi juga dalam mempertimbangkan perbaikan dan pencegahan beragam penyakit. Perilaku pemulungan O2 dari ekstrak cyanobacteria ditampilkan pada Gambar 1, dan nilai IC dirangkum dalam Tabel 6.

Ekstrak air secara signifikan lebih efektif dalam pemulungan Oz* daripada ekstrak aseton (Tabel 6) dan menunjukkan aktivitas yang bergantung pada dosis (Gambar 1), dengan galur air tawar menonjol dari galur laut. Cephalothorax lacustris LEGE 15493 adalah strain yang paling efektif, menyajikan nilai ICso terendah (65,5 ug ekstrak kering/mL, p<0.05), followed="" by="" leptolyngbya="" boryana="" lege="" 15486="" and="" nodosilinea="" nodulosa="" lege="" 06104.="" leptolyngbya="" cf.="" ectocarpi="" lege="" 11479="" was="" the="" only="" strain="" that="" did="" not="" reach="" the="" ic5o="" for="" the="" aqueous="" extract="" (table="" 6).="" on="" the="" other="" hand,="" the="" acetone="" extract="" of="" this="" strain="" was="" the="" most="" effective="" in="" o2*-="">

Silakan klik di sini untuk tahu lebih banyak

Perbandingan kapasitas antioksidan di antara cyanobacteria yang berbeda merupakan tantangan karena metode yang diterapkan berbeda. Morone dan rekan kerja mengevaluasi kemampuan menangkap radikal ekstrak etanol (70 persen v/v) dari strain cyanobacteria yang berbeda [26], nilai ICso terendah adalah 822,70 ug/mL untuk Phormidium sp.LEGE 02 05292, sementara tidak ada aktivitas terdeteksi untuk Nodosilinea nodulosa LEGE 06102. Lopes dan rekan kerja melaporkan aktivitas pemulungan O2 untuk Nodosilinea (Leptolynbbya) Antartika LEGE13457 dan Cuspidothrix issatschenkoi LEGE 03282 ekstrak aseton, dengan nilai IC25 319 dan 286 ug/mL aktivitas seperti sp.LEGE 13412 [27]. Para penulis juga melaporkan efektivitas yang lebih tinggi dalam ekstrak aseton bila dibandingkan dengan ekstrak etanol. Studi lain yang dilakukan oleh Amaro dan rekan kerja mengungkapkan nilai IC50 1394 dan 826 ug/mL untuk Gloeothece sp. dan Scenedesmus obliquus (M2-1), masing-masing [37]. Hasil yang diperoleh di sini untuk ekstrak aseton tampaknya kurang menjanjikan daripada yang dilaporkan sebelumnya, meskipun mereka berada dalam urutan besarnya yang sama. Di sisi lain, ekstrak air mengungkapkan potensi besar yang layak untuk dieksploitasi lebih lanjut mengenai aplikasi kosmetik di bidang penuaan kulit.

2.3.2.Penghambatan Enzim

MMPs adalah keluarga enzim ekstraseluler yang bergantung pada seng, yang fungsi utamanya adalah untuk merombak dan mendegradasi ECM [38], bahan seperti gel yang penting untuk menyatukan sel dan menyediakan jalur nutrisi dan oksigen [39]. Perubahan komponen ECM, seperti kolagen dan elastin, yang diinduksi oleh MMP adalah dasar dari kerusakan kulit dan pembentukan kerutan [40]. Bersama dengan enzim-enzim ini, yang terkait dengan struktur kulit dan pembentukan kerutan, enzim lain berperan penting dalam proses penuaan karena aktivitasnya dalam melanogenesis: tirosinase. Di antara faktor-faktor lain, paparan UVR menyebabkan akumulasi jumlah melanin yang tidak normal, karena peningkatan produksi ROS. Spesies reaktif ini mempengaruhi aktivitas melanosit, yang meningkatkan konversi tirosin menjadi melanin melalui oksidasi, yang menyebabkan hiperpigmentasi dan bercak kulit yang tidak teratur [41].

Cistanche dapat anti-penuaan

Dalam mencari alternatif alami untuk bahan anti-penuaan komersial, dengan fokus pada enzim yang disebutkan di atas, aktivitas ekstrak cyanobacteria dieksplorasi (Gambar 2). Mengenai HAase, hanya tiga galur yang mampu menghambat enzim ini, bekerja dengan cara yang bergantung pada dosis: ekstrak air Leptolyngbya cf. ectocarpiLEGE 11479 (IC50=863 ug/mL), dan ekstrak aseton Cephalothrix lacustris LEGE 15493 dan Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, dua yang terakhir hanya mencapai IC25(832 dan 995 ug/mL, masing-masing). Meskipun nilai ini tampak tinggi, rentang aktivitasnya mirip dengan obat referensi di-sodium cromoglicate（DSCG）（IC50=105 ug/mL）. Selain itu, perlu disebutkan bahwa, untuk konsentrasi tertinggi yang diuji (1 mg/mL), Leptolyngbya lih. ectocarpi LEGE 11479 menghambat enzim ini dalam 80 persen (Gambar 2), yang membuat ekstrak ini menjanjikan sebagai bahan kosmetik.

Beberapa penelitian telah melaporkan efek potensial dari senyawa dan ekstrak cyanobacteria pada aktivitas hyaluronidase, dan setiap perbandingan pada potensi biologis ekstrak harus memperhitungkan bahwa metabolisme cyanobacteria mengalami variasi yang signifikan tergantung pada kondisi budidaya, yang mempengaruhi komposisi kimia ekstrak. Morone dan rekan kerja [26] mengevaluasi efek ekstrak etanol Tychonema sp. LEGE 07196 dan Cyanobium sp. LEGE 07175 pada hyaluronidase, dan menemukan aktivitas penghambatan yang lebih kuat, dengan nilai ICso masing-masing 182,74 dan 208,36 ug/mL. Aktivitas ekstrak etanol juga telah dilaporkan untuk fraksi tak larut Spirulina platensis, dengan IC5o 150 ug/mL[42]. Studi lain, yang dilakukan oleh Yamaguchi dan Koketsu [19], menunjukkan bahwa Nostochopsis lobatus MAC0804NAN menghasilkan sejumlah besar polisakarida dengan efek penghambatan tinggi (IC50=7.18 ug/mL). Dilaporkan juga bahwa Arthrospira- peptida turunan mungkin terlibat dalam penghambatan hyaluronidase [4]. Bersama-sama, hasil ini mendukung potensi senyawa dan ekstrak cyanobacteria sebagai bahan anti-penuaan untuk aplikasi kosmetik.

Mempertimbangkan elastase, hanya ekstrak aseton yang menyajikan bioaktivitas yang menarik. Leptolyng-bya lih. ectocarpi LEGE 11479 lagi-lagi yang paling aktif (Gambar 2), menjadi satu-satunya strain yang mencapai ICso, dengan nilai 391 ug/mL. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, Cephalothrix lacustris LEGE 15493, dan Leptolyngbya boryana LEGE 15486 hanya mencapai IC25, dengan nilai masing-masing 126,86, dan 99 ug/mL. Adapun hyaluronidase, strain laut telah terbukti paling menjanjikan.

Sejauh pengetahuan kami, tidak ada laporan sebelumnya tentang aktivitas penghambatan elastase untuk strain yang dieksplorasi di sini. Mengenai galur lain, ditemukan bahwa Nostoc minutum menghasilkan peptida tipe mikroviridin dan nostopeptin, dengan ICso =1.3 dan 11.0 ug/mL [44,45]. Microviridins B dan Terkandung dari Microcystis aeruginosa juga menghambat elastase secara efektif, dengan nilai ICso 0.044 dan 0,084 ug/mL [46]. Sebagian besar data yang tersedia mengenai penghambatan elastase fokus pada senyawa terisolasi, jadi perbandingan dengan ekstrak dari galur kami sulit dilakukan.

Pigmentasi kulit yang tidak merata, terkait dengan penuaan dan paparan sinar UV, tetap menjadi perhatian utama populasi yang menua dan industri kosmetik. Sebagian besar penelitian yang ada masih menganggap remeh dan menggunakan tirosinase jamur sebagai model enzimatik, sehingga sulit untuk menerjemahkan hasilnya ke lingkungan manusia, namun demikian enzim ini memiliki kesamaan dan homologi yang tinggi dengan tirosinase manusia[47]. Dengan demikian, model enzimatik yang sama digunakan di sini untuk mengeksplorasi potensi ekstrak cyanobacteria dalam penghambatan tirosinase. Sedangkan untuk elastase, hanya ekstrak aseton yang mampu menghambat tirosinase. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 adalah yang paling efektif (Gambar 2), menjadi satu-satunya strain yang mencapai IC#N (989,26±4,3 ug/mL). Di bawahnya adalah Leptolyngbya boryana LEGE 15486, dengan IC25=784 78±4,33 ug/ mL, dan terakhir Leptolyngbya cf.ectocarpi LEGE 11479, dengan hasil yang paling menjanjikan ditemukan untuk galur laut.

Morone dan rekan kerja [26] sebelumnya mengeksplorasi aktivitas ekstrak etanol cyanobacteria dalam model yang sama, tetapi tidak menemukan aktivitas. Salah satu aspek yang menarik dari hal ini adalah bahwa salah satu galur yang dipelajari adalah Nodosilinea nodulosa LEGE 06102, yang menunjukkan hasil terbaik di sini, sekali lagi menekankan pentingnya pelarut ekstraksi dalam memperoleh ekstrak bioaktif yang ditargetkan. Adapun enzim lain yang dieksplorasi, survei yang berfokus pada cyanobacteria juga langka untuk tirosinase. Pekerjaan Ir yang dilakukan oleh Yabuta dan timnya [48], dilaporkan bahwa ekstrak air panas Nostochopsis spp. secara signifikan menghambat aktivitas tirosinase (IC50=250 ug/mL). Ini adalah hasil yang sangat menarik, mengingat hasil ini berasal dari ekstrak air, yang tidak ditemukan aktivitasnya dalam penelitian ini. Penulis mengaitkan hasilnya dengan senyawa dengan berat molekul rendah yang dilepaskan dari PBP melalui perlakuan panas, yaitu bagian biline yang bertindak sebagai pemulung radikal peroksil yang kuat. Studi lain mengevaluasi aktivitas penghambatan ekstrak etanol Arthrospira platensis (IC50=14,000 ug/mL) dan air (IC50 =72,000 ug/mL, di mana nilai dikaitkan dengan adanya senyawa fenolik seperti asam ferulic dan caffeic dalam ekstrak etanol [49].

2.3.3.Perlindungan UV

Meskipun semakin banyak perusahaan kosmetik memasukkan sun blocker ke dalam produk mereka, masih sulit untuk meyakinkan konsumen tentang manfaat penggunaan sehari-hari untuk memperlambat penuaan kulit dini. Jika di satu sisi, penggunaan tabir surya setiap hari adalah kebiasaan yang sedikit mendarah daging, di sisi lain, ada ketakutan tertentu dalam penggunaan zat sintetis, karena risiko terkait yang tidak diinginkan[50]. Selanjutnya, penelitian tentang fotoproteksi alami telah meningkat pesat dalam beberapa tahun terakhir, mengingat potensinya untuk biodegradabilitas dan toksisitas yang lebih rendah, menjadikannya lebih bermanfaat bagi manusia dan lingkungan. Untuk mengeksplorasi ekstrak cyanobacteria di bidang ini, kapasitas mereka untuk bertindak sebagai tabir surya dievaluasi secara in vitro untuk UVR-B, karena itu adalah radiasi yang paling berbahaya. Hasil yang ditemukan untuk ekstrak air dan aseton cyanobacteria disajikan pada Tabel7.

Mengenai ekstrak aseton, nilai yang paling menjanjikan (19,2) ditemukan untuk Leptolyngbya boryana LEGE 15486, diikuti oleh Leptolyngbya cf.ectocarpiLEGE 1479 (10,7), keduanya pada konsentrasi terendah yang diuji, 200 ug/mL. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 adalah yang paling tidak menjanjikan di antara ekstrak aseton. Dalam ekstrak air, hasil yang paling menjanjikan diperoleh untuk konsentrasi tertinggi yang diuji, dengan Leptolyngbya boryana LEGE 15486 dan Cephalothrix lacustris LEGE 15493 menonjol dengan nilai SPF in vitro masing-masing 17,1 dan 14,9 (Tabel7).perpanjangan hidup cistancheMembahas penelitian sebelumnya di bidang ini, Hossain dan timnya [51] melaporkan bahwa nilai SPF untuk ekstrak komarekiana Cephalothrix adalah 2,37. Kelompok lain menemukan bahwa SPF ekstrak metanol Aphanizomenon flos-aquae adalah 4 [52]. Namun, informasi tentang konsentrasi ekstrak yang digunakan oleh penulis tidak tersedia, membuat perbandingan menjadi sulit.

Jumlah strain cyanobacteria yang dieksplorasi di bidang kosmetik, terutama mengenai SPF, sangat langka, mengingat potensi sumber daya tersebut. Hasil ulang yang disajikan di sini menunjukkan bahwa spesies yang diteliti mungkin merupakan pilihan yang baik sebagai pelindung foto biologis, dan mungkin bertindak sebagai penguat untuk tabir surya lain yang saat ini dipasarkan, memungkinkan pengurangan konsentrasi tabir surya sintetis dalam formula. Oleh karena itu, sangat penting untuk meningkatkan penelitian tentang organisme ini, terutama ekstrak bioaktifnya, yang memiliki biaya yang jauh lebih rendah, hasil yang lebih tinggi, dan perolehan yang lebih cepat daripada senyawa yang diisolasi lebih ramah lingkungan dan lebih menarik secara ekonomi.

2.4. Diskriminasi Ekstrak Cyanobacteria dengan Analisis PCA

Pencarian senyawa bioaktif dari sumber alam, yang berpotensi untuk digunakan sebagai bahan dalam bidang kosmetik telah berkembang dalam beberapa tahun terakhir. Selain berpotensi kurang beracun dan sepenuhnya dapat terurai secara hayati, senyawa turunan cyanobacteria tersedia dari sumber terbarukan dan dapat diperoleh dengan biaya rendah di lingkungan yang terkendali.cistanche nzKlasifikasi ekstrak bioaktif menurut komposisi kimia dan aktivitas biologisnya dapat bermanfaat untuk menunjukkan hubungan potensial. Dalam hal ini, analisis komponen utama (PCA) diterapkan, dengan mempertimbangkan komposisi kimia ekstrak cyanobacteria dan bioaktivitas konsentrasi tertinggi yang diuji dalam setiap pengujian (Gambar 3). Seperti yang dapat diamati, 72,99 persen variabilitas dapat dijelaskan oleh dua dimensi pertama: PCl menyumbang 50,41 persen varians, sedangkan PC2 bertanggung jawab atas 22,58 persen. Tiga kelompok dibedakan (Gambar 3A ): Gl, melibatkan ekstrak air Leptolyngbya cf.exocarp LEGE 11479; G2, yang melibatkan ekstrak air Cephalothrix lacustris LEGE 15493, Leptolyngbya boryama LEGE 15486 dan Nodosilinea nodulosa LEGE 06104; dan G3, yang melibatkan semua ekstrak aseton. Menurut Gambar 3B, Gl secara kimiawi berbeda dari sampel lain karena kandungan PE; Ekstrak air Cephalothrix lacustris LEGE 15493, Leptolyngbya boryana LEGE 15486, dan Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 dikelompokkan menurut kandungannya pada PC, APC, dan protein total (G2), sedangkan semua ekstrak aseton terdapat pada kelompok yang sama (G3) karena kandungannya dalam karotenoid, dan klorofil a dan turunannya. Senyawa di luar aktivitas enzimatik ditampilkan, dengan bidang yang dibentuk dengan sumbu positif PCl (Gambar 3B). Dapat diamati bahwa sampel dengan kandungan klorofil a dan karotenoid yang lebih tinggi berhubungan erat dengan penghambatan elastase a dan tirosinase. Hal ini ditunjukkan oleh korelasi positif yang kuat antara karotenoid dan elastase (0,725,p<0.01) and="" tyrosinase=""><0.01) inhibition,="" with="" similar="" observations="" between="" chlorophyll="" a="" and="" the="" same="" enzymes=""><0.01 and=""><0.05,respectively). on="" the="" other="" hand,="" hyaluronidase="" inhibition="" is="" more="" correlated="" vvith="" pe="" content="" (figure="" 3b),="" with="" a="" significant="" positive="" correlation="" between="" the="" values=""><0.01).the compounds="" responsible="" for="" the="" radical="" scavenging="" activity="" of="" the="" extracts="" are="" displayed,="" with="" the="" planes="" formed="" with="" the="" pcl="" negative="" axis.="" the="" closest="" correlation="" is="" observed="" for="" tpc=""><0.05); other="" compounds="" such="" as="" total="" proteins,="" pc,and="" apc="" also="" contribute="" to="" the="" activity,="" although="" to="" a="" lower="" extent="" (figure="" 3b).regarding="" the="" spf,="" there="" is="" a="" close="" correlation="" between="" the="" activity="" of="" the="" extracts="" and="" their="" pbp="" content,mainly="" apc=""><0.01)and pc="" (0.838,="" p="" <="" 0.01),="" which="" points="" to="" these="" compounds="" as="" predominantly="" responsible="" for="" blocking="" uv-b="" radiation.="" the="" total="" protein="" content="" also="" contributed="" to="" this="" biological="" activity="" (0.670,=""><0.01), with="" the="" lowest="" contribution="" being="" observed="" for="" pe="" (0.210,p="">0.05). Secara umum, analisis PCA memungkinkan pengelompokan ekstrak menurut aktivitas biologis yang ditampilkan di bidang penuaan kulit, yang mengarah pada kesimpulan bahwa ekstrak aseton lebih efektif dalam menghambat enzim yang bertanggung jawab atas degradasi matriks dermal dan hilangnya struktur kulit, sedangkan ekstrak air lebih efektif dalam menangkal radikal bebas dan melindungi kulit dari efek buruk radiasi UV.

Sejauh yang kami ketahui, ini adalah pertama kalinya hubungan antara komposisi kimia dan aktivitas biologis ekstrak dari galur cyanobacteria ini telah ditetapkan.

3.Bahan dan Metode

3.1. Produksi Biomassa Cyanobacteria

Empat strain cyanobacterial berfilamen, Cephalothrix lacustris LEGE 15493 dan Lep-tolyngbya boryana LEGE 15486, dari ekosistem air tawar Brasil, dan Leptolyngbya cf. ectocarpi LEGE 11479 dan Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, dari ekosistem laut Portugis, digunakan dalam penelitian ini. Strain dipelihara dalam Koleksi Budaya Bioteknologi dan Ekotoksikologi Biru (LEGE CC) di Pusat Penelitian Kelautan dan Lingkungan Interdisipliner (CIIMAR). Untuk tujuan produksi biomassa, skema kultur peningkatan ditetapkan, dimulai dengan 40 mL di bawah laboratorium- kondisi terkontrol, secara berurutan ditingkatkan hingga 4 L. Strain ditanam dalam media Z8 [53], dilengkapi dengan 10 ug/L vitamin B12 dan 25g/LNaCl untuk strain laut. Kultur dipertahankan pada 25 derajat , dengan intensitas cahaya 10 umol foton m-2 s-4, dan dengan fotoperiode 14 jam terang:10 jam gelap. Biomassa segar dikumpulkan setelah 120 atau 150 hari pertumbuhan (tergantung pada strain) melalui filtrasi, dan beku, beku-kering, dan disimpan pada -20 derajat sampai persiapan ekstrak.

3.2.Persiapan Ekstrak

Dua ekstrak yang berbeda secara berurutan dibuat dari masing-masing strain: aseton dan air. Pertama, ekstrak aseton disiapkan, menggunakan 2g biomassa kering. Biomassa disuspensikan dalam aseton dan diekstraksi selama 10 menit dalam rendaman ultrasonik (Fisherbrand [FB15053, Loughborough, UK). Setelah ekstraksi aseton, pelet yang dihasilkan dibiarkan kering di lemari asam, dan kemudian diekstraksi dengan 70 mL air suling, mengikuti prosedur yang sama. Puing-puing sel dihilangkan dengan sentrifugasi pada 10,00×× g Gs selama 5 menit pada 4 derajat, dalam mikrosentrifugasi HERAEUS MegafugeTM 16R (Thermo ScientificTM, Waltham, MA, USA). Supernatan dari setiap ekstraksi diuapkan di bawah reduksi tekanan (BUCHIR-210 Rotary Evaporator) (ekstrak aseton), atau dibekukan dan diliofilisasi (ekstrak berair). Ekstraksi dengan supernat yang sesuai diulang sebanyak 3 kali. Ekstrak kering disimpan pada -20 derajat sampai analisis kimia dan biologi lebih lanjut.

3.3.Pengujian Sel

3.3.1.Budaya Sel

Keratinosit manusia HaCAT(ATCC), fibroblas tikus 3L1(ATCC), dan sel endotel manusia hCMEC (disediakan oleh Dr. POCouraud (INSERM)) digunakan untuk evaluasi cytotox-icity. Garis sel dikultur di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM GlutaMAXTM, Gibco, Glasgow, UK), ditambah dengan 10 persen (v) serum janin sapi (Gibco),1 persen penisilin-streptomisin (Pen-Strep 100 IU /mL dan 10 mg/mL, masing-masing)(Gibco) dan 0,1 persen Amfoterisin B (Gibco). Pemeliharaan sel dan pengujian dilakukan pada 37 derajat dalam atmosfer yang dilembabkan CO2 5 persen, dan media kultur diperbarui setiap dua hari. Pada pertemuan sel 80-90 persen, sel-sel yang melekat dicuci dengan saline buffer fosfat (PBS, Gibco), terlepas dengan enzim ekspres TrypLEX (1 ×) (Gibco), diteruskan untuk pemeliharaan, dan diunggulkan untuk pengujian yang direncanakan.

3.3.2.Sitotoksisitas—MTT Assay

Viabilitas seluler dievaluasi dengan pengurangan {{0}}(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTI, Sigma-Aldrich, Jerman) assay, seperti yang dilaporkan sebelumnya [26]. Semua garis sel (sel endotel, fibroblas, dan keratinosit) diunggulkan dalam pelat sumur 96-, dengan kepadatan masing-masing 1,0 × 10 sel/mL, 3,3 × 104 sel/mL, dan 2,5 × 104 sel/mL.ukuran penis cistancheSetelah 24 jam adhesi sel, media kultur dihilangkan, dan sel-sel diekspos selama 24 dan 48 jam ke media segar yang mengandung ekstrak cyanobacteria yang berbeda dalam lima konsentrasi serial, dari 12,5 hingga 200 ug/mL. Untuk ekstrak aseton, larutan stok disiapkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO) (Gibco), dan diencerkan dengan DMEM sebelum paparan sel sehingga konsentrasi DMSO maksimum tidak melebihi 1 persen . Ekstrak berair disiapkan dalam PBS dan diencerkan dengan DMEM sebelum paparan sel. Kontrol negatif adalah PBS, dan kontrol kematian sel adalah DMSO 20 persen . Setelah inkubasi, uji sitotoksisitas MIT dilakukan. Secara singkat, 20 L larutan MTT ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi pada suhu 37 derajat selama 3 jam. Setelah inkubasi, media dikeluarkan dengan hati-hati, dan garam formazan berwarna ungu dilarutkan dalam DMSO. Absorbansi dibaca pada 550 nm dengan pembaca lempeng mikro multi-deteksi Synergy HT (Biorek, Bad Friedrichshall, Jerman) yang dioperasikan oleh perangkat lunak GEN51M. Pengujian dilakukan dalam rangkap empat dan dirata-ratakan. Untuk reproduktifitas, setiap pengujian secara independen diulang setidaknya tiga kali. Sitotoksisitas dinyatakan sebagai persentase viabilitas sel, mengingat viabilitas 100 persen dalam kontrol pelarut.

3.4. Profil Kimia Ekstrak Cyanobacteria

3.4.1.Total Fenolik Content (TPC)

Untuk menentukan TPC dari ekstrak, uji kolorimetri digunakan, berdasarkan metodologi Folin-Ciocalteu [54] dengan sedikit modifikasi. Ekstrak aseton dilarutkan dalam DMSO, dan ekstrak air dalam air. Secara singkat, 25 L masing-masing ekstrak 10mg/mL） dicampur seluruhnya dengan 25 L reagen Folin-Ciocalteu Sigma-Aldrich）20{{20}} L larutan NagCO3, dan 500 L air deionisasi. Untuk blanko, reagen Folin-Ciocalteu diganti dengan air deionisasi. Absorbansi produk berwarna yang terbentuk diukur pada 725 nm, menggunakan pembaca lempeng mikro Multi-deteksi Synergy HT (Biotek, Bad Friedrichshall, Jerman) yang dioperasikan melalui perangkat lunak GEN51M. Kurva standar untuk kuantifikasi TPC diperoleh dengan menggunakan tujuh konsentrasi asam galat (GA) (0,025 hingga 0,5 mg/mL), yang dibuat dalam pelarut yang sama dengan ekstrak yang akan diuji (y=2.097x＋0,01560 R²{{ 22}}.9989,untuk aseton, dan y=2.204x＋0.01401,R2=0.9982,untuk air, di mana "y" mengacu pada absorbansi dan "x" mengacu pada konsentrasi) . Tiga penentuan independen dilakukan dalam rangkap dua. Kandungan total fenolik dinyatakan sebagai ug GA setara (GAE) per mg ekstrak kering.

3.4.2.Total Protein

Konsentrasi protein total ditentukan dengan menggunakan BCA protein assay kit (#23227,Thermo-Scientific). Ekstrak berair disiapkan dalam air, sedangkan ekstrak aseton disiapkan dalam DMSO. Secara singkat, di 96-well plate, 25 uL masing-masing ekstrak (1 mg/mL) dicampur dengan 200 L reagen kerja. Absorbansi diukur pada 562 nm, menggunakan pembaca lempeng mikro Multi-deteksi Synergy HT (Biotek, Bad Friedrichshall, Jerman) yang dioperasikan melalui perangkat lunak GEN5IM. Kurva standar(y=-126.87x3＋547.73.353 -10.017; R2=0.999,dan y=162.87x3-248.51x²＋932.13x -11.715;R2=0.99, di mana "y" mengacu pada absorbansi dan "x" mengacu pada konsentrasi) diperoleh untuk setiap ekstrak, menggunakan sembilan konsentrasi albumin (BSA) (25 sampai 2000 ug/mL) untuk mengukur protein. Tiga percobaan independen dilakukan dalam rangkap tiga. Kandungan protein total dinyatakan sebagai ug setara dengan bovine serum albumin (BSA) per mg ekstrak kering.

3.4.3.Pigmen

Pigmen yang ada dalam ekstrak air dan aseton diukur secara spektrofotometri. Klorofil a dan turunannya dikuantifikasi menggunakan kurva kalibrasi yang diperoleh dengan standar komersial (Sigma-Aldrich): y=8.0791x-0.0{{19} }22 (R2=0.996), di mana "y" mengacu pada absorbansi dan "x" mengacu pada konsentrasi. Total karotenoid dihitung sebagai -karoten (Sigma-Aldrich), melalui kurva kalibrasinya y=17.133x＋0.0099; R²=0.990, di mana "y" mengacu pada absorbansi dan "x" mengacu pada konsentrasi). Konsentrasi total karotenoid dinyatakan sebagai ug -karoten per mg ekstrak kering. Kurva kalibrasi untuk kedua standar diperoleh dengan menggunakan lima konsentrasi yang berbeda (0,001 hingga 0,025 mg/mL). Penentuan spektrofotometri dilakukan di 96-pelat sumur, pada 450 nm untuk -karoten dan 663 nm untuk klorofil a, menggunakan pembaca lempeng mikro Multi-deteksi Synergy HT (Biotek, Bad Friedrichshall, Jerman) yang dioperasikan melalui perangkat lunak GEN5TM.

Kandungan PBP ditentukan secara spektrofotometri dengan mengukur absorbansi ekstrak air pada panjang gelombang yang berbeda (562.615, dan 645 nm), dan menerapkan formula yang sesuai, seperti yang dijelaskan sebelumnya oleh Pagels et al. [34]: Ekstrak berair disuspensikan kembali hingga konsentrasi akhir 0.5 mg/mL. Percobaan dilakukan dalam rangkap tiga, dan hasilnya dinyatakan dalam ug/mg ekstrak kering. 3.5.Kegiatan Biologis

3.5.1.Pemulungan Radikal Anion Superoksida (O2*-)

Pengujian radikal bebas Oz*- dilakukan untuk mengevaluasi potensi antioksidan dari ekstrak cyanobacteria, menurut Barbosa dan rekan kerja [55], dengan sedikit modifikasi. Ekstrak berair disiapkan dalam air, sedangkan ekstrak aseton disiapkan dalam DMSO. Lima pengenceran serial disiapkan untuk setiap ekstrak dan diuji untuk mengevaluasi perilaku ekstrak dan nilai IC. Semua reagen dilarutkan dalam buffer fosfat 19 uM, pH7.4）. Volume 50μL dari setiap pengenceran dicampur dengan 50 uL larutan 166 uM -nikotinamida adenin dinukleotida bentuk tereduksi (NADH) dan 150 uL dari 43 uM nitrotetrazolium biru klorida (NBT) dalam pelat sumur 96-. Setelah penambahan 50 L 2,7 M fenazin metosulfat PMS）, aktivitas pembersihan radikal sampel dipantau dengan pembaca lempeng mikro Multi-deteksi Synergy HT (Biotek, Bad Friedrichshall, Jerman) yang dioperasikan melalui perangkat lunak GEN51M, dalam fungsi kinetik, pada suhu kamar selama 2 menit pada 562 nm. Tiga tes independen dilakukan dalam rangkap tiga. GA digunakan sebagai kontrol positif. Hasilnya dinyatakan sebagai persentase pemulungan radikal dibandingkan dengan kontrol yang tidak diberi perlakuan. Hasil untuk nilai IC yang dihitung dinyatakan sebagai mean ± SD (ug/mL) dari setidaknya tiga pengujian independen yang dilakukan dalam rangkap dua. Nilai IC dan kurva dosis-respons yang sesuai dihitung dengan perangkat lunak Graphpad Prism@ (San Diego, CA, USA; versi 9, untuk MacOS).

3.5.2.Penghambatan Hyaluronidase

Uji penghambatan hyaluronidase sedikit dimodifikasi dari yang diusulkan oleh Ferreres et al.【56】. Secara singkat, 25 L masing-masing ekstrak 9mg/mL）, 175 L asam hialuronat HA）（0.7 mg/mL）, dan 25 L hyaluronidase HAase）（90{{ 14}} U/mL dalam NaCl0,9 persen dicampur dalam tabung reaksi. Ekstrak berair disiapkan dalam air, dan ekstrak aseton disiapkan dalam DMSO. Setelah 30 menit inkubasi pada 37 derajat , reaksi dihentikan dengan penambahan 25 L di-natrium tetraborat 0,8 M dalam air）, diikuti dengan inkubasi selama 3 menit pada 90 derajat dalam penangas air. Tabung reaksi didinginkan sampai suhu kamar sebelum 375 uL larutan DMAB[4-(Dimetilamino)benzaldehida] ditambahkan. Setelah 20 menit inkubasi pada 37 derajat, absorbansi produk berwarna yang terbentuk diukur pada 560 nm, dalam pembaca lempeng mikro Multi-deteksi Synergy, HT (Biotek, Bad Friedrichshall, Jerman) yang dioperasikan melalui perangkat lunak GEN5IM. Kontrol negatif dilakukan tanpa adanya ekstrak. Dinatrium kromoglikat (DSCG) digunakan sebagai kontrol positif.

Tiga uji independen dilakukan dalam rangkap tiga, dan hasilnya dinyatakan sebagai persentase penghambatan enzim dibandingkan dengan kontrol yang tidak diberi perlakuan.

3.5.3.Penghambatan Elastase

Uji penghambatan elastase pankreas babi dilakukan menurut Mota dan rekan kerja [57] dengan sedikit modifikasi. Ekstrak berair disiapkan dalam air, sedangkan ekstrak aseton disiapkan dalam DMSO. Secara singkat, dalam 96-well plate, 50 L ekstrak dicampur dengan 90 uL buffer HEPES (0,1 M), 10 uL substrat N-suksinil-Ala-Ala-Ala p-nitroanilide（100 uM）, 70 uL buffer asetat（200 mM）, dan 30 L elastase（1 U/mL）Piring diinkubasi pada suhu 37 derajat selama 10 menit, dan absorbansi produk reaksi diukur pada 405 nm, dalam pembaca lempeng mikro Multi-deteksi Synergy HT (Biotek, Bad Friedrichshall, Jerman) yang dioperasikan melalui GEN51M. Kontrol negatif dilakukan tanpa ekstrak, dan asam askorbat digunakan sebagai kontrol positif.bubuk cistancheTiga tes independen dilakukan dalam rangkap tiga. Hasilnya dinyatakan sebagai persentase penghambatan enzim dibandingkan dengan kontrol yang tidak diberi perlakuan.

3.5.4.Penghambatan Tirosinase

Uji penghambatan tirosinase dilakukan menurut Adhikari et al. dengan sedikit modifikasi. Secara singkat, dalam piringan 96-well, 20 L masing-masing ekstrak dicampur dengan 100 L tirosinase 30 U/mL dalam buffer fosfat）. Ekstrak berair disiapkan dalam air, sedangkan ekstrak aseton disiapkan dalam DMSO. Campuran diinkubasi pada suhu 30 derajat selama 8 menit. Kemudian, 80 L L-DOPA L-3,4-larutan dihidroksifenilalanin） 2,5 mM dalam buffer fosfat) ditambahkan, dan absorpsi (T0, absorbansi pada waktu "nol") segera diukur dengan pembaca lempeng mikro Multi-deteksi Synergy HT (Biotek, Bad Friedrichshall, Jerman) yang dioperasikan melalui perangkat lunak GEN5TM, pada 475 nm. Penentuan absorbansi pada T0 (sebelum produk reaksi terbentuk) memungkinkan penghapusan kemungkinan gangguan karena warna alami dari ekstrak yang diteliti. Setelah 8 menit inkubasi pada 30 derajat, absorbansi diukur lagi (T8). Persentase penghambatan tirosinase dengan adanya ekstrak cyanobacteria dihitung dibandingkan dengan kontrol (negatif) yang tidak diobati, di mana perbedaan antara absorbansi (T{ {21}}T0) sesuai dengan 100 persen aktivitas enzim. Kontrol negatif dilakukan tanpa ekstrak, dan asam kojic digunakan sebagai kontrol positif. Tiga tes independen dilakukan dalam rangkap tiga. Hasilnya dinyatakan sebagai persentase penghambatan enzim dibandingkan dengan kontrol yang tidak diberi perlakuan.

3.5.5.Faktor Perlindungan Matahari (SPF)

Faktor pelindung matahari in vitro ditentukan menurut Rohr dan rekan kerja [59] dengan sedikit modifikasi. Ekstrak berair disiapkan dalam air, sedangkan ekstrak aseton disiapkan dalam aseton. Secara singkat, absorbansi 2mL masing-masing ekstrak (20 dan 1000 ug/mL), diukur dalam spektrofotometer (dari 290 hingga 320 nm, 5 dalam 5 nm). SPF dihitung menggunakan rumus yang diusulkan oleh Mansur [60]: di mana EE（A） adalah spektrum efek eritema, I A） adalah spektrum intensitas matahari, Abs（λ） adalah absorbansi ekstrak, dan CF adalah koreksi faktor (28) ditentukan menggunakan tabir surya komersial dengan nilai SFP yang diketahui 30.

3.6.Analisis Statistik

Analisis statistik dilakukan menggunakan perangkat lunak statistik IBM SPSS (versi 23.0 untuk macOS, IBM Corporation, New York,NY, USA,2015). Data dianalisis untuk normalitas dan homogenitas varians oleh Kolmogorov-Smirnov dan Leven's tes, kemudian diserahkan ke ANOVA satu arah menggunakan Tukey's HSD (jujur ​​perbedaan signifikan) sebagai tes pasca-dok, atau ke uji-t tidak berpasangan. Uji korelasi Pearson digunakan untuk membandingkan data ekspresi yang dinormalisasi antara profil kimia dan aktivitas biologis ekstrak cyanobacteria.

3.7.Analisis Komponen Utama (PCA)

PCA digunakan untuk mengubah sejumlah variabel yang berpotensi berkorelasi menjadi sejumlah variabel yang relatif independen, dapat diurutkan berdasarkan kontribusinya untuk menjelaskan variasi dari keseluruhan kumpulan data[61]. Komponen yang relatif penting dari pola dimensi tinggi dapat berhasil diidentifikasi. Data dimensi tinggi asli dapat dipetakan ke ruang dimensi yang lebih rendah, dan oleh karena itu kompleksitas masalah klasifikasi pola dimensi tinggi sangat berkurang [62]. Untuk penelitian ini, pengenalan pola berdasarkan PCA dilakukan menggunakan perangkat lunak statistik IBM SPSS (versi 23.0 untuk macOS, IBM Corporation, New York, NY, USA, 2015). Matriks data terdiri dari metabolit yang ada dalam ekstrak air dan aseton dari empat strain cyanobacteria, dan aktivitasnya pada konsentrasi tertinggi yang diuji.

4. Kesimpulan

Aktivitas biologis yang ditampilkan oleh ekstrak cyanobacteria yang dianalisis di sini terbukti berkorelasi dengan jelas. Menurut keberadaan PBP bioaktif, ekstrak air adalah yang paling efektif untuk perlindungan UV yang, bersama dengan kapasitas pembersihan radikalnya, menunjukkan mereka sebagai bahan yang menjanjikan untuk digunakan dalam formulasi anti-penuaan yang bertujuan mencegah penuaan kulit yang diperburuk oleh faktor eksternal. Di sisi lain, ekstrak aseton terbukti lebih efektif dalam menghambat aktivitas enzim yang bertanggung jawab atas degradasi matriks dermal dan hilangnya struktur kulit, sehingga lebih cocok untuk penuaan kulit terkait usia.ekstrak cistanche salsaSkema ekstraksi sekuensial yang kami usulkan terbukti menguntungkan, memungkinkan perolehan ekstrak bioaktif yang berbeda secara kimiawi melalui monetisasi biomassa cyanobacteria, membuat prosesnya lebih berkelanjutan dan menarik secara ekonomi. Secara keseluruhan, ekstrak cyanobacteria terbukti layak untuk dieksploitasi lebih lanjut di bidang penuaan kulit, menargetkan pencarian bahan alami, aman, dan berkelanjutan untuk formulasi kosmetik.

Artikel ini diambil dari Mar. Drugs 2022, 20, 183. https://doi.org/10.3390/md20030183 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs