Menargetkan Laktat Dehidrogenase A Dengan Catechin Resensitizes SNU620/5FU Sel Kanker Lambung Untuk 5-Fluorouracil Bagian 1

Silakan hubungioscar.xiao@wecistanche.comuntuk informasi lebih lanjut

Abstrak:Resistensi terhadap terapi antikanker terjadi di hampir setiap jenis kanker dan menjadi kesulitan utama dalam pengobatan kanker. Meskipun 5-fluorouracil (5FU) adalah pilihan lini pertama terapi antikanker untuk kanker lambung, efektivitasnya terbatas karena resistensi obat. Baru-baru ini, metabolisme kanker yang berubah, termasuk efek Warburg, preferensi untuk glikolisis daripada fosforilasi oksidatif untuk produksi energi, telah diterima sebagai mekanisme penting yang mengatur resistensi terhadap kemoterapi. Dengan demikian, kami menyelidiki mekanisme terperinci dan kemungkinan kegunaan agen antiglikolitik dalam mengaeliortasi resistensi 5FU menggunakan garis sel kanker lambung yang sudah mapan, SNU620 dan SNU620/5FU. SNU620/5FU, sel kanker lambung yang menyimpan resistensi terhadap 5FU, menunjukkan produksi laktat yang jauh lebih tinggi dan ekspresienzim terkait glikolisis, seperti laktat dehidrogenase A(LDHA), daripada sel SNU620 induk. Untuk membatasi glikolisis, kami memeriksa katekin dan turunannya, yang diketahuianti-inflamasidan produk alami antikanker karena epigallocatechin gallate telah sebelumnya dilaporkan sebagai penekan ekspresi LDHA. Katekin, senyawa paling sederhana di antara mereka, memiliki efek penghambatan tertinggi pada produksi laktat dan aktivitas LDHA. Selain itu, kombinasi katekin 5FUand menunjukkan sitotoksisitas tambahan dan apoptosis yang dimediasi spesies oksigen reaktif (ROS) yang diinduksi dalam sel SNU620/5FU. Jadi, berdasarkan hasil ini, kami menyarankan katekin sebagai kandidat untuk pengembangan obat ajuvan baru yang mengurangi chemoresistance menjadi 5FU dengan membatasi LDHA.

Kata kunci:5-fluorouracil;chemoresistant;Glikolisis;laktat dehidrogenase; Catechin

Silakan klik di sini untuk mengetahui lebih lanjut

1. Pendahuluan

Kemajuan luar biasa telah dicapai dalam pengobatan kanker lambung dengan reseksi bedah tumor primer dan kemoterapi kombinasi berbasis 5-fluorouracil (5FU), seperti epirubicin, cisplatin, dan fluorouracil dan docetaxel, oxaliplatin, dan 5FU[1,21 Sampai saat ini, 5FU, analog urasil yang menghalangi sintesis DNA dengan menghambat thymidylate synthase [3], tetap menjadi obat kemoterapi yang umum digunakan untuk pengobatan kanker lambung [1, A4]. Namun, kemanjuran klinis kemoterapi tidak memuaskan karena kambuhnya kanker primer atau metastasis yang terkait dengan resistensi obat [1,5].

Cistanche dapat meningkatkan kekebalan tubuh

Beberapa proses seluler dianggap sebagai mekanisme utama yang mendasari chemoresistance, termasuk aktivasi atau inaktivasi obat, mesin perbaikan kerusakan DNA, modifikasi pada target obat, inaktivasi jalur apoptosis, dan peningkatan autophagy [6,7]. Kanker bersifat heterogen dan berbagai kanker menggunakan glikolisis dan fosforilasi oksidatif untuk metabolisme energi [8]. Namun, pemrograman ulang metabolik, terutama glikolisis aerobik abnormal, telah dilaporkan sebagai pemain kunci dalam pengembangan resistensi terhadap obat kemoterapi, termasuk 5FU, pada kanker lambung [9]. Laktat dehidrogenase A (LDHA) dan piruvat dehidrogenase kinase (PDK) dikenal sebagai pengatur utama glikolisis aerobik yang menghasilkan laktat dari piruvat[10,11]. Kombinasi dichloroacetate, inhibitor PDK yang mapan, mengembalikan sensitivitas terhadap 5FU [12]. Selain itu, LDHA, enzim kunci yang mengkatalisasi konversi piruvat menjadi laktat, telah dilaporkan sebagai target potensial untuk pengobatan kanker lambung [13,14]. Knockdown ekspresi LDHA dalam sel kanker menghambat tumorigenicity melalui peningkatan respirasi mitokondria dan mengurangi viabilitas sel [15]. Beberapa inhibitor LDHA, seperti FX11, PSTMB, dan GSK 2837808A, mengurangi kadar ATP dan menghasilkan stres oksidatif, dan akhirnya menyebabkan kematian sel apoptosis [16-18]. Meskipun sebuah penelitian menunjukkan bahwa penghambatan LDHA oleh microRNA-34a memulihkan resistensi terhadap 5FU pada kanker usus besar [19], tidak ada penelitian sebelumnya yang melaporkan efek inhibitor LDHA genetik atau farmakologis pada chemoresistance.

Polifenol teh hijau, termasuk katekin (CA), epicatechin (EC), gallocatechin(GC), epigallocatechin(EGC),epicatechin-3-gallate (EKG), dan epigallocatechin-3-gallate (EGCG), meningkatkan kesehatan manusia dengan mencegah dan mengobati beberapa penyakit, termasuk peradangan, diabetes, penyakit kardiovaskular, dan kanker ganas [20,21]. Di antara polifenol, EGCG meningkatkan kemosensitivitas 5FU pada kanker kolorektal dan sel karsinoma hepatoseluler dengan mengaktifkan jalur AMPK dan membatasi batang kanker [22,23]. Selain itu, EGCG telah dilaporkan menghambat LDHA dengan menekan ekspresinya di sel kanker payudara dan pankreas [24,25].

Dalam penelitian ini, kami berhipotesis bahwa CA mungkin menjadi kandidat untuk obat adjuvant untuk mengurangi resistensi terhadap 5FU dalam sel kanker lambung. Telah diperiksa bahwa efek penghambatan CA, dan/ atau kombinasinya dengan 5FU, pada aktivitas LDHA sehingga menginduksi spesies oksigen reaktif mitokondria (ROS) dan kematian sel apoptosis pada sel tahan 5FU.

2. Hasil

2.1. Karakteristik Glikolitik Sel Tahan 5FU

Peningkatan proliferasi adalah karakteristik chemoresistance termasuk sel kanker yang resisten terhadap 5FU [26,27]. Pertama, kami mengkonfirmasi resistensi terhadap 5FU dan tingkat pertumbuhan jangka panjang sel SNU620 dan SNU620/5FU. Ketika sel-sel ini dikultur dengan konsentrasi yang ditunjukkan 5FU selama 48 jam, dosis yang diperkirakan menyebabkan penghambatan pertumbuhan 50% (Gl50)dalam sel SNU620/5FU (100,63 uM) jauh lebih tinggi daripada yang menyebabkan GIso dalam sel SNU620 induknya (28,88 μM)(Gambar 1A dan Gambar Tambahan S1). Selain itu, tingkat pertumbuhan sel SNU620/5FU lebih cepat daripada sel SNU620 (Gambar 1B dan Gambar Tambahan S2). Karena chemoresistance dan karakteristik yang tumbuh cepat dapat dikaitkan dengan peningkatan sifat glikolitik dalam sel kanker lambung [28], tingkat pengasaman ekstraseluler (ECAR) dan tingkat konsumsi oksigen (OCR) diukur di kedua sel dengan adanya oksamat, inhibitor glikolisis yang terkenal, atau tidak. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sel SNU620/5FU secara signifikan mengeluarkan lebih banyak laktat daripada yang disekresikan oleh sel SNU620 dan kemudian mengasamkan media kultur (Gambar 1C dan Gambar Tambahan S3). Namun, tidak ada perubahan signifikan dalam OCR yang diamati antara sel-sel ini (Gambar 1D). Tingkat ekspresi mRNA dan protein LDHA diukur. Ekspresi LDHA lebih tinggi pada sel SNU620/5FU daripada pada sel SNU620 (Gambar 1E, F). Selanjutnya, kami memeriksa tingkat ekspresi mRNA dan protein isotipe PDK dan menemukan bahwa isotipe PDK2 dan PDK3 lebih tinggi pada sel SNU620/5FU daripada pada sel SNU620 (Gambar Tambahan S4A, B). Fosforilasi subunit E1α dari piruvat dehidrogenase (PDHA1), yang meningkat oleh PDK, juga dievaluasi, dan ditemukan lebih tinggi pada sel SNU620/5FU daripada pada sel SNU620 (Gambar Tambahan S4C). Selain itu, kami menggunakan oksamat sebagai inhibitor LDHA untuk mengatasi resistensi 5FU dalam sel SNU620/5FU. Senyawa ini menghambat pertumbuhan sel dalam sel SNU620 dan SNU620/5FU (Tambahan Gambar S5). Selanjutnya, kotreatment dengan oksamat dan 5FU menekan pertumbuhan sel, dibandingkan dengan pengobatan individu dengan sel oxamate atau 5FUin SNU620/5FU (Gambar 1G). Data ini menunjukkan bahwa sel SNU620/5FU sangat mengekspresikan LDHA, dan penghambatan aktivitas LDHA dapat mengatasi resistensi sel SNU/5FU terhadap 5FU.

Gambar 1. Menurut hasil,sel tahan 5-fluorouracil (5FU) memiliki karakteristik glikolitik yang meningkat:(A)SNU620 dan sel SNU620/5FU diperlakukan dengan konsentrasi 5FU yang ditunjukkan selama 48 jam. Kelangsungan hidup sel-sel ini dievaluasi melalui uji MTT;(B)tingkat pertumbuhan sel SNU620 dan SNU620/5FU diukur setiap hari selama 4 hari dengan uji MTT;(C,D)SNU620 dan SNU620/5FU sel diperlakukan dengan oksamat (5mM) atau tidak selama 24 jam, dan nilai ECAR dan OCR dievaluasi oleh Seahorse XF analyzer;(E, F) ekspresi LDHA dalam sel SNU620 dan SNU620/5FU terdeteksi melalui analisis qRT-PCR dan western blot; (G) sel SNU620 dan SNU620/5FU diobati dengan oksamat (25 mM)dan/atau 5FU(10μM) selama 48 jam. Hasilnya ditampilkan sebagai rata-rata ± SEM.**p<0.01><><><0.01，and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

2.2. CA Menekan Aktivitas LDHA

Produksi laktat dianalisis dengan CA dan turunannya, termasuk EC, GC, EGC, dan EGCG, dalam sel SNU620/5FU. Dibandingkan dengan turunan ini, CA mengurangi produksi laktat lebih efektif (Gambar 2A). Lebih lanjut, secara in vitro, aktivitas LDHA seperti yang dikatakan dikonfirmasi, dan CA menunjukkan efek penghambatan yang lebih kuat pada aktivitas LDHA daripada turunannya (Gambar 2B). Efek penghambatan CA pada aktivitas LDHA dan LDHB in vitro diukur dengan cara yang bergantung pada dosis. CA menghambat aktivitas LDHA tanpa mempengaruhi aktivitas LDHB (Gambar 2C, D). Selain itu, kegiatan LDHA dan LDHB diukur dengan EGCG, yang diketahui dapat menghambat aktivitas LDHA, dan ditemukan mengalami penurunan yang bergantung pada dosis (Gambar Tambahan S6A, B). Selain itu, aktivitas LDHA dan LDHB intraseluler dievaluasi dengan konsentrasi CA yang ditunjukkan dalam sel SNU620/5FU. CA menghambat aktivitas LDHA dengan cara yang bergantung pada dosis secara in vitro hasil tetapi tidak aktivitas LDHB (Gambar 2E, F). Tingkat ekspresi protein p-PDHA1, PDK2, PDK3, dan LDHA juga diukur dalam sel SNU620/5FU setelah perawatan CA (Gambar Tambahan S7), dan kami mengamati bahwa mereka tidak terpengaruh oleh perawatan ini. Hasil ini menunjukkan bahwa CA mengatur aktivitas LDHA tanpa mempengaruhi ekspresinya.

2.3. Cara Kerja Penghambatan LDHA oleh CA

Untuk menganalisis mekanisme penghambatan aktivitas LDHA pada CA dan turunannya, kami melakukan pemodelan molekuler dari interaksi pengikatan antara LDHA rekombinan manusia dan CA (Gambar 3A,B). Hasil penelitian menunjukkan bahwa CA dapat berinteraksi dengan residu T94, A95, Q99, R105, S136, R168, H192, dan T247 dari LDHA. Di antara mereka, R105, S136, dan R168 sangat penting untuk pengikatan substrat (piruvat). Dengan demikian, kami berasumsi bahwa CA dapat mengganggu situs pengikatan substrat. Sebaliknya, EGCG terikat pada LDHA melalui situs yang berbeda. Untuk memverifikasi mode aksi penghambatan LDHA oleh CA lebih lanjut, plot Michaelis-Menten dan Lineweaver-Burk dikonfirmasi dengan berbagai konsentrasi piruvat dan CA. Aktivitas LDHA meningkat dengan cara yang bergantung pada dosis piruvat. Namun, itu dibalik oleh peningkatan CA. Dengan demikian, hasil plot Michaelis-Menten dan Lineweaver-Burk menunjukkan bahwa CA adalah inhibitor nonkompetitif untuk LDHA (Gambar 3C, D). Selain itu, data kalorimetri titrasi isotermal (ITC) menunjukkan bahwa CA secara fisik mengikat LDHA dengan nilai Kd 197 uM (Gambar Tambahan S8). Hasil ini memberikan wawasan bahwa CA menekan aktivitas LDHA melalui pengikatan situs pengikatan substrat LDHA.

2.4. CA Mengaktifkan Kembali Resistensi 5FU melalui Pengurangan Aktivitas LDHA

Kami mengevaluasi efek sitotoksik CA pada sel SNU620 dan SNU620/5FU dan menemukan bahwa CA menekan pertumbuhan di kedua kelompok sel (Gambar 4A). Untuk memverifikasi bahwa penghambatan pertumbuhan terkait dengan penekanan aktivitas LDHA, ekspresi LDHA dihapuskan oleh asam ribonukleat jepit rambut pendek (shRNA)untuk LDHA (shLDHA) dan ekspresinya dipulihkan dengan transfeksi LDHA yang mengekspresikan plasmid (Gambar Tambahan S9A, B). Dalam sel SNU620/5FU yang ditransfeksi shLDHA, produksi laktat dan viabilitas sel tidak secara nyata diubah oleh perlakuan CA, dibandingkan dengan sel yang ditransfeksi tiruan (Gambar 4B, C). Selain itu, efek penghambatan pertumbuhan CA meningkat dengan pemulihan ekspresi LDHA pada sel LDHA-knockdown SNU620/5FU (Gambar 4D). Selanjutnya, sel SNU620 dan SNU620/5FU diperiksa setelah pengobatan CA dan 5FU secara individual atau kombinasi keduanya. Kotreatment dengan CA dan 5FU secara signifikan menghambat pertumbuhan sel SNU620/5FU (Gambar 4E). Selain itu, efek kombinasi CA dan 5FU diperiksa di beberapa lini sel lainnya, seperti kanker lambung manusia AGS, kanker pankreas Panic-1, MIA PaCa-2, dan sel kanker usus besar LS174T dan RKO, dibandingkan dengan SNU620 dan SNU620/5FUcells. Produksi laktat dan ekspresi LDHA menunjukkan korelasi yang baik satu sama lain, dan sifat glikolitik ini relatif tinggi pada SNU620/5FU, AGS, dan RKO (Gambar Tambahan S10A, B). Selain itu, perlakuan kombinasi CA dan 5FU secara signifikan mengurangi kelangsungan hidup sel, dibandingkan dengan perlakuan tunggal 5FU dalam sel glikolitik termasuk AGS dan RKO (Gambar Tambahan S10C). Namun, kotreatment dengan CA dan 5FU tidak secara signifikan menghambat pertumbuhan sel SNU620, Panic-1, MIA PaCa-2, dan LS174T, yang menunjukkan ekspresi LDHA yang rendah. Hasil ini menunjukkan bahwa efek kepekaan CA terhadap sel-sel resisten 5FU mungkin terkait dengan efek penghambatannya pada aktivitas LDHA.

Gambar 2. Katekin(CA) menghambat aktivitas LDHA tetapi bukan ekspresinya:(A)laktat produksi SNU620/5FU diukur setelah perlakuan dengan turunan CA (10 μM) untuk 24 h;(B)in vitro aktivitas LDHA dievaluasi pada pengobatan dengan turunan CA (10 uM) dan oksamat (20 mM);(C, D)in vitro, LDHA dan aktivitas LDHB diperkirakan dengan konsentrasi CA yang ditunjukkan; (E, F)sel-sel diperlakukan dengan konsentrasi CA yang ditunjukkan selama 24 jam. Aktivitas LDHA dan LDHB intraseluler diukur menggunakan lisat sel sebagai sumber enzim. Hasilnya ditampilkan sebagai rata-rata ± SEM. **p<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Gambar 4. Viabilitas sel dihambat oleh kotreatment dengan katekin (CA) dan 5-fluorouracil (5FU) dalam sel tahan 5FU:(A) viabilitas sel SNU620 dan SNU620/5FU dinilai setelah perawatan dengan konsentrasi CA yang ditunjukkan selama 48 jam;(B)SNU620/5FU-pLKO.1 dan SNU620/5FU-shLDHA sel diperlakukan dengan CA(10 μM) selama 24 jam. Produksi laktat diukur dalam media kultur sel SNU620/5FU-pLKO.1 dan SNU620/5FU-shLDHA;(C, D)SNU620/5FU-pLKO.1, SNU620/5FU-shLDHA, SNU620/5FU-shLDHA+EV, dan sel SNU620/5FU-shLDHA+LDHA#2 diperlakukan dengan konsentrasi CA yang ditunjukkan selama 48 jam. Viabilitas sel diukur menggunakan uji MTT;(E) SNU620 dan sel SNU620/5FU diperlakukan dengan CA (10 μM) dan/atau 5FU(10μM) selama 48 jam. Viabilitas sel-sel ini diukur melalui uji MTT. Hasilnya ditampilkan sebagai mean±SEM.*p<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Artikel ini diekstrak dari Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms