Menargetkan Cathepsin B Oleh Cycloastragenol Meningkatkan Kekebalan Antitumor Sel T CD8 Melalui Penghambatan Degradasi MHC-I Bagian 1

ABSTRAK

Latar belakangHilangnya antigen tumor dan penipisan sel T CD8 yang disebabkan oleh jalur PD-1/PD-L1 merupakan faktor penting untuk lolosnya kekebalan tumor. Dalam beberapa tahun terakhir, telah terjadi peningkatan penelitian tentang pengobatan tradisional Tiongkok dalam pengobatan tumor. Cycloastragenol (CAG), molekul aktif yang efektif di Astragalus membranaceus, telah ditemukan memiliki fungsi antivirus, antipenuaan, anti-inflamasi, dan lainnya. Namun, efek dan mekanisme antitumornya tidak jelas.

Glikosida cistanche juga dapat meningkatkan aktivitas SOD di jaringan jantung dan hati, dan secara signifikan mengurangi kandungan lipofuscin dan MDA di setiap jaringan, secara efektif mengais berbagai radikal oksigen reaktif (OH-, H₂O₂, dll.) dan melindungi dari kerusakan DNA yang disebabkan oleh radikal OH. Cistanche phenylethanoid glycosides memiliki kemampuan pemulungan radikal bebas yang kuat, kemampuan reduksi yang lebih tinggi daripada vitamin C, meningkatkan aktivitas SOD dalam suspensi sperma, mengurangi kandungan MDA, dan memiliki efek perlindungan tertentu pada fungsi membran sperma. Polisakarida Cistanche dapat meningkatkan aktivitas SOD dan GSH-Px dalam eritrosit dan jaringan paru-paru tikus tua yang disebabkan oleh D-galaktosa, serta mengurangi kandungan MDA dan kolagen dalam paru-paru dan plasma, dan meningkatkan kandungan elastin, memiliki efek pemulungan yang baik pada DPPH, memperpanjang waktu hipoksia pada tikus tua, meningkatkan aktivitas SOD dalam serum, dan menunda degenerasi fisiologis paru-paru pada tikus tua eksperimental Dengan degenerasi morfologi seluler, percobaan telah menunjukkan bahwa Cistanche memiliki kemampuan antioksidan yang baik dan berpotensi menjadi obat untuk mencegah dan mengobati penyakit penuaan kulit. Pada saat yang sama, echinacoside di Cistanche memiliki kemampuan yang signifikan untuk mengais radikal bebas DPPH dan memiliki kemampuan untuk mengais spesies oksigen reaktif dan mencegah degradasi kolagen yang diinduksi radikal bebas, dan juga memiliki efek perbaikan yang baik pada kerusakan anion radikal bebas timin.

Klik pro dan kontra cistanche

【Untuk info lebih lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

MetodeEfek antitumor CAG diselidiki pada model tumor transplantasi tikus MC38 dan CT26. Efek antitumor CAG dianalisis lebih lanjut melalui pengurutan multi-omics sel tunggal. Teknologi profil aksesibilitas target-responsif digunakan untuk menemukan protein target CAG. Selanjutnya, mekanisme antitumor CAG dieksplorasi menggunakan mikroskop confocal, imunopresipitasi, dan transfeksi plasmid mutan. Akhirnya, efek antitumor gabungan dari antibodi CAG dan PD-1 pada tikus atau organoid diselidiki.

HasilKami menemukan bahwa CAG secara efektif menghambat pertumbuhan tumor in vivo. Atlas multi-omics sel tunggal kami menunjukkan bahwa CAG mempromosikan presentasi antigen permukaan sel tumor dan ditandai dengan peningkatan fungsi pembunuhan sel CD8 plus T. Secara mekanis, CAG terikat pada protein targetnya cathepsin B, yang kemudian menghambat degradasi lisosom kompleks histokompatibilitas utama I (MHC-I) dan mempromosikan n agregat MHC-I ke membran sel, meningkatkan pra-stasiun antigen tumor. . Sementara itu, kombinasi CAG dengan antibodi PD-1 secara efektif meningkatkan pembunuhan tumor CD8 plus sel T pembunuh tumor pada tikus xenograft dan organoid kanker kolorektal. Kesimpulan Data kami melaporkan untuk pertama kalinya bahwa downregulation cathepsin B memberikan kekebalan antitumor dan tanggal mekanisme antitumor alami produk CAG.

PERKENALAN

Kanker kolorektal adalah salah satu kanker paling umum di seluruh dunia. Tingkat kejadian dan tingkat kematiannya berada di antara tiga teratas, mengancam kehidupan dan kesehatan manusia secara serius.1 Metode pengobatan yang umum termasuk kemoterapi pembedahan dan radioterapi, obat-obatan yang ditargetkan, dan imunoterapi.2–4 Namun, sel kanker biasanya menunjukkan hilangnya antigen permukaan dan mengekspresikan tingkat tinggi molekul penghambat untuk menghindari pengawasan sel kekebalan. Oleh karena itu, untuk mengatasi masalah pelarian kekebalan tumor, para peneliti telah mengembangkan penghambat pos pemeriksaan kekebalan dan terapi neoantigen untuk memblokir penyamaran sel kanker ke sel kekebalan.5–8 Meskipun penghambat pos pemeriksaan kekebalan dapat memulihkan sel kekebalan yang terkuras, antigen permukaan kanker sel belum im ved secara signifikan. Oleh karena itu, sangat penting untuk menemukan obat yang dapat meningkatkan presentasi antigen permukaan tumor. Pengenalan sel kanker oleh sel T sitotoksik CD8 plus tergantung pada jalur TCR/CD3/major histocompatibility complex (MHC-I). TCR menerima antigen yang diberikan oleh sel dendritik/protein membran sel kanker CI dan mentransmisikan sinyal untuk menghubungkan CD3 dengan erat, yang kemudian meluas lebih dalam ke dalam sitoplasma.9 10 Pada saat yang sama, dengan aktivasi sinyal CD28/B7 , CD8 plus sel T dapat dikoaktivasi untuk mengenali dan membunuh sel kanker. Studi terbaru menemukan bahwa, dalam proses perkembangan tumor, lisosom menghasilkan pengurangan agregasi MHC-I pada permukaan sel kanker, yang tidak efektif menyajikan antigen.12 13 Liu et al melaporkan bahwa penghambatan PCSK9 dapat mencegah degradasi MHC-I dalam lisosom dan memungkinkan MHC-I untuk kembali ke membran sel untuk menghadirkan antigen.12 Oleh karena itu, memulihkan fungsi penyaji antigen MHC-I sangat penting untuk memblokir pelarian kekebalan tumor.

Semakin banyak penelitian menemukan bahwa penerapan molekul aktif pengobatan Tiongkok tradisional n intervensi antitumor memiliki prospek yang bagus.14 15 Cycloastragenol (CAG) adalah molekul aktif efektif n Astragalus membranaceus, yang memiliki antivirus, antibakteri, anti- inflamasi, dan efek farmakologis lainnya, tetapi efek antitumornya jarang dilaporkan. 16-19 Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa CAG menghambat pertumbuhan tumor tran antasi dari tumor kanker usus besar Mekanismenya terutama menghambat degradasi MHC-I, dimediasi oleh cathepsin B (CTSB), mempromosikan presentasi antigen sel kanker, dan kemudian meningkatkan kemampuan membunuh sel CD8 plus T.

BAHAN DAN METODE

Antibodi dan reagen

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 persen ). Antibodi CTSB (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929 ), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB_1557426 ), Aktin (Cat#{{ 5}}Ig, PRID: AB_2782959 ), Tubulin (Kucing#10094-1-AP, PRID: AB_2210695 ), dan Kit Deteksi Imunohistokimia Anti-tikus/kelinci (Kucing#PK10006) dibeli dari Proteintech. Antibodi H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853), dan CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) dibeli dari Santa Cruz Biotechnology. Antibodi Ki-67 (Kucing#12202, PRID: AB_2620142 ) dibeli dari Cell Signaling Technology. Antibodi Na/K ATPase (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) dibeli dari Abcam. Aliran antibodi sitometri CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB_2833003 ) dan CD{ {31}}PerCP (Cat#345774, RRID: AB_2868802 ) dibeli dari BD Bioscience. Antibodi flow cytometry dari Gzmb-FITC (Cat# 515403, RRID: AB_2114575 ) dibeli dari BioLegend. Aliran antibodi sitometri NK1.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB_469664) dan IFN- -PE (Cat#12-7311-81, RRID :AB_466192) dibeli dari Thermo Fisher Scientific. Media DMEM (Kucing#01-052-1ACS), PenicilinStreptomycin (Kucing#15140122), dan Fetal Bovine Serum (Kucing#C04001-500) dibeli dari Biological Industries. Serum kambing (Cat#88RNG001) dan Kit uji protein Pierce BCA (Cat#23225) dibeli dari Thermo Fisher Scientific. Antibodi anti-human PD-1 (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) dan anti-mouse PD-1 (Cat#BE0146, RRID: AB_1094905 3) dibeli dari sel Bio X. Kit Disosiasi Jaringan Tumor MACS (Kucing#130-095-929) dibeli dari Miltenyi Biotec.

Budaya sel

Garis sel kanker usus besar tikus MC38 dan CT26 dipelihara di laboratorium kami.20 Garis kanker usus besar manusia l HCT-116 diperoleh dari Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China). Sel MC38, CT26, dan HCT-116 dibiakkan dalam media DMEM yang mengandung 10 persen serum janin sapi dan 1 persen penisilin/streptomisin pada suhu 37 derajat dalam inkubator CO2 5 persen.

Eksperimen tumor transplantasi

Tikus C57BL / 6JGpt betina berusia enam-delapan minggu, tikus BALB / c, dan tikus telanjang BALB /, c dibeli dari GemPharmatech (Nanjing, Cina). Sel kanker MC38 atau CT26 (1 × 106) diinokulasi secara subkutan ke setiap tikus. Pada tumor yang tumbuh hingga 100 mm3, mic secara acak dibagi menjadi kelompok phosphate buffered saline (PBS) (misalnya, sekali sehari) dan kelompok CAG (misalnya, 50mg/kg sekali sehari). Volume tumor ditentukan dengan pengukuran caliper menggunakan rumus V=panjang×lebar2 /2. Ketika volume tumor mencit kelompok PBS mencapai 1000 mm3, tumor mencit dikeluarkan, difoto, dan ditimbang.

Disosiasi sel tunggal dari mouse untuk RNA / ATACseq sel tunggal

Tumor padat dari tikus dicerna menggunakan Kit Disosiasi Tumor untuk mendapatkan sel tunggal sel tunggal. Sel tunggal Sel tunggal dengan konsentrasi 1000 sel/1000 sel dimuat pada 10×genomics chromium controller sel tunggal sel tunggal mengikuti protokol pabrikan 10×genomics. Reagen transkripsi terbalik, manik-manik gel barcode, dan minyak partisi dicampur dengan sel untuk gen untuk menghasilkan manik-manik gel dalam emulsi (GEM) untuk transkripsi terbalik. preprocessing data scRNA-seq dan kontrol qua y.

Berdasarkan genom referensi mouse GRCm38 (mm10), pipa CellRanger V.4.0.0 (10×Genomics) untuk memproses RNA sel tunggal urutan data untuk setiap percobaan (GSE197229). Matriks ekspresi gen digital dimasukkan dalam R (V.4.0.4) menggunakan paket Seurat (V.4.0.0).21 Sebelum analisis dBeforem, sel disaring dengan nomor UMI (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

Prapemrosesan data dan kontrol kualitas SeaTac-seq

Data ATAC-seq sel tunggal (GSE197229) diproses sebelumnya oleh cell ranger-at (V.2.0.0) dengan baris perintah hitung. Untuk pemrosesan dan analisis data scATAC-seq berikutnya, kami menggunakan paket ArchR (V.1.0.1).24 Kemudian, kami menggunakan fungsi addArchRGethe nome ('mm10') untuk anotasi genom dan membuat file panah dengan fungsi cre ArrowFiles dengan parameter default. Selanjutnya, kami menggunakan fungsi filterDoublets untuk menghapus potensi doublet dan membuat proyek ArchR menggunakan fungsi ArchRPrject dengan parameter default. Kami kemudian menggunakan paket Harmony untuk menghapus efek batch dengan fungsi addHarmony.25 Untuk pengurangan dimensi, kami menggunakan fungsi addIterativeLSI di ArchR untuk menjalankan parameter def t. Untuk penyematan sel tunggal, kami memilih objek ReduceDims dengan harmoni dan menggunakan fungsi addTSNE dengan parameter 'perplexity=30' untuk visualisasi.

Analisis terintegrasi data siRNA-seq dan scATAC-seq

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. Untuk meningkatkan akurasi prediksi untuk mengintegrasikan kedua dataset dengan lebih baik, kami sekali lagi mengintegrasikan data scATAC-seq dan scRNA-seq menggunakan mode 'integrasi terbatas'. Secara singkat, kami membubuhi keterangan data scATAC-seq dengan tipe sel berdasarkan skor gen scATAC-seq. Kemudian, kami membuat daftar terbatas sehingga kesamaan ekspresi gen dihitung hanya dalam tipe sel yang sama untuk scATAC-seq dan scRNA-seq. Pengelompokan tanpa pengawasan dengan t-SNE mengungkapkan 13 kelompok sub-sel, yang dianotasi oleh penanda yang diketahui atau diduga dalam Tabel 1 tambahan online.

Lintasan garis keturunan pseudotime

Lintasan garis keturunan sel dari sel kanker disimpulkan dengan menggunakan Monocle2 (V.2.18.0) paket R.26 Monosit mempelajari grafik master eksplisit dari data genomik sel tunggal dengan Penyematan Grafik Terbalik untuk menyortir sel, sehingga menyelesaikan masalah kompleks proses biologis dengan kuat dan akurat.27 Kami menggunakan fungsi '' differentialGeneTest '' untuk menurunkan DEG dari setiap cluster, dan setelah membangun lintasan sel, kami mendeteksi gen yang diekspresikan secara berbeda dalam waktu semu. Semua gen yang bergantung pada waktu semu divisualisasikan oleh fungsi peta panas plot_pseudotime_yang mengambil objek CellDataSet. Plot lintasan garis keturunan dan kurva ekspresi halus berdasarkan CellDataSet dihasilkan oleh plot_lintasan_sel dan plot_gen_dalam_pseudotime, masing-masing.28

Panggilan variasi nomor salinan sel tunggal

Untuk mengidentifikasi sel-sel ganas dengan variasi jumlah salinan kromosom (CNV) skala besar klon, kami menggunakan paket inferCNV R untuk menyimpulkan profil genetik setiap sel berdasarkan ekspresi rata-rata set gen besar di setiap wilayah kromosom genom tumor dibandingkan dengan sel normal.29 Berdasarkan sampel demi sampel, sel imun digunakan sebagai referensi untuk memperkirakan CNV dalam sel terkait kanker.

Analisis pengayaan

Analisis jalur KEGG dan analisis anotasi GO dilakukan menggunakan paket R clusterProfiler (V.3.11.1) dengan parameter PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10, dan MaxGSSize=500.20Analisis pengayaan kumpulan gen (GSEA) diterapkan menggunakan 50 kumpulan gen ciri khas (h.all.V.7.4.symbols.gmt) untuk mengidentifikasi pengayaan yang signifikan jalur fungsional melalui perangkat lunak GSEA (V.4.1.0), dengan kriteria penyaringan nilai-P nominal<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Analisis PCR real-time kuantitatif

Sel MC38 dan HCT-116 diunggulkan dalam pelat enam sumur selama 6 jam dan kemudian diberi perlakuan dengan CAG selama 24 jam lagi. Sel dicuci tiga kali dengan PBS dingin, dan disentrifugasi pada 180g selama 5 menit pada suhu 4 derajat . Pada saat yang sama, setelah menggiling jaringan tumor. Total RNA diekstraksi dari sel MC38, HCT-116, dan jaringan tumor menggunakan reagen TRIzol, sesuai dengan instruksi pabriknya. Volume reaksi adalah 20µL yang mengandung: 1µg RNA, 5µL 5×Hiscript III qRT SuperMix, dan RNase Free dH2 O. cDNA menjadi sasaran PCR kuantitatif, dengan volume reaksi 10µL dengan 1µL cDNA, 5µL campuran qPCR, 0,75µL 5µM primer (Maju dan Mundur), dan 3,25µL RNase-free dH2 O. Primer disintesis oleh GenScript Biotech Corporation (Nanjing, China) menurut urutan berikut (tabel tambahan online 2).

Penemuan target melalui pendekatan profil aksesibilitas yang responsif terhadap target

Penapisan protein pengikat CAG dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya.31 32 Secara singkat, pendekatan profil aksesibilitas target-responsif (TRAP) digunakan untuk menemukan protein pengikat untuk CAG dalam lingkungan sel dengan memantau lisin yang diinduksi keterlibatan ligan perubahan aksesibilitas pada tingkat proteome. Secara singkat, dua cawan sel diperlakukan masing-masing dengan 10µM CAG dan dimetil sulfoksida (DMSO). Setelah 1-jam inkubasi, sel ditembus oleh buffer M-PER (Thermo Scientific) dan lisat yang dihasilkan diberi label secara kovalen dengan penambahan formaldehida dan kompleks piridin borana yang bersama-sama secara khusus memberi label residu lisin berprotein pada suhu kamar untuk profil aksesibilitas . Kemudian, lisat diendapkan dengan pelarut organik, dan pelet yang terkumpul dilarutkan kembali dalam 8 mol/L urea, direduksi dengan dithiothreitol (DTT) pada 56 derajat selama 30 menit, diikuti dengan alkilasi menggunakan iodoacetamide (IAA) dalam gelap selama 30 menit. Sejumlah larutan DTT yang sesuai ditambahkan lagi untuk bereaksi dengan kelebihan IAA. Selanjutnya, proteom diencerkan dengan larutan amonium bikarbonat hingga konsentrasi akhir urea mencapai 1 mol/L. Pencernaan protein yang dikumpulkan dihilangkan garamnya pada kolom HLB C18 (Waters, Milford, Massachusetts, AS), dan peptida yang diperkaya dikeringkan dan dilarutkan dalam larutan air asam format (FA) 0, 1 persen. Sistem AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF (Waters) digunakan untuk menganalisis sampel untuk pembuatan profil kuantitatif dari perubahan aksesibilitas lisin sebagai respons terhadap pengikatan CAG untuk penemuan target. Akuisisi ketergantungan data dalam mode positif digunakan untuk akuisisi data. Analisis data dilakukan dengan menggunakan PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Waterloo, Canada). Secara khusus, alkilasi cys dipilih sebagai modifikasi tetap, dan oksidasi metionin dan dimetilasi lisin, yang dicapai dengan pelabelan TRAP, ditetapkan sebagai modifikasi variabel. Secara singkat, peptida yang mengandung dimetilasi yang diinduksi TRAP dan menunjukkan perubahan kelimpahan yang signifikan dengan dan tanpa inkubasi CAG ditetapkan sebagai peptida yang responsif terhadap target. Rasio kelimpahan setiap peptida berlabel TRAP menunjukkan tingkat perubahan aksesibilitas dan terkait erat dengan afinitas pengikat ligan. Uji-t Student dilakukan untuk menilai apakah perubahan aksesibilitas yang terdeteksi dari peptida berlabel signifikan secara statistik. Nilai p antarkelompok (hal<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Kultur organoid

Organoid kanker kolorektal manusia dibangun dan dibudidayakan oleh Chongqing Kingbiotech.33 Sampel jaringan pasien yang diperoleh melalui operasi bedah dicacah menjadi potongan-potongan sekecil mungkin dengan gunting steril. Potongan jaringan dicampur secara menyeluruh dengan Matrigel (Corning, Cat#356231) dengan perkiraan rasio 1:4 di atas es. Pemrosesan selanjutnya mengacu pada protokol yang diterbitkan. Secara singkat, suspensi potongan-Matrigel diunggulkan dengan cepat di pelat multiwell untuk membentuk tetesan setengah bola dan dipindahkan ke 37 derajat selama 15-20 menit, memungkinkan tetesan menjadi padat. Menambahkan jumlah media kultur yang sesuai (Media Pertumbuhan Organoid KingcultureTM, Kucing#KCW-2) ​​ke setiap lubang, dan mengganti media setiap 2–4 hari.

Isolasi dan kultur sel T CD8 manusia

Tambahkan volume garam normal yang sama ke darah tepi orang sehat yang mengandung antikoagulan untuk mengencerkan seluruh darah. Tambahkan sejumlah volume larutan pemisah ke dalam tabung sentrifugasi 15 mL, perlahan-lahan tambahkan seluruh darah yang telah diencerkan di sepanjang dinding tabung ke bagian atas larutan pemisah, dan sentrifugasi pada 750g selama 20 menit. Setelah sentrifugasi, gunakan pipet untuk menyedot monosit di lapisan putih tengah dengan hati-hati ke dalam tabung sentrifus 15 mL, tambahkan PBS volume tertentu untuk disuspensikan kembali, sentrifus 250g selama 5 menit, dan buang supernatan. Setelah menambahkan manik-manik magnetik CD8 manusia ke endapan sel, sel T CD8 diurutkan berdasarkan kolom penyortiran LS. Sel T CD8 ditambahkan ke pelat berlubang yang dilapisi dengan antibodi 5µg/mL CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB_2865578), dan kemudian 10ng/mL IL{{15} } (Peprotech Cat# 212-12) dan 5µg/mL CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID: AB_468920) antibodi fungsional ditambahkan dalam kultur selama 24 jam.

Coculture

Setelah organoid diinkubasi dengan CAG selama 24 jam, media kultur segar diganti, kemudian organoid dan sel T CD8 teraktivasi disuspensikan dalam gel matriks, kemudian suspensi ditambahkan ke pelat enam lubang dan ditempatkan di 37 derajat inkubator selama 15 menit, dan kemudian 2 mL media kultur lengkap bebas serum ditambahkan selama 24 jam.

noda Barat

Sel MC38 dan HCT-116 diunggulkan dalam pelat enam sumur selama 6 jam dan kemudian diberi perlakuan dengan CAG selama 24 jam lagi. Sel-sel dicuci tiga kali dengan PBS dingin, dan disentrifugasi pada 180g selama 5 menit pada 4 derajat. Total protein dilisiskan dengan lisis WB-IP yang mengandung 1 persen protease inhibitor selama 30 menit di atas es. Total protein dinilai menggunakan kit kuantisasi protein BCA. Sampel protein dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamida SDS 10 persen –12 persen dan dipindahkan ke membran PVDF (polivinilidena fluorida) pada 350 mA selama 90 menit. Selaput PVDF diblokir dengan 5 persen BSA selama 1 jam, strip dengan antibodi primer yang ditunjukkan semalaman, dan dengan antibodi sekunder diinkubasi selama 90 menit pada suhu kamar. Akhirnya, strip dideteksi menggunakan sistem substrat chemiluminescent LumiGLO (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA).

Aliran sitometri

Setelah pencernaan jaringan tumor dan suspensi sel tunggal disiapkan. Pewarnaan permukaan dilakukan dengan antibodi antigen permukaan dalam buffer FCM (Flow Cytometry) (PBS yang mengandung 1 persen FBS) dan diwarnai di atas es dengan antibodi yang sesuai selama 30 menit. Pewarna reaktif (eBioscience) digunakan untuk menghilangkan sel-sel mati. Pewarnaan sitokin intraseluler dilakukan dengan larutan fiksatif sel BD / larutan membran ekstraseluler, dan sel difiksasi dan diserap, lalu diwarnai dengan antibodi terhadap sitokin dalam buffer Perm / Wash (BD Biosciences).

Plasmid mutan CTSB ditransfeksi

Sel HCT-116 diunggulkan dalam 6-well plate selama 12 jam dan kemudian ditransfusikan dengan plasmid mutan CTSB-WT-EGFP atau CTSB (Y75A, A77V, dan G198A) selama 36 jam.

Interferensi transfeksi atau overekspresi plasmid CTSB menjadi sel MC38 atau sel HCT-116

Sel MC38 (1×106 /well) diinokulasi dalam 6-well plate selama 6 jam, kemudian ditransfusikan dengan CTSB interfering RNA (urutan: Forward-GGACAUAGAUCUACCUGAATT dan Reverse-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) selama 48 jam, dan tingkat ekspresi mRNA atau protein dari Ctsb dan H2-k1 terdeteksi. Sel HCT-116 (1×106 /well) diinokulasi dalam 6-well plate selama 6 jam, kemudian ditransfusikan dengan interferensi CTSB (urutan: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) atau plasmid ekspresi berlebih selama 48 jam, dan mRNA atau tingkat ekspresi protein CTSB dan HLA-A terdeteksi.

Teknologi docking

Struktur 3D CTSB diunduh dari Protein Database (PDB ID: 2iPP), dan struktur CAG diunduh dari PubChem. Proses docking dilakukan di Autodock 2 dengan rough docking menggunakan algoritma simulation annealing dan penyempurnaan selanjutnya menggunakan algoritma genetika.

Uji pergeseran termal seluler

Sel-sel MC38 diunggulkan dalam pelat berukuran 10cm semalaman dan kemudian diperlakukan dengan CAG atau DMSO 0,1 persen selama 2 jam lagi. Sel-sel dikumpulkan, dicuci dengan PBS dingin, dan disentrifugasi pada 180g selama 5 menit. Sel-sel kemudian dibagi secara merata ke dalam tabung sentrifugasi (setiap tabung 70μL) dan dipanaskan selama 3 menit pada suhu berikut: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64, dan 67 derajat, sampel didinginkan selama 3 menit pada suhu dan kemudian disimpan di atas es. Kemudian, sampel ditempatkan di lemari es pada suhu -80 derajat semalam. Sampel dicairkan pada suhu kamar selama 30 menit dan kemudian didinginkan pada suhu -80 derajat selama 4 jam. Akhirnya, sampel disentrifugasi pada 12, 000g selama 25 menit, supernatan ditambahkan ke buffer pemuatan, dan dianalisis dengan Western blotting.

Pewarnaan imunohistokimia

Bagian parafin jaringan tumor direndam dalam xilena selama 20 menit hingga dewax, kemudian dalam etanol 100 persen, 75 persen, dan 50 persen selama 10 menit. Setelah irisan mengalami perbaikan antigen dengan larutan perbaikan antigen natrium sitrat, hidrogen peroksida endogen dinonaktifkan dengan hidrogen peroksida 3 persen. Setelah memblokir dengan serum kambing 5 persen selama 1 jam, antibodi anti-Ki67 (1:200) ditambahkan dan diinkubasi semalam pada 4 derajat. Polimer berlabel HRP anti-tikus/kelinci (100µL) ditambahkan dan sampel diinkubasi pada suhu 37 derajat selama 30 menit, diikuti dengan 100µL larutan kerja DAB, dan inkubasi pada suhu kamar selama 5 menit. Setelah 1 menit pewarnaan dengan hematoksilin, sampel dicuci dalam 50 persen, 75 persen, dan 100 persen etanol dan xilena selama 5 menit, dan getah netral digunakan untuk menyegel film. Film diamati dan difoto di bawah mikroskop.

Statistikanalisis

Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism (V.8.0). Semua hasil dinyatakan sebagai rata-rata ± SEM dari tiga percobaan independen. Analisis varians satu arah diikuti oleh uji post hoc Dunnett digunakan untuk mengevaluasi perbedaan ketika ada lebih dari dua kelompok. Uji-t Student digunakan untuk mengevaluasi perbedaan yang signifikan antara kedua kelompok. Signifikansi statistik ditetapkan pada hal<0.05.

HASIL

Analisis multi-omics sel tunggal CAG menghambat pertumbuhan kanker usus besar yang ditransplantasikan pada tikus

Untuk menyelidiki apakah CAG memiliki efek antitumor, pertama-tama kami mentransplantasikan sel kanker MC38 ke tikus C57BL/6. Kami mencatat bahwa CAG secara signifikan menghambat pertumbuhan tumor (gambar tambahan online S1A, B). Selanjutnya, kami mentransplantasikan sel CT26 ke tikus BALB/c dan menemukan bahwa CAG juga menghambat pertumbuhan tumor (gambar tambahan online S1C, D).

Untuk mengungkap lebih lanjut mekanisme spesifik dimana CAG menghambat pertumbuhan tumor, kami menganalisisnya menggunakan teknik scRNA-seq dan scATAC-seq (gambar 1A). Kami membagi populasi sel menjadi empat kelompok: sel kanker, fibroblas, sel myeloid, dan limfosit (gambar 1B, gambar tambahan online S2A, B). Kami menemukan bahwa sel kanker (52 persen ) dan fibroblas (41 persen ) sebagian besar disusupi dalam jaringan tumor, sedangkan sel kekebalan hanya menyumbang 7 persen . Kami kemudian membagi sel kanker menjadi delapan himpunan bagian dan fibroblas menjadi tiga himpunan bagian (gambar 1C–E). Selanjutnya, analisis pengayaan gen yang diekspresikan tinggi pada setiap populasi sel menunjukkan bahwa jalur molekuler MHC-I dalam sel kanker diperkaya, begitu pula sinyal antitumor sel T dan sel NK (gambar tambahan online S2C). Kemudian, empat kelompok sel juga ditemukan menggunakan analisis integrasi scATAC-seq dan scRNA-seq (gambar 2D-G). Mengikuti perbandingan, kami menemukan bahwa sel kanker (sel C01, C03), sel CD8 plus T, sel Spp1 plus TAM, dan fibroblas (sel F01 dan F02) muncul dalam pengurutan ATAC (gambar 1F, G), dan selanjutnya, sangat diekspresikan faktor transkripsi diperkaya dalam sel-sel ini (gambar 1H). Melalui analisis ini, kami berspekulasi bahwa penghambatan pertumbuhan tumor oleh CAG terkait erat dengan perubahan sel-sel ini.

Cag mempromosikan presentasi antigen sel tumor

Untuk menganalisis mekanisme antitumor CAG, pertama-tama kami menganalisis populasi sel tumor dan membagi sel kanker menjadi delapan subkelompok (gambar 2A, B, gambar tambahan online S3A). Hasil penelitian menunjukkan bahwa dibandingkan dengan kelompok PBS, sel kelompok C05 menurun secara signifikan sedangkan sel kelompok C07 meningkat (gambar 2C). Sementara itu, untuk memverifikasi keakuratan pengelompokan sel tumor kami, kami membandingkan CNV limfosit dan sel myeloid sebagai sel referensi. Hasilnya menunjukkan bahwa CNV sel kanker secara signifikan lebih tinggi daripada sel imun (gambar tambahan online S3B). Saat menganalisis subset sel kanker, kami menemukan bahwa gen respons interferon Isg15, Irf7, Ifit3, dan Ifi47 sangat diekspresikan dalam populasi sel C07 dan C08 dari kelompok CAG dibandingkan dengan kelompok PBS (gambar tambahan online S3C). Analisis populasi sel tumor menemukan bahwa jalur terkait presentasi antigen diperkaya secara signifikan dalam banyak populasi sel. Oleh karena itu, kami berspekulasi bahwa CAG dapat mempromosikan presentasi antigen sel kanker untuk memainkan peran antitumor (gambar 2D). Kemudian, kami memilih gen yang terkait dengan presentasi antigen dan menemukan bahwa tingkat ekspresi pada kelompok CAG secara signifikan lebih tinggi daripada pada kelompok PBS (gambar 2E, gambar tambahan online S3D). Kami juga menemukan bahwa CAG mempromosikan presentasi antigen dalam jaringan tumor (gambar 2F, G).

Selanjutnya, kami menggunakan scATAC-seq untuk menganalisis alasan spesifik di balik presentasi antigen sel tumor yang mempromosikan CAG. Kami menemukan bahwa populasi sel tumor sangat mengekspresikan faktor transkripsi Fos, Junb, Jund, Fosb, dan Fosl1 (gambar 2H, I). Selanjutnya, kami membuat peta interaksi antara faktor transkripsi dan gen yang sesuai untuk menjelaskan bahwa CAG mempromosikan ekspresi gen terkait penyaji antigen sel tumor (gambar 2J). Dalam jaringan tumor, kami juga menemukan bahwa faktor transkripsi Junb, Fos, Jund, dan Fosb diekspresikan secara berlebihan pada kelompok PBS di bawah pengobatan CAG (gambar 2K – N, gambar tambahan online S3E-I). Sejauh ini, kami telah menemukan bahwa CAG dapat mempromosikan ekspresi faktor transkripsi gen terkait penyaji antigen, sehingga meningkatkan fungsi penyaji antigen sel kanker. Namun, bagaimana sel kanker ini merespons respons sel imun masih belum jelas.

Untuk mengungkap fenomena di mana CAG mempromosikan presentasi antigen sel kanker, kami melakukan analisis lintasan untuk menyelidiki bagaimana sel kanker saling mengubah sebagai respons terhadap respons sel imun. Kami menemukan bahwa, seiring waktu, sel kanker C07 berubah menjadi sel C05, C06, dan C08, dan pengayaan gen juga menunjukkan bahwa sel kanker akan berubah menjadi presentasi antigen (gambar 3A–E).

CAG meningkatkan fungsi membunuh sel-sel kekebalan

Hasil ini menunjukkan bahwa CAG dapat menghadirkan antigen sel tumor, jadi apakah peningkatan presentasi antigen sel tumor akan mengarah pada peningkatan fungsi sel imun? Untuk mengetahuinya, kami masing-masing menganalisis limfosit dan sel myeloid. Hasil menunjukkan bahwa CAG mempromosikan infiltrasi sel T CD8 plus dalam jaringan tumor, dan infiltrasi sel T CD8 plus dan sel NK juga meningkat, terdeteksi oleh flow cytometry (gambar tambahan online S4A-F). Kami juga mengamati bahwa CAG meningkatkan ekspresi gen Ifitm2, Cxcr6, dan S100a6 dalam sel CD8 plus T,

Gen Fcer1g, Gzmb, AW112010, dan Zfp36i2 dalam sel NK, dan gen Nfkbia dan Junb dalam sel CD4 plus T (gambar tambahan online S4G). Ekspresi Ifng dan Gzmb dalam sel CD8 plus T juga ditingkatkan secara signifikan, seperti yang terdeteksi oleh flow cytometry (gambar tambahan online S4H, I). Selain itu, kami menemukan bahwa setelah pengobatan CAG, ekspresi reseptor penghambat Lag3, Tigit, dan Havcr2 pada permukaan sel CD8 plus T menurun, dan ekspresi gen Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5, dan Pdcd1, mengkarakterisasi aktivasi sel CD8 plus T, meningkat secara signifikan (gambar tambahan online S4J). Untuk memverifikasi lebih lanjut bahwa CAG meningkatkan fungsi pembunuhan sel CD8 plus T dengan mempromosikan peningkatan presentasi antigen tumor, kami mentransplantasikan sel CT26 ke dalam tumor yang ditransplantasikan pada tikus telanjang dan mengamati bahwa CAG tidak dapat secara efektif menghambat pertumbuhan tumor (gambar tambahan online S4K-M ).

Setelah ini, kami menganalisis sel myeloid dan menemukan bahwa sel Spp1 plus TAM meningkat setelah pengobatan CAG, sementara jumlah sel C1qc plus TAM menurun dan jumlah Il1b plus monosit meningkat (gambar tambahan online S5A-D). Setelah pengobatan CAG, sel Spp1 plus TAM dan C1qc plus TAM lebih rentan terhadap transformasi TAM pro-inflamasi. Analisis pengayaan menemukan bahwa itu terutama berfokus pada Tnf-, Ifn-g, dan jalur pensinyalan respons inflamasi (gambar tambahan online S5E-H). Berdasarkan hasil di atas, kami menyimpulkan bahwa CAG meningkatkan fungsi pengenalan dan pembunuhan sel imun dengan meningkatkan presentasi antigen dalam sel kanker. Namun, bagaimana CAG diatur tidak jelas.

Penemuan CTSB protein target CAG dengan perangkap

Selanjutnya, kami akan menyelidiki protein target CAG spesifik yang berperan sebagai antitumor. Kami memilih sel kanker sebagai objek penelitian karena kami menemukan bahwa CAG dapat meningkatkan presentasi antigen sel kanker, sehingga meningkatkan fungsi membunuh sel imun. Kami pertama kali mensintesis turunan biotin CAG dan menemukan bahwa hanya 3-OH yang dapat bereaksi (gambar tambahan online S6A). Kami kemudian menyelidiki apakah CAG-biotin juga mempromosikan ekspresi gen terkait presentasi antigen dalam garis sel tumor MC38 tikus. Hasilnya menunjukkan bahwa CAG-biotin tidak memengaruhi ekspresi gen H2-K1, Cd74, dan Anxa1 (gambar tambahan online S6B-D).

Oleh karena itu, kami menggunakan metode pencarian target TRAP sebelumnya di laboratorium.32 CAG dan DMSO keduanya diinkubasi dengan garis sel MC38 (gambar 4A). Kami memilih protein dengan FC Lebih besar dari atau sama dengan 2 dan ap Kurang dari atau sama dengan 0.05 sebagai calon protein target CAG. Mengikuti prinsip bahwa pengikatan molekul kecil ke protein akan mengarah pada efisiensi pelabelan lisin yang rendah, kami memilih CTSB untuk penelitian (gambar 4B). Selanjutnya, kami menggunakan uji pergeseran termal seluler (gambar 4C) dan termoforesis skala mikro (MST) (gambar 4D) untuk memverifikasi pengikatan antara CAG dan CTSB, dan menemukan bahwa afinitas antara CAG dan CTSB adalah 26,6nM (gambar 4D). Selanjutnya, kami memperkirakan situs pengikatan antara CAG dan CTSB menurut struktur kristal protein CTSB di perpustakaan PDB. Kami menemukan bahwa gugus hidroksil di kedua ujung CAG dan situs ALA77 dan GLY198 dari CTSB diikat oleh ikatan hidrogen, sedangkan situs TYR75, PRO76, dan ALA173 dari CAG dan CTSB diikat oleh gaya van der Waals (gambar 4E) . Untuk memverifikasi situs pengikatan antara CAG dan CTSB, kami mentransfeksi plasmid mutan CTSB dalam sel HCT-116. Hasil menunjukkan bahwa afinitas antara plasmid mutan pada A77V dan G198A dan CAG ratusan kali lebih tinggi daripada plasmid WT (gambar 4F, G). Pada bagian selanjutnya, kami mengeksplorasi mekanisme spesifik dimana CAG memainkan peran antitumor melalui CTSB.

【Untuk info lebih lanjut:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】