Abstrak
Untuk menyelidiki efek penghambatan sinergisCistanche Deserticolaglikosida phenylethanoid (PHGS) dan glabridin (GLA) pada pigmentasi kulit, rasio massa optimal PHGS ke GLA sebelumnya disaring melaluiin vitroUji penghambatan aktivitas tyrosinase, 1, 1- diphenyl -2- picrylhydrazyl (dpph) pemulung radikal, dan 2,2'-azino-bis (3- ethylbenzothiazoline {{8} {{7} {absonic {{7} {{7} {{7} {{7} {{7} {{7 {{{7 {{{7 {{{7 {{{7 {{{7 {8 {{{{{{{{{{{{{{{{) {8 {8 {8 {8 {8 {8 {8 { Evaluasi lebih lanjut dilakukan dengan menggunakan tiga model seluler:

Model melanogenesis B16F10 yang diinduksi UVB untuk menilai penghambatan sintesis melanin melalui aktivitas tirosinase dan kandungan melanin;

Model inflamasi HaCAT yang diinduksi lipopolysaccharide (LPS) untuk mengevaluasi efek anti-inflamasi dengan mengukur interleukin -6 (il {{3}) dan penekanan tumor nekrosis- (TNF-);

Sebuah AAPH (2,2'-Azobis (2- amidinopropane) model stres oksidatif haCat yang diinduksi dihydrochloride untuk menentukan aktivitas antioksidan melalui peningkatan superoksida dismutase (SOD) dan katalase (CAT).

Rasio massa PHGS/GLA yang optimal diidentifikasi melalui model -model ini. Hasil menunjukkan bahwa larutan PHGS/GLA (disiapkan dalam saline fosfat-buffered, PBS, pH 6,8) pada rasio massa 1: 1, 5: 1, dan 10: 1 menunjukkan penghambatan tyrosinase yang signifikan dan efek antioksidan sinergis. Tingkat penghambatan tirosinase masing -masing adalah 94,37%, 92,93%, dan 88,06%; Tingkat pemulungan radikal DPPH mencapai 89,44%, 88,72%, dan 88,10%; Tingkat pemulungan ABTS⁺ adalah 100,13%, 100,01%, dan 99,87%. Pada 25 ug/mL dalam DMEM, PHGS/GLA (1: 1, 5: 1, 10: 1) tidak menunjukkan sitotoksisitas terhadap sel B16F10 atau HACAT. PHGS/GLA (1: 1) Solusi DMEM ditampilkanPenghambatan tyrosinase superior(23,80% aktivitas residual), secara signifikanMengurangi konten melanin(30,90%), dan mengungguli rasio dan monoterapi lainnya dalam menekan IL -6/tnf- melepaskan dan meningkatkan aktivitas SOD/CAT. Kombinasi sinergis PHGS dan GLA secara efektif meringankan Shiperpigmentasi kerabat dengan menghambat melanogenesis, mengurangi peradangan, danmeningkatkan kapasitas antioksidan.

Kata kunci
CistancheDeserticola glikosida phenylethanoid; Glabridin; efek sinergis; anti-melanogenesis; antioksidan; antiinflamasi; Bahan baku farmasi

 

 

 

CistancheDeserticola ekstrak denganTingkat tinggiglikosida fenylethanoid untuk pemutihan kulit

Whatsapp kami untuk detail lebih lanjut

 

Bagian Eksperimental

1.1 Bahan, Reagen, dan Instrumen

Sel melanoma tikusB16F10 (katalog no.: STCC20013G -1), Wuhan ServiceBio Technology Co., Ltd.

Keratinosit manusia yang diabadikanHacat (katalog no.: ICell-H066), Icell Bioscience Inc., Shanghai, Cina.

Cistanche Phenylethanoid Glycosides (PHGS)DanGlabridin (GLA), Shaanxi Tianxingjian Biological Chemical Technology Co., Ltd.

Tyrosinase, Hefei Basf Biotechnology Co., Ltd.

Arbutin (ARB)DanL-Tyrosine, Aladdin Biokimia Teknologi Co, Ltd., Shanghai, Cina.

1, 1- diphenyl -2- picrylhydrazyl (dpph), Tokyo Chemical Industry Co., Jepang.

2,2′-azino-bis (3- ethylbenzothiazoline -6- asam sulfonat) garam diammonium (abts), Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Asam Askorbat (VC), Pabrik reagen kimia Tianjin Damao.

Kalium PersulfateDanetanol anhidrat, Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd.

Sodium hidroksida, Chengdu Huayi Pharmaceutical Excipient Manufacturing Co., Ltd.

Dipotassium fosfat, Shanghai Sanpu Chemical Co, Ltd.

L-dopa, Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Kit Penghitungan Sel -8 (CCK8), Beijing Sinoinvitrogen Biotechnology Co., Ltd.

Triton x -100, dimethyl sulfoxide (DMSO), 2,2′-azobis (2- methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH), DanLipopolysaccharide (LPS), Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.

DMEM media glukosa tinggi, Thermo Fisher Scientific (Cina).

Serum sapi janin (FBS), Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.

Larutan penisilin-streptomisin, Shanghai Dashier Bio-Technology Co., Ltd.

Human il -6 ELISA Kit, Kit TNF- ELISA manusia, DanKit ELISA Kucing Manusia, Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.

Total Superoxide Dismutase (SOD) Assay Kit, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. Semua reagen memiliki tingkat analitik.

Instrumen yang digunakan:

Pembaca Microplate Wavely FL Multiskan FCDanInkubator CO2 Heracell 371, Thermo Fisher Scientific, AS.

Kq -200 vdb pembersih ultrasonic, Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.

Dvkw-d -2 mandi air termostatik digital, Pabrik instrumen medis Beijing Yongging.

Dhg -9246 oven pengeringan ledakan termostatik listrik, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.

Instrumen Radiasi UVB UVB UVB(Intensitas iradiasi: 8 mW/cm²), Xuzhou Kenuo Medical Instrument Equipment Co., Ltd.

1.2 Metode

Pertama, PHGS dan GLA dilarutkan dalam saline buffered fosfat (PBS, pH =6. 8) atau 50% solusi etanol untuk menyiapkan solusi dengan konsentrasi massa dari{{0}}. 0 0 1, 0. {{1 {17}}}} 05, 0.025, 0.1, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, dan 2.0 G/L/L/L/L/L/L/L/L/. Kemudian, PHGS dan GLA dicampur dalam rasiom (phgs): m (gla)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, dan 1:40, untuk menyiapkan solusi PHGS/GLA dengan konsentrasi massa total0.4 g/L, diberi label sebagaiPhgs/gla (40: 1) ~ phgs/gla (1:40), masing -masing.

 

1.3 Eksperimen Biokimia

1.3.1 Uji Penghambatan Aktivitas Tyrosinase

Dalam 96- plat baik,50 μl larutan sampel uji, 50 μl PBS (ph =6. 8), Dan50 μl larutan L-tirosin (1 g/L)ditambahkan secara berurutan. Piring diinkubasi dalam penangas air 37 derajat selama 10 menit. Kemudian,5 0 μl solusi tyrosinase (0,4 g/l, setara dengan 200 U/mL)Ditambahkan, dan piring diinkubasi lagi dalam penangas air 37 derajat selama 10 menit.

Arbutin (ARB)digunakan sebagai kontrol positif, danPBS (ph =6. 8)digunakan sebagai kontrol kosong.

Absorbansi larutan di490 nmdiukur menggunakan pembaca mikro, dan laju penghambatan in vitro tyrosinase (%) dihitung menggunakan persamaan (1).

 

 

Dalam formula:

Reaksi _adalah absorbansi larutan sampel yang mengandung larutan L-tirosin, PBS, dan larutan tirosinase.

Kontrol reaksi _adalah absorbansi larutan sampel yang mengandung larutan L-tirosin dan PBS tanpa larutan tirosinase.

A _ kosongadalah absorbansi larutan yang mengandung larutan L-tirosin, PBS, dan larutan tirosinase tanpa sampel.

A _ Kontrol kosongadalah absorbansi larutan yang mengandung larutan L-tirosin dan PBS tanpa sampel dan larutan tirosinase.

1.3.2 Penentuan aktivitas pemulungan radikal bebas DPPH

Pertama, {{0}}. 0197 g (0,05 mmol) dari DPPH ditimbang secara akurat dan dilarutkan dalam 250 mL etanol anhidrat untuk menyiapkan solusi kerja DPPH dengan konsentrasi dari0. 2 mmol/l.

Kemudian, PHGS dan GLA dilarutkan dalam etanol 50% untuk menyiapkan larutan etanol PHG dan GLA dengan konsentrasi massa dari{{0}}. 0 0 1, 0. {{15} 1, 0.1, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, dan 2.0 g/l. Solusi etanol VC disiapkan dengan cara yang sama.

Selanjutnya, larutan etanol PHGS dan GLA dicampur dalam rasiom (solusi phgs): m (solusi GLA)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40Untuk mendapatkan 9 larutan etanol PHGS/GLA dengan rasio massa yang berbeda, diberi label sebagaiPhgs/gla (40: 1) ~ phgs/gla (1:40).

Akhirnya,100 μl setiap larutan sampelDan100 μl solusi kerja DPPHditambahkan ke 96- pelat baik, dicampur secara merata, dan diinkubasi pada suhu kamar dalam gelap selama 30 menit. Absorbansi di517 nmdiukur menggunakan pembaca microplate. VC digunakan sebagai kontrol positif, dan setiap percobaan diulang tiga kali.

Tingkat pemulungan radikal bebas DPPH (%) dihitung menggunakan persamaan (2).

 

Dalam formula:

A1adalah absorbansi solusi sampel + solusi kerja DPPH.

A2adalah absorbansi 50% etanol + solusi kerja DPPH.

A3adalah absorbansi dari solusi sampel + 50% etanol.

 

1.3.3 Penentuan aktivitas pemulungan radikal bebas abts

Pertama,1 g (1,82 mmol) dari abtsdilarutkan dalam air deionisasi untuk menyiapkan larutan kerja abts dengan konsentrasi akhir dari7.4 mmol/l. 0. 5 g Potassium Persulfatedilarutkan dalam air deionisasi untuk menyiapkan larutan kerja kalium persulfat dengan konsentrasi akhir2.6 mmol/l. Volume yang sama dari larutan kerja ABTS dan solusi kerja kalium persulfat dicampur dan dibiarkan bereaksi dalam gelap selama 12 jam untuk menyiapkan solusi kerja ABTS⁺.

Kemudian, solusi etanol dari PHGS, GLA, dan VC, serta solusi PhGS/GLA etanol dengan rasioPhgs/gla (40: 1) ~ phgs/gla (1:40), disiapkan sesuai dengan metode yang dijelaskan dalam Bagian 1.3.2.

Akhirnya,40 μl setiap larutan sampelDan160 μl solusi kerja abts⁺ditambahkan ke 96- pelat baik, dicampur secara merata, dan bereaksi dalam gelap pada suhu kamar selama 6 menit. Absorbansi larutan di734 nmdiukur menggunakan pembaca microplate.

Tingkat pemulungan radikal bebas ABTS⁺ (%) dihitung menggunakan persamaan (3).

 

 

Dalam formula:

A1adalah absorbansi solusi sampel + solusi kerja ABTS⁺.

A2adalah absorbansi air deionisasi + solusi kerja ABTS⁺.

A3adalah absorbansi larutan sampel + air deionisasi.

1.4 Eksperimen Sel

1.4.1 Kultur sel

Setelah menghidupkan kembali sel B16F10 dan HACAT, mereka diunggulkan ke dalam media glukosa tinggi DMEM (mengandung 10% serum sapi janin dan 1% larutan penisilin-streptomisin) dan dikultur pada37 derajat, 5% CO2, Dan70% kelembabandalam inkubator selama 24 jam. Status pertumbuhan sel diamati di bawah mikroskop, dan perubahan medium atau kelulusan dilakukan sebagaimana diperlukan berdasarkan kondisi pertumbuhan sel.

1.4.2 Pengelompokan Eksperimental

B16F10 fase logaritmik dan sel Hacat diunggulkan menjadi 96- pelat sumur pada kepadatan sel yang sesuai dan dikultur selama 24 jam untuk memungkinkan kepatuhan sel. Solusi sampel dengan konsentrasi yang berbeda disiapkan menggunakan media DMEM.

Kelompok eksperimen adalah sebagai berikut:

Kelompok normal

Grup model

Grup Dosis Rendah PHGS(125 ug/ml)

Grup Dosis Sedang PHGS(250 ug/ml)

Grup Dosis Tinggi PHGS(500 ug/ml)

Kelompok dosis rendah GLA(6.25 ug/ml)

Kelompok dosis sedang GLA(12,5 ug/ml)

GLA kelompok dosis tinggi(25 ug/ml)

Grup PHGS/GLA (1: 1)(25 ug/ml)

Grup PHGS/GLA (5: 1)

Grup PHGS/GLA (10: 1)

UntukModel pigmentasi yang diinduksi UVB dalam sel B16F10, sel -sel kelompok model diperlakukan dengan30 μl PBS (ph =7. 4)dan diiradiasi di bawah instrumen radiasi ultraviolet UVB di3 cm di bawah perangkatuntuk110 detik. Kelompok eksperimen diperlakukan dengan baik100 μl solusi sampel yang berbedaselama 1 jam sebelum menambahkan30 μl PBSdan iradiasi di bawah perangkat UVB selama 110 detik. Kelompok normal terus diobati dengan media DMEM glukosa tinggi, dan kelompok kosong tidak mengandung sel tetapi diganti dengan jumlah media yang sama.

UntukModel peradangan yang diinduksi LPS dalam sel hacat, kelompok model diperlakukan denganSolusi PBS LPS 20 UG/MLselama 24 jam. Kelompok eksperimen diperlakukan dengan baik100 μl solusi sampel yang berbedaselama 24 jam sebelum menambahkanSolusi 20 ug/ml LPSselama 24 jam lagi. Kelompok normal terus diobati dengan media DMEM glukosa tinggi, dan kelompok kosong tidak mengandung sel tetapi diganti dengan jumlah media yang sama.

UntukModel stres oksidatif yang diinduksi AAPH dalam sel hacat, kelompok model diperlakukan denganSolusi 25 mmol/lselama 24 jam. Kelompok eksperimen diperlakukan dengan baik100 μl solusi sampel yang berbedaselama 24 jam sebelum menambahkanSolusi 25 mmol/lselama 24 jam lagi. Kelompok normal terus diobati dengan media DMEM glukosa tinggi, dan kelompok kosong tidak mengandung sel tetapi diganti dengan jumlah media yang sama.

Setiap kelompok diatur dengan3 Replikasi sumurdan berbudaya di37 derajat, 5% CO2, Dan70% kelembabandalam inkubator.

1.4.3 Uji sitotoksisitas

Sitotoksisitas diukur menggunakanMetode CCK8. B16F10 fase logaritmik dan sel Hacat dicerna dengan0. 25% trypsinselama 3 menit. Setelah pencernaan dihentikan dengan medium, sel -sel berulang kali dipipet untuk menyiapkan suspensi sel dengan kepadatan1 × 10⁴ sel/ml. Sel -sel diunggulkan secara merata menjadi 96- pelat baik di100 μl per sumur, dan PBS ditambahkan ke sumur perifer. Setelah kepatuhan sel, berbagai konsentrasi larutan sampel ditambahkan, dengan3 Replikasi sumur per grup, dan sel -sel dikultur di37 derajat, 5% CO2, Dan70% kelembabanuntuk24, 48, dan 72 jamsebelum membuang medium.

Untuk semua kelompok,100 μl media glukosa tinggi CCK8 DMEM (mengandung 10% CCK8)ditambahkan dan diinkubasi60 menit. Absorbansi larutan di450 nmdiukur menggunakan pembaca microplate.

Viabilitas sel (%) dihitung menggunakan persamaan (4).

 

Dalam formula:

A _ diperlakukanadalah absorbansi sel yang mengandung sumur, larutan CCK8, dan larutan sampel.

A _ kosongadalah absorbansi dari solusi yang mengandung sumur dan solusi CCK8 tetapi tanpa sel.

A0adalah absorbansi sel yang mengandung sumur dan solusi CCK8 tetapi tanpa larutan sampel.

1.4.4 Uji Aktivitas Tyrosinase

Metode L-DOPA digunakan untuk mengukur aktivitas tirosinase. Setelah merawat sel untuk48 jamSeperti yang dijelaskan dalam Bagian 1.4.2, supernatan dibuang, dan sumur dicuci dua kali dengan PBS (pH =7. 4). Kemudian,50 μl Solusi 1% Triton X -100ditambahkan ke setiap sumur dan segera ditempatkan di freezer –80 derajat untuk30 menit. Sel -sel dicairkan pada suhu kamar untuk menginduksi lisis.

Setelah pra-pemanasan di37 derajatuntuk5 menit, 10 μl larutan 10 mmol/L L-DOPAditambahkan ke masing -masing sumur dan diinkubasi di37 derajat, 5% CO2, dan kelembaban 70%untuk1 jam. Absorbansi di475 nmdiukur menggunakan pembaca microplate. Setiap percobaan diulangitiga kali, dan aktivitas tirosinase (%) dihitung menggunakan persamaan (5).

Dalam formula:

Eksperimen _adalah absorbansi sel yang mengandung sumur dan larutan sampel di bawah iradiasi UVB.

A _ normaladalah absorbansi sel yang mengandung sumur dan solusi sampel tanpa iradiasi UVB.

A _ kosongadalah absorbansi dari media yang mengandung sumur tetapi tanpa sel.

 

1.4.5 Pengukuran Konten Melanin

Metode lisis NaOH digunakan untuk mengukur kandungan melanin. Setelah merawat sel untuk72 jamSeperti yang dijelaskan dalam Bagian 1.4.2, supernatan dibuang, dan sumur dicuci dua kali dengan PBS.100 μl larutan berair NaOH yang mengandung 10% DMSO (1 mol/L)ditambahkan ke masing -masing sumur, dan pelat ditempatkan di aOven 90 derajatuntuk1 jam. Absorbansi di490 nmdiukur menggunakan pembaca microplate. Setiap percobaan diulangitiga kali, dan konten melanin (%) dihitung menggunakan persamaan (5).

 

1.5 Pengukuran Faktor Peradangan dan Indikator Stres Oksidatif

Setelah merawat sel untuk48 jamseperti yang dijelaskan dalam Bagian 1.4.2,Sel hacatDari masing -masing kelompok dikumpulkan menggunakan scraper sel, disentrifugasi, dan supernatan dikumpulkan. Konsentrasi IL -6 dan TNF- diukur sesuai dengan instruksi kit ELISA.

Setelah merawat sel untuk48 jam, Sel-sel hacat dikumpulkan menggunakan scraper sel, mengalami siklus cairan beku berulang untuk menginduksi lisis sel, dan disentrifugasi pada12, 000 rpm selama 10 menit pada 4 derajat. Supernatan dikumpulkan, dan aktivitasMERUMPUTdan konsentrasiKUCINGdiukur menggunakan instruksi kit ELISA.

 

1.6 Pengukuran Indeks Kombinasi

ItuMetode Indeks Kombinasi (CI)[20] digunakan untuk mengevaluasi apakah kombinasi PHGS dan GLA pada rasio massa yang berbeda menunjukkan efek sinergis dalam menghambat aktivitas tirosinase dan antioksidasi. Indeks kombinasi dihitung menggunakan persamaan (6).

 

Dalam formula:

D1DanD2mewakili konsentrasi masing -masing (g/l) dari dua obat dalam pengobatan kombinasi yang diperlukan untuk mencapaiaktivitas x%.

Dxmewakili konsentrasi (g/l) dari setiap zat individu saat digunakan sendiri untuk mencapaiaktivitas x%.

ItuPerangkat Lunak Compusyndigunakan untuk perhitungan:

CI> 1menunjukkan efek antagonis.

Ci=1menunjukkan efek aditif.

CI <1menunjukkan efek sinergis.

 

1.7 Analisis Data

Semua data dinyatakan sebagai"Rata -rata ± standar deviasi (x̄ ± S)", dan diskusi didasarkan pada nilai rata -rata.

Analisis statistik dilakukan dengan menggunakanGraphPad Prism 9.5. 0. ANOVA satu arah (Analisis Varians) digunakan untuk perbandingan di antara beberapa kelompok. AP-value <0. 05dianggap signifikan secara statistik.