Swertijaponin Menghambat Pigmentasi Kulit Dengan Mekanisme Ganda Untuk Menekan Tirosinase Bagian 2

Cistancheadalah ramuan umum yang dikenal sebagai "ramuan ajaib yang memperpanjang hidup". Komponen utamanya adalah cistanoside, yang memiliki berbagai efek seperti antioksidan, anti-inflamasi, dan meningkatkan fungsi kekebalan tubuh. Mekanisme antara cistanche dan pemutihan kulit terletak pada efek antioksidan glikosida cistanche.

Melanin pada kulit manusia dihasilkan dari oksidasi tirosin yang dikatalisis oleh tirosinase, dan reaksi oksidasi tersebut membutuhkan partisipasi oksigen, sehingga radikal bebas oksigen dalam tubuh menjadi faktor penting yang mempengaruhi produksi melanin.Cistanchemengandung cistanoside yang merupakan antioksidan dan dapat mengurangi pembentukan radikal bebas dalam tubuh sehingga menghambat produksi melanin.

Klik Pada Cistanche Tubulosa Untuk Meningkatkan Pemutihan Kulit

Tanya lebih lanjut:

david.deng@wecistanche.com WhatsApp:86 13632399501

Selain itu,cistanchejuga memiliki fungsi untuk meningkatkan produksi kolagen, yang dapat meningkatkan elastisitas dan kilau kulit serta membantu memperbaiki sel kulit yang rusak.

CistanchePhenylethanol Glycosides memiliki efek pengaturan ke bawah yang signifikan pada aktivitas tirosinase, dan efek pada tirosinase terbukti menjadi penghambat yang kompetitif dan reversibel, yang dapat memberikan dasar ilmiah untuk mengembangkan dan memanfaatkan bahan pemutih di Cistanche.

Karena itu,cistanchememiliki peran kunci dalampemutih kulit. Dapat menghambat produksi melanin untuk mengurangi perubahan warna dan kusam; dan meningkatkan produksi kolagen untuk meningkatkan elastisitas dan cahaya kulit. Karena efek cistanche ini sudah dikenal luas, banyak produk pemutih kulit yang mulai menginfus bahan herbal seperti Cistanche untuk memenuhi permintaan konsumen, sehingga meningkatkan nilai komersial Cistanche dalam produk pemutih kulit.

Singkatnya, peran cistanche dalam pemutihan kulit sangat penting. Efek antioksidan dan efek penghasil kolagennya dapat mengurangi perubahan warna dan kusam, meningkatkan elastisitas dan kilau kulit, dan dengan demikian mencapaiefek pemutihan. Selain itu, aplikasi Cistanche yang luas dalam produk pemutih kulit menunjukkan bahwa perannya dalam nilai komersial tidak dapat diremehkan.

Swertijaponin menghambat aktivasi MAPK yang diinduksi UVB

Stres oksidatif telah ditunjukkan untuk merangsang melanogenesis dengan upregulasi faktor transkripsi terkait mikroftalmia (MITF), faktor transkripsi untuk menginduksi ekspresi gen tirosinase [4, 14]. Kami mempelajari apakah efek antioksidan swertiajaponin dapat mengatur aktivitas MITF. Data western blotting menunjukkan bahwa paparan UVB meningkatkan MITF terfosforilasi, suatu bentuk aktif MITF, sedangkan pengobatan swertiajaponin pada 10 μM menurunkannya (Gambar 6A). Secara konsisten, peningkatan kadar protein tirosinase yang dimediasi UVB berkurang dengan pengobatan swertiajaponin (Gambar 6A). Karena stres oksidatif telah terbukti mengaktifkan MITF melalui mitogen-activated protein kinase (MAPK) [15, 16], diselidiki apakah swertiajaponin dapat mengontrol pensinyalan MAPK. Paparan UVB secara dramatis meningkatkan fosforilasi ERK, JNK, dan p38 (Gambar 6B), yang dikaitkan dengan produksi ROS dan ONOO- yang diinduksi UVB dalam sel B16F10 (Gambar 5C- 5D). Pengobatan Swertajaponin hanya pada 10 μM menurunkan kadar protein MAPK (Gambar 6B). Hasil ini konsisten dengan aktivitas antioksidan swertiajaponin karena penurunan stres oksidatif seluler yang diinduksi UVB terlihat jelas hanya pada 10 μM swertiajaponin (Gambar 5C-5D).

Meskipun swertiajaponin adalah senyawa utama dari seluruh ramuan Swertia japonica yang telah digunakan sebagai obat Jepang, penelitian kami tidak menunjukkan bukti konklusif tentang keamanan swertiajaponin untuk aplikasinya pada kulit manusia. Namun, swertiajaponin tidak menunjukkan sitotoksisitas dalam garis sel Hs27 (fibroblast manusia), HaCat (keratinosit manusia), dan B16F10 (melanoma tikus) dalam pengaturan percobaan kami. Selain itu, tidak ada tanda-tanda sitotoksisitas yang terlihat termasuk pembentukan puing-puing sel atau pelepasan sel berdasarkan pengamatan mikroskopis ketika swertiajaponin dirawat pada model kulit manusia dengan konsentrasi yang tidak menunjukkan sitotoksisitas pada garis sel. Mempertimbangkan masalah keamanan adalah perhatian utama senyawa pemutih kulit yang saat ini tersedia, studi in vivo lebih lanjut diperlukan untuk memeriksa keamanannya secara fisiologi.

Bersama-sama, swertiajaponin menghambat akumulasi melanin hingga batas yang memuaskan baik dalam sel dan model kulit manusia dengan mekanisme ganda untuk menekan tirosinase melalui pengikatan langsung ke dan secara kompetitif menghambat tirosinase dan menekan pensinyalan MAPK / MITF yang dimediasi stres oksidatif (Gambar 7). Mempertimbangkan efek samping dan kurangnya efektivitas jangka panjang dari agen pemutih kulit yang dikenal seperti asam kojic dan arbutin [17], swertiajaponin mungkin lebih aman diterapkan untuk menekan pigmentasi kulit dan akan menjadi tambahan baru untuk kosmetik pemutih.

BAHAN DAN METODE

Uji aktivitas tirosinase menggunakan tirosinase jamur

Swertiajaponin dan asam kojic (50 μM) dimasukkan ke dalam pelat mikro 96-sumur (Nunc, Denmark) dalam buffer tirosinase (200 μL) yang mengandung tirosinase jamur (1000 U), larutan 1 mM L-tirosin, dan 50 mM fosfat penyangga (pH 6,5) [5]. Pelat diinkubasi pada 37 derajat selama 15 menit dan dopaquinone dievaluasi dengan spektrofotometri (450 nm). Berdasarkan pengukuran tersebut, IC50 dihitung menggunakan kurva log-linier dan persamaannya.

Simulasi docking swertiajaponin dan tirosinase

AutoDock Vina digunakan untuk simulasi docking protein-ligan in silico. Struktur tiga dimensi tirosinase digunakan dalam struktur kristal Agaricus bisporus (PDB ID: 2Y9X). Situs pengikatan tirosin yang telah ditentukan sebelumnya diterapkan sebagai kantong dok. Setelah simulasi docking antara tirosinase dan swertiajaponin atau asam kojic dilakukan, perangkat lunak LigandScout 3.0 digunakan untuk memprediksi residu pengikatan antara berbagai senyawa dan tirosinase.

Analisis kinetik penghambatan tirosinase oleh swertiajaponin

L-DOPA disiapkan pada konsentrasi 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125, dan 0.0625 mM, dan swertiajaponin disiapkan pada 20, 40, dan 80 μM. Larutan campuran reaksi disiapkan dalam pelat sumur 96-, di mana 20 μL substrat tirosinase (L-DOPA), 10 μL larutan tirosinase jamur berair (200 U), dan 50 mM buffer kalium fosfat (pH 6.5) ditambahkan. Laju produksi dopakrom campuran reaksi diukur pada panjang gelombang 450 nm menggunakan pembaca pelat mikro. Laju penghambatan tirosinase swertiajaponin kemudian dihitung menggunakan analisis plot Lineweaver-Burk. Konstanta Michaelis (Km) dan kecepatan maksimal (Vmax) juga dihitung dengan plot Lineweaver-Burk dengan konsentrasi substrat L-DOPA yang berbeda [3].

Kultur sel dan uji viabilitas

Sel melanoma B16F10 dibeli dari Korea Cell Line Bank. Sel-sel tersebut dikultur dalam medium Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) dengan 5 persen serum janin sapi (FBS), dan 1 persen penisilin, streptomisin, L-glutamin, dan natrium piruvat. Sel-sel dipertahankan pada suhu 37 derajat dalam atmosfer 95 persen udara/5 persen CO2 yang dilembabkan. Untuk pengujian viabilitas sel, sel diunggulkan dalam pelat sumur 96-. Sel melanoma B16F10 diobati dengan swertiajaponin pada berbagai konsentrasi selama 48 jam. Ez-Cytox (10 μL) ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi selama 2 jam. Kristal formazan yang terbentuk diukur dengan spektrofotometri pada 450 nm. Viabilitas sel dihitung menggunakan sel tanpa perlakuan swertiajaponin sebagai kelompok kontrol.

Kandungan melanin dalam sel B16F10

Tingkat melanin diukur menggunakan metode yang dijelaskan sebelumnya dengan sedikit modifikasi [18]. Sel B16F10 dibiarkan tumbuh hingga 70-80 persen pertemuan di 6-pelat sumur. Sel-sel telah dirawat sebelumnya dengan swertiajaponin atau asam kojic selama 2 jam. Setelah itu, MSH atau UVB diperlakukan dengan media yang mengandung asam swertiajaponin atau kojic dan diinkubasi selama 48 jam. Setelah dicuci dengan PBS, sel dipisahkan menggunakan tripsin dan dilarutkan dalam 90 μL larutan NaOH 1 N yang mengandung DMSO (5 persen ). Setelah inkubasi pada 60 derajat selama 1 jam, kandungan melanin ditentukan dengan mengukur absorbansi pada 405 nm. Ruang UV yang tersedia secara komersial (Boteck UV X000, UV-AB, LAB24, Korea) digunakan untuk pemaparan UVB sel B16F10.

blotting Barat

Sampel protein yang diisolasi dari sel B16F10 (30 ug) dipisahkan dengan elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida menggunakan 10-12 persen gel akrilamida dan dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida, yang kemudian segera ditempatkan dalam buffer pemblokiran ( 5 persen susu tanpa lemak) dalam 10 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl, dan 0,1 persen Tween 20. Membran dicuci dalam buffer TBS-Tween selama 30 menit kemudian diinkubasi dengan antibodi primer spesifik (1:1{ {24}} pengenceran) ditunjukkan dalam legenda gambar pada 4 derajat semalam. Setelah dicuci dengan buffer TBS-Tween, membran diinkubasi dengan antibodi anti-tikus terkonjugasi peroksidase horseradish (Santa Cruz, 1: 10,000), antibodi anti-kelinci (Santa Cruz, 1: 10, 000), atau antibodi anti-kambing (Santa Cruz, 1: 10.000) pada suhu 25 derajat selama 1 jam. Imunoblot divisualisasikan menggunakan larutan Western Bright Peroxide (Advansta, CA, USA) dan sistem pencitraan ChemiDoc Touch (Bio-Rad, USA) sesuai dengan instruksi pabriknya. Antibodi yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut: p-CREB (Santa Cruz-81486), CREB (Santa Cruz-81486), tyrosinase (Cell Signaling-104976), pMITF (Abcam{{40 }}), MITF (Abcam-20663), p-p38 (Pensinyalan Sel-921L), p38 (Pensinyalan Sel-9212S), pERK (Pensinyalan Sel-4370L ), ERK (Pensinyalan Sel-9201L), pJNK (Pensinyalan Sel-9251L), JNK (Pensinyalan Sel-9252S), dan -actin (Santa Cruz-47778) .

Pengukuran tingkat ROS dan ONOO-

Aktivitas antioksidan swertiajaponin diperiksa menggunakan fluoresen 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) untuk ROS dan dihydro rhodamine (DHR) 123 untuk ONOO-. Secara singkat, untuk menentukan level ROS, DCFDA (25μM) ditambahkan ke homogenat sel untuk volume akhir 250ul. Untuk mengukur tingkat ONOO-, 10ul homogenat sel ditambahkan ke larutan rhodamine (buffer natrium fosfat 50mM, natrium klorida 90mM, asam dietilentriaminepentaasetat [DTPA] 5mM, dan DHR123). Untuk kedua pengujian, fluoresensi diukur setiap 5 menit selama 30 menit pada pembaca pelat fluoresensi, dengan panjang gelombang eksitasi dan emisi masing-masing ditetapkan pada 485 dan 530 nm.

Akumulasi melanin dalam model kulit manusia

Epidermis manusia tiga dimensi yang layak, dibentuk kembali, (Neoderm-ME, Tego Science) digunakan untuk menguji efek anti-melanogenik dari swertiajaponin dalam model kulit manusia. Model kulit manusia diberi perlakuan awal dengan DMSO (kendaraan) atau swertiajaponin selama 1 jam dan dikultur dalam media pemeliharaan yang disediakan oleh perusahaan selama 5 hari dengan perlakuan DMSO atau swertiajaponin. Analisis mikroskopis dilakukan dari hari 1 sampai hari 5 untuk mengamati pigmentasi kulit. Gambar mikroskopis dianalisis dengan perangkat lunak Image J untuk semi-kuantifikasi penggelapan kulit. Untuk pewarnaan Fontana-Masson, sampel kulit difiksasi dalam paraformaldehyde 4 persen semalam pada suhu kamar dan sampel dianalisis oleh perusahaan yang tersedia secara komersial (Garam Meditech, Korea Selatan).

Analisis statistik

Semua data disajikan sebagai rata-rata ± SEM. Kelompok yang berbeda dibandingkan dengan menggunakan analisis varians satu arah diikuti dengan post-test Dunnett. P < 0.05 dianggap signifikan secara statistik.

KONFLIK KEPENTINGAN

Tidak ada konflik kepentingan untuk dideklarasikan.

PENDANAAN

Pekerjaan ini didukung oleh Grant K17281 dari Korea Institute of Oriental Medicine, Kementerian Pendidikan, Sains dan Teknologi (MEST), Republik Korea.

REFERENSI

1. Bradford PT. Kanker kulit pada kulit berwarna. Dermatol Nurs. 2009; 21: 170-7, 206.

2. Briganti S, Camera E, Picardo M. Pendekatan kimia dan instrumental untuk mengobati hiperpigmentasi. Res Sel Pigmen. 2003; 16: 101-10.

3. Kang KH, Lee B, Son S, Yun HY, Moon KM, Jeong HO, Kim DH, Lee EK, Choi YJ, Kim DH, Chun P, Moon HR, Chung HY. (Z)-2-(Benzo[d]thiazol-2-ylamino)-5- (substitusi benzylidene) thiazol-4(5H)-satu turunan sebagai penghambat tirosinase baru. Banteng Farmasi Biol. 2015; 38: 1227-33.

4. Lee B, Moon KM, Kim SJ, Kim SH, Kim DH, An HJ, Jeong JW, Kim YR, Son S, Kim MJ, Chung KW, Lee EK, Chun P, dkk. (Z)-5-(2,4-dihydroxy benzylidene) thiazolidine- 2,4-dione mencegah melanogenesis yang diinduksi UVB dan pembentukan kerutan melalui penekanan stres oksidatif dalam HRM{{7} } tikus tak berbulu. Oxid Med Sel Longev. 2016; 2016: 2761463.

5. Lee B, Moon KM, Son S, Yun HY, Han YK, Ha YM, Kim DH, Chung KW, Lee EK, An HJ, Ullah S, Chun P, Moon HR, dkk. (2R/S,4R)-2-(2,4-dihidroksi fenil) thiazolidine- 4-asam karboksilat mencegah pembentukan kerutan akibat UV melalui penghambatan peradangan yang dimediasi NF-kappaB. J Dermatol Sci. 2015; 79: 313-6.

6. Kubo I, Kinst-Hori I, Chaudhuri SK, Kubo Y, Sanchez Y, Ogura T. Flavonol dari Heterotheca meliputi: aktivitas penghambatan tirosinase dan kriteria struktural. Bioorg Med Kimia. 2000; 8: 1749-55.

7. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Identifikasi residu situs aktif yang terlibat dalam pengikatan kofaktor logam dan pengenalan substrat stereospesifik dalam tirosinase mamalia. Implikasi pada siklus katalitik. Biokimia. 2002; 41: 679-86.

8. Kim D, Park J, Kim J, Han C, Yoon J, Kim N, Seo J, Lee C. Flavonoid sebagai penghambat tirosinase jamur: studi pendinginan fluoresensi. Kimia Makanan J Agric. 2006; 54: 935-41.

9. Orhan IE, Khan MT. Turunan flavonoid sebagai inhibitor tirosinase yang kuat - survei temuan terbaru antara 2008-2013. Curr Top Med Chem. 2014; 14: 1486-93.

10. Komatsu M, Tomimori T, Makiguchi Y. Studi tentang komponen Swertia japonica. II. Isolasi dan struktur flavonoid baru, swertiajaponin. Chem Pharm Bull (Tokyo). 1967; 15: 1567-72.

11. Kimura Y, Sumiyoshi M. Efek ekstrak Swertia japonica dan senyawa utamanya swertiamarin pada pengosongan lambung dan motilitas gastrointestinal pada tikus. Fitoterapia. 2011; 82: 827-33.

12. Park JI, Lee HY, Lee JE, Myung CH, Hwang JS. Efek penghambatan 2-methyl-naphtho[1,2,3-de]quinolin-8-one pada transportasi melanosom dan pigmentasi kulit. Rep Sains 2016; 6: 29189.

13. Cotelle N. Peran flavonoid dalam stres oksidatif. Curr Top Med Chem. 2001; 1: 569-90.

14. Sim MO, Ham JR, Lee MK. Daun alang-alang muda (Phragmites communis) menekan melanogenesis dan stres oksidatif pada sel melanoma B16F10. Apoteker Biomed. 2017; 93: 165-71.

15. D'Mello SA, Finlay GJ, Baguley BC, Askarian-Amiri ME. Jalur pensinyalan dalam melanogenesis. Int J Mol Sci. 2016; 17.

16. Huang HC, Liao CC, Peng CC, Lim JM, Siao JH, Wei CM, Chen CC, Wu CS, Chang TM. Dihydromyricetin dari Ampelopsis grossedentata menghambat melanogenesis melalui regulasi jalur pensinyalan MAPK, PKA, dan PKC. Kimia Biol Berinteraksi. 2016; 258: 166-74.

17. Hsu KD, Chen HJ, Wang CS, Lum CC, Wu SP, Lin SP, Cheng KC. Ekstrak miselium Ganoderma formosanum sebagai penghambat tirosinase yang sangat kuat. Rep Sains 2016; 6: 32854.

18. Bilodeau ML, Greulich JD, Hullinger RL, Bertolotto C, Ballotti R, Andrisani OM. BMP-2 merangsang ekspresi gen tirosinase dan melanogenesis dalam melanosit yang berdiferensiasi. Res Sel Pigmen. 2001; 14: 328-36.