Karakterisasi struktural Cistanche deserticola polisakarida dan efek perlindungannya pada cedera sel HK -2 yang diinduksi glukosa tinggi

Abstrak:

 

Tujuan: Untuk mempelajari struktur Cistanche deserticola polysaccharides (CDP) dan efek pelindung dan mekanisme sel epitel tubular proksimal manusia (hk {{0}) cedera. Metode: Komposisi kimia, berat molekul, komposisi monosakarida dan kemungkinan struktur CDP terdeteksi dengan metode fenol asam sulfat, metode hidroksil biphenyl, metode biru cemerlang, metode kromatografi ion, kromatografi permeasi gel kinerja tinggi dan kromatografi inframerah. Efek pelindung CDP pada cedera HK -2 dan mekanismenya dievaluasi dengan menetapkan model kerusakan sel HK -2 yang diinduksi oleh glukosa tinggi. Hasil: Berat molekul rata -rata, paku, {{21} 31,4198,34444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 KDPS adalah 8444444444444444444444444444444444444444444444444444444 dan arabinose, dan mungkin ada ikatan -glikosida. Ini dapat mengurangi kerusakan oksidatif sel HK -2 yang diinduksi oleh glukosa tinggi dan kerusakan pot membran mitokondria sel HK -2 yang diinduksi oleh glukosa tinggi. Ekspresi relatif protein reseptor 4 (TLR4) seperti Toll dan rasio faktor -p -nuclear (NF) -kB p65 / -actin dan p -iκB / -actin dalam sel HK -2 secara signifikan menurun setelah intervensi dengan konsentrasi CDP yang berbeda (P <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05, p <0,05) secara signifikan menurun. Kesimpulan: CDP dapat mengurangi tinggisel epitel tubular ginjal yang diinduksi glukosaCedera dengan menghambat TLR4 / NF-κB untuk meningkatkan proliferasi sel dan menghambat stres oksidatif dan apoptosis.

 

Kata kunci: Cistanche deserticola polisakarida; Sel epitel tubular ginjal manusia; Stres oksidatif; Jalur TLR4/NF-κB

 

 

 

Cistanche untuk Diabetes Nefropathy (DN)

 

Nefropati Diabetes (DN)adalah penyebab utama penyakit ginjal stadium akhir dan secara serius mengancam kehidupan dan kesehatan pasien [1]. Cedera tubular ginjal memainkan peran penting dalam kejadian dan pengembangan DN. Kelainan hemodinamik, stres oksidatif, respons inflamasi, dan kelainan metabolik yang disebabkan oleh lingkungan gula tinggi dapat menginduksi apoptosis dan nekrosis sel epitel tubulus ginjal, yang menyebabkan kerusakan tubulus ginjal [2,3]. TLR4 di ginjal adalah anggota keluarga TLRS, dan transduksi sinyal terkait memainkan peran penting dalam kejadian dan pengembangan DN [4]. Di bawah kondisi glukosa tinggi, ekspresi tinggi TLR4 di ginjal dapat mengaktifkan jalur NF-κB, memperburuk kerusakan oksidatif seluler dan menyebabkan apoptosis sel HK -2 [5, 6].
Cistanches Herba adalah batang berdaging kering dengan daun fosfor Cistanche deserticola ycma dan (OR) Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, tanaman obat tradisional dan bisa dimakan. Rasanya manis, asin,

Itu menghangat dan memasukiMeridian usus ginjal dan besar. Ini memiliki efek tonifying ginjal yang, meningkatkan esensi dan darah, dan melembabkan usus dan menghilangkan sembelit. [7] Polisakarida adalah salah satu bahan aktif utama Cistanche deserticola. Kandungan polisakarida dalam ekstrak air Cistanche deserticola relatif tinggi, dengan literatur melaporkan bahwa kontennya 29,598 hingga 39,609 mg/g [8]. Ini terutama terdiri dari glukosa, galaktosa, rhamnose, arabinose, fruktosa, dll. Ini terdiri dari monosakarida dan memiliki banyak efek farmakologis, termasuk mengatur aktivitas kekebalan tubuh, anti-penuaan, meningkatkan pembelajaran dan memori, melindungi saraf, melawan kerusakan hati, anti-virus, dan anti-tumor [9]. Dalam beberapa tahun terakhir, sejumlah besar penelitian telah menunjukkan bahwa polisakarida dalam pengobatan tradisional Tiongkok dapat meningkatkan nefropati diabetes. Karakteristik multi-target, multi-jalur dan efek signifikan dari polisakarida herbal Cina menunjukkan potensi besar dalam intervensi dalam nefropati diabetik [10]. Dalam studi oleh Wang et al. [11], polisakarida Banyan menunjukkan efek yang signifikan dalam meningkatkan metabolisme glukosa dan lipid, mengurangi respons inflamasi, dan mengatur mikrobiota usus tikus diabetes tipe 2 melalui sumbu usus-hati. Studi sebelumnya oleh tim peneliti telah menunjukkan bahwa ekstrak air Cistanche deserticola dapat meningkatkan laju kelangsungan hidup sel HK -2 dalam lingkungan gula dan lemak tinggi, mengatur apoptosis sel, stres oksidatif dan tingkat peradangan, dan memiliki efek terapeutik potensial pada nefropati diabetes [12]. Hasil eksperimen hewan menunjukkan bahwa CDP dapat secara efektif meningkatkan nefropati diabetes pada tikus, dan hasil patologis menunjukkan bahwa fibrosis tubulus ginjal secara signifikan ditingkatkan [13]. Namun, ada beberapa penelitian tentang peran Cistanche deserticola polisakarida dalam melindungi model sel HK -2 yang diinduksi glukosa tinggi. Mengingat potensi aktivitas farmakologis dan mekanisme polisakarida, penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi komposisi kimia, struktur molekul dan struktur molekul CDP dengan menggunakan metode fenol asam sulfat, metode hidroksibiphenyl, metode kromatografi hydroxybiphenyl, cromatografi hydroation kromatografi. Komposisi massa, monosakarida, dan struktur yang mungkin dianalisis, dan model kerusakan sel HK -2 yang diinduksi oleh glukosa tinggi ditetapkan untuk mengevaluasi efek perlindungan CDP pada kerusakan HK -2 dan mekanisme tindakannya. Memberikan dasar teoritis dan bukti eksperimental untuk aplikasi potensial CDP dalam pengobatan DN.

1 Bahan dan Metode
1.1 Bahan dan Instrumen

CDPS (konten Polysaccharide> 8 0%, nomor batch: 2306019, perusahaan Shaanxi Xintianyu); dapagliflozin (DAPA, nomor batch: bms -512148, AstraZeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.); sel epitel tubular ginjal manusia hk -2 (nomor batch: 20231014, Actt Company, USA); Medium Budaya MEM, serum sapi janin (nomor lot: 20231014, 20231014, Gibco Company, USA); PBS Buffer (Nomor Lot: 20230906, Hyclone Company, USA); Solusi pencernaan trypsin yang mengandung EDTA 0,25% (nomor lot: 20240411, Perusahaan Anhui Biosharp); Cck -8 kit deteksi viabilitas sel (nomor batch: 20240415, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); Superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), glutathione peroxidase
Peroksidase, GSH-PX) Kit Deteksi (NO.: 20240505, 20240423, 20240423, Shanghai Youxuan Biotechnology Co., Ltd.); Hoechst33258 Pewarnaan Apoptosis Kit (Batch No.: 20240223, Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.); Jc -1 pewarnaan
Kit Deteksi Potensi Membran Mitokondria (Batch No.: 20240319, Wuhan Elarite Biotechnology Co., Ltd.); Dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA) Spesies Deteksi Oksigen Reaktif (ROS) Reagen
Kit (Lot No.: 20231225, Beijing Solebow Technology Co., Ltd.); Antibodi monoklonal TLR4, faktor nuklir-fosforilasi p65 (phospho-NF-κB p65, P-NF-κB p65) antibodi monoklonal (lot no.: 10032512, 00128965, Wuhan yang mengandalkan bioteknologi Co., LTD.).

Kromatografi ion ICS5000, pembaca microplate Mul-Tigo (Thermo Fisher, USA); PowerPac HC+Instrumen Elektroforesis Protein Mini (Biorad, USA); TS2 mikroskop terbalik (Nikon, Jepang); Lc -10 kromatografi cair berkinerja tinggi, ri -20 Detektor diferensial (Shimadzu Technology Co., Ltd., Jepang); 105-103-101 (8 mm × 300 mm) kolom gel tandem (Brt Company, UK); Balance Elektronik CPA225D, Eppendorf5424 Centrifuge (Sartorius, Jerman).

 

1.2 Metode Eksperimental
1.2.1 Penentuan total gula, asam uronat dan kandungan protein CDP

Metode ini diikuti sesuai dengan referensi [14]. Total kandungan gula CDP ditentukan oleh metode asam fenol-sulfuri; Kandungan asam uronat CDP ditentukan oleh metode kolorimetri M-hydroxybifenyl; dan kandungan protein CDP ditentukan oleh metode Coomassie Brilliant Blue.

 

1.2.2 Penentuan Massa Molekul

Distribusi berat molekul polisakarida terdeteksi oleh kromatografi permeasi gel kinerja tinggi kolom tandem. Serangkaian dextran standar (dextran p {{0}}, p -10, p {{2}, p {{3}, p {{4}, p {{5 {3}, p {6 {6 {4}, p {{{5}, p {6 {6 {6 {4}, p {{5}, p {6 {6 {6 {6 0. 0 5 mol/l Sebelum digunakan. Konsentrasi akhir adalah 5 mg/ml, vortexed untuk larut, dan disentrifugasi pada 12 0 00 r/mnt selama 10 menit. Supernatan disedot dan disaring dengan membran microporous air 0,22 μm. Setelah sentrifugasi berkecepatan tinggi, 0,05 mol/L NaCl digunakan sebagai fase gerak. Kolom kromatografi adalah BRT 105-103-101 (8 mm × 300 mm); Laju aliran adalah 0,7 ml /menit; Suhu kolom: 40 derajat; Volume Injeksi: 25 μl; detektor: diferensial detektor rid -20 a; Waktu analisis: 62 menit. Pilih metode kromatografi di atas untuk analisis, dapatkan waktu retensi, dan plot logaritma berat molekul puncak (MP) pada ordinat (LGMP) dan waktu retensi (RT) pada absis (LGMP-RT). Kurva standar: Menurut metode di atas, kurva retensi waktu retensi rata-rata-rata-rata (MW) kurva standar LGMW-RT dan bobot molekul rata-rata (Mn) kurva waktu retensi LGMN-RT dibuat untuk mendapatkan berat molekul. Formula Perhitungan. Mengganti waktu retensi sampel ke dalam formula, berat molekul (MP, MW, Mn) dapat diperoleh.

1.2.3 Komposisi monosakarida

Komposisi monosakarida ditentukan dengan menggunakan kromatografi ion. Mengambil jumlah yang sesuai dari 16 standar monosakarida (fucose, rhamnose, arabinose, galaktosa, glukosa, xilosa, mannosa, fruktosa, ribosa, asam galakturonat, asam glukuronat, asam aminogalaktosa, n-aketil), glukosamin hidroklorida, n-aketyloride), n-aketyloride), glukosamin hydrochloride, n-acetyl-derse) Ml 3 mol/L asam trifluoroasetat (TFA), dihidrolisis pada 120 derajat selama 3 jam, dikeringkan dengan nitrogen, dan ditambahkan untuk menghilangkan vortex air deionisasi untuk bercampur dengan baik dan menyiapkan larutan stok standar. Ambil setiap solusi standar monosakarida dan persiapkan standar konsentrasi secara akurat sebagai standar campuran. Menurut metode kuantifikasi absolut, massa monosakarida yang berbeda ditentukan, dan rasio molar dihitung berdasarkan massa molar monosakarida.
Tambahkan 2 ml 3 mol/L TFA ke polisakarida dan bereaksi pada 12 0 derajat selama 3 jam. Selama reaksi, N2 digunakan untuk perlindungan. Larutkan setelah penguapan di bawah tekanan berkurang. Tambahkan 5 ml air dan vortex untuk dicampur. Ambil 5 0 μl dan tambahkan 950 μl air deionisasi. Centrifuge di RPM selama 5 menit. Supernatan disaring melalui membran mikrofiltrasi 0,22 μm dan dianalisis dengan kromatografi ion. Kolom adalah Dionex Carbopactm PA20 (3 mm × 150 mm); Fase gerak adalah: H2O; B: 15 mol/lnaoh; C: 15 mol/ L NaOH & 100 mol/ L NAAC; Laju aliran: 0,3 ml/menit; Volume injeksi: 25 μl; Suhu kolom: 30 derajat ;. Detektor: Detektor Elektrokimia; gradien elusi lihat Tabel 1.

 

Tabel 1 Tabel Elusi Gradien Fase Mobile

 

 

1.2.4 Deteksi Spektrum Inframerah

Timbang 1 mg polisakarida kering dan bubuk KBR, giling dan aduk dalam mortir, dan tekan ke dalam lembaran tipis menggunakan tekan tablet. Analisis dilakukan dengan menggunakan spektrometer inframerah Fourier Transform dalam kisaran nomor gelombang 4500 ~ 400cm -1.

 

1.2.5 Efek pelindung CDP pada sel HK -2 yang diinduksi glukosa tinggi dalam nefropati diabetes

1.2.5.1 hk -2 kultur sel

Setelah hk {{0}} sel dihidupkan kembali, mereka dikultur dalam media lengkap yang mengandung 10% serum sapi janin dan antibodi ganda 1%, dan sel -sel ditempatkan dalam inkubator kultur sel pada 37 derajat, 5% CO2 dan kelembaban jenuh untuk menempel pada dinding. . Ketika sel tumbuh hingga 80% hingga 90%, mereka dicerna dengan 0,25% trypsin dan subkultur. Sel HK -2 dalam fase pertumbuhan logaritmik digunakan untuk percobaan berikutnya.

 

1.2.5.2 Persiapan larutan stok CDP dan konsentrasi dosis.

Timbang secara akurat 3 0 mg CDP, tambahkan 6 ml media lengkap glukosa tinggi MEM untuk menyiapkan solusi stok CDPs 5 mg/ml, dan simpan di lemari es 4 derajat. Saat menggunakan, ukur volume tertentu dari larutan ibu CDPS, tambahkan media kultur, aduk rata, sterilisasi dengan filter steril 0,22 μm, dan siapkan larutan sampel konsentrasi yang sesuai.

 

1.2.5.3 Efek CDP pada sel HK -2 normal

Hk -2 sel dalam fase pertumbuhan logaritmik diunggulkan dalam 96- pelat sumur pada kepadatan 3000 sel/sumur. Menurut hasil percobaan awal, sel -sel dibagi menjadi kelompok kontrol normal (kelompok kontrol, CON), konsentrasi massa yang berbeda (25, 50, 100, 200, 400, 800, 1000, 1600 ug/ml)
Kelompok kosong yang hanya berisi media kultur yang diatur; Setelah kultur dengan media kultur atau obat selama 24 jam dan 48 jam, 100 μl media kultur yang mengandung 10% CCK -8 ditambahkan ke masing -masing sumur dan sel diinkubasi pada 37 derajat untuk menghindari cuti dalam cahaya selama 1,5 jam. Kepadatan optik (OD) dari masing -masing sumur diukur pada panjang gelombang 450 nm menggunakan pembaca mikro, dan viabilitas sel (%) dihitung sesuai dengan rumus "viabilitas sel (%)=[OD OD OBAT - OD Sumur Kosong) (OD Kontrol Sumur / OD -OD sumur kosong)] × KOPOSIONAL × Sumur 100%Sumur Kosong" ke sel normal.

1.2.5.4 hk -2 sel pemodelan glukosa tinggi dan penyaringan konsentrasi
Siapkan larutan stok glukosa (glukosa, GLC) (10 mg/ml) dan encerkan dengan media kultur lengkap hingga konsentrasi pemodelan masing -masing 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, dan 80 mmol/L untuk digunakan. Sel HK -2 dalam fase pertumbuhan logaritmik diunggulkan dalam {96- pelat sumur pada 3000/well, dan con, kelompok model (model, mod), dan kelompok penyesuaian kosong diatur dan diberikan media kultur lengkap dan media kultur glukosa tinggi dari konsentrasi yang berbeda, masing -masing. , jumlah yang sama dari media kultur lengkap, kultur selama 24 jam dan 48 jam, dan mendeteksi viabilitas sel sesuai dengan metode di bawah "1.2.5.3".

 

1.2.5.5 Pengaruh CDP pada tingkat kelangsungan hidup sel model

Menurut hasil eksperimen "1.2.5.4", sel hk -2 dalam fase pertumbuhan logaritmik diunggulkan dalam {96- pelat sumur pada kepadatan 3000 sel per sumur. Sel -sel dibagi menjadi konsentrasi massa CON, MOD, dan berbeda dari 50, 100, dan 200 sel dikultur pada 400 ug/mL, 400 ug/mL, dan 800 ug/mL CDP. Kelompok penyesuaian kosong tanpa sel diatur. Kelompok penyesuaian con dan kosong ditambahkan dengan jumlah media lengkap yang sama. Mod dan setiap kelompok yang diobati dengan obat ditambahkan dengan 60 mmol/L GLC dan dikultur selama 24 jam. , buang media kultur, tambahkan media kultur atau obat dan kultur yang sesuai selama 24 jam dan 48 jam, dan mendeteksi tingkat kelangsungan hidup sel sesuai dengan metode di bawah "1.2.5.3".

 

1.2.5.6 Efek CDP pada indikator stres oksidatif dalam sel model

Menurut hasil percobaan dalam "1.2.5.5", sel-sel dibagi menjadi con, mod, kelompok CDP dosis tinggi (CDPS-H, 400 mg/kg), kelompok CDP dosis menengah (CDPS-M, 200 mg/kg), kelompok CDPS dosis rendah, CDPS-L, 100 mg/kg) dan DAPAGLOLOLO-LOUT, CDPS-L, 100 mg/kg) dan DapaglifloLoLOLOLODS (CDPS-L, 100 mg/kg) dan DAPAGLOLOLOLO-LOPLOLO (CDPS-L, 100 mg/kg) dan Dapagliflo Pada kelompok penyesuaian nol, setelah pemodelan, media kultur atau obat yang sesuai ditambahkan dan dikultur selama 24 jam. Protein dikumpulkan dan lisat dinormalisasi ke tingkat yang sama dengan koreksi konsentrasi protein. Menurut instruksi dari masing-masing kit indikator, konten MDA, GSH-PX dan aktivitas SOD di setiap kelompok sel terdeteksi.

 

1.2.5.7 Deteksi ROS di sel HK -2

Tambahkan suspensi sel ke 6- pelat sumur dan tempatkan dalam inkubator kultur sel sampai sel tumbuh menjadi monolayer dan menerima stimulasi yang sesuai. Cuci sel 3 kali dengan PBS yang didinginkan sebelumnya dan encerkan dengan media MEM bebas serum. Pewarna fluoresen DCF-DA diencerkan ke konsentrasi akhir 10 μmol/L. Pewarna ditambahkan ke pelat sumur 6-, sel-sel dicuci 3 kali dengan PBS yang didinginkan sebelumnya, dan pewarna fluoresen DCFH-DA diencerkan ke konsentrasi akhir 10 μmol/L dengan media MEM bebas serum. µmol/l, pewarna ditambahkan ke pelat sumur {6-, pewarna dibuang, sel-sel dicuci tiga kali dengan media MEM bebas serum, dan kemudian gambar dikumpulkan di bawah mikroskop fluoresensi.