Lonjakan Dan Nsp6 Adalah Penentu Utama Redaman SARS-CoV-2 Omicron BA.1

Varian SARS-CoV-2 Omicron lebih bersifat imun evasive dan kurang ganas dibandingkan varian virus utama lainnya yang sejauh ini telah dikenali1–12. Protein Omicron spike (S), yang memiliki jumlah mutasi yang luar biasa besar, dianggap sebagai pendorong utama fenotip ini. Di sini kami membuat SARS-CoV-2 rekombinan chimeric yang mengkode gen S dari Omicron (garis keturunan BA.1) di tulang punggung isolat SARS-CoV-2 leluhur, dan membandingkan virus ini dengan Omicron yang bersirkulasi secara alami varian. Virus yang mengandung Omicron S berhasil lolos dari imunitas humoral yang diinduksi oleh vaksin, terutama karena mutasi pada motif pengikatan reseptor; namun, tidak seperti Omicron yang terjadi secara alami, Omicron secara efisien direplikasi dalam garis sel dan sel paru-paru distal seperti primer. Demikian pula, pada tikus K18-hACE2, meskipun Omicron S yang membawa virus menyebabkan penyakit yang tidak separah virus leluhurnya, virulensinya tidak dilemahkan hingga ke tingkat Omicron. Penyelidikan lebih lanjut menunjukkan bahwa mutasi protein non-struktural 6 (nsp6) selain protein S cukup untuk merekapitulasi fenotip Omicron yang dilemahkan. Hal ini menunjukkan bahwa meskipun pelepasan vaksin Omicron didorong oleh mutasi pada S, patogenisitas Omicron ditentukan oleh mutasi baik di dalam maupun di luar protein S.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Pada bulan Desember 2022, gelombang pandemi COVID-19 berturut-turut telah didorong oleh lima varian utama SARS-CoV-2, yang dikenal sebagai varian yang menjadi perhatian (VOC): Alpha (B.1.1.7) , Beta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (garis keturunan B.1.617.2 dan AY) dan Omicron (garis keturunan BA)13. Omicron adalah VOC yang paling baru dikenali, dan pertama kali didokumentasikan di Afrika Selatan, Botswana, dan oleh wisatawan dari Afrika Selatan di Hong Kong pada bulan November 2021 (GISAID ID: EPI_ISL_7605742)14, 15. Penyakit ini dengan cepat menyebar ke seluruh dunia, menggantikan varian Delta yang sebelumnya dominan dalam beberapa minggu dan menyebabkan sebagian besar infeksi SARS-CoV-2 baru pada Januari 2022 (referensi 16–18). Setidaknya lima garis keturunan Omicron sejauh ini telah diidentifikasi: BA.1, BA.2, BA.3, BA.4, dan BA.5. BA.1 (selanjutnya disebut sebagai Omicron) menunjukkan pelarian yang luar biasa dari imunitas humoral yang disebabkan oleh infeksi dan vaksin3,19. Selain itu, virus ini kurang ganas dibandingkan VOC lain pada manusia dan model infeksi in vivo4,5,7,11,12,20. Omicron berbeda dari prototipe isolat SARS-CoV-2, Wuhan-Hu-1, dalam 59 asam amino; 37 dari perubahan ini terjadi pada protein S, meningkatkan kemungkinan bahwa S adalah inti dari perilaku patogenik dan antigenik Omicron.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Mutasi S mempengaruhi replikasi Omicron dalam kultur sel

Protein Omicron S mengandung 30 substitusi asam amino, 6 penghapusan, dan satu penyisipan panjang 3 asam amino, dibandingkan dengan Wuhan-Hu-1 (Data Diperpanjang Gambar 1). Dua puluh lima dari perubahan ini bersifat unik pada Omicron dibandingkan dengan VOC lainnya, meskipun beberapa di antaranya telah dilaporkan pada air limbah dan varian kecil SARS-CoV-221,22. Untuk menguji peran protein S dalam fenotip Omicron, kami membuat virus rekombinan chimeric yang mengandung gen S Omicron (USA-lh01/2021) dan semua gen lain dari leluhur SARS-CoV-2 (GISAID EPI{ {16}}ISL_2732373)23 (Data Diperluas Gambar 2a). Virus chimeric ini, diberi nama Omi-S, dibuat dengan menggunakan bentuk modifikasi dari reaksi ekstensi polimerase sirkular (CPER)24 (Data Diperpanjang Gambar 2b) yang menghasilkan stok virus dengan konsentrasi tinggi, mengandung 0,5 × 106 –5 × 106 pembentuk plak. unit (PFU) per ml, dari sel yang ditransfeksi dalam waktu dua hari setelah transfeksi (Data Diperpanjang Gambar 2c,d), meniadakan kebutuhan untuk amplifikasi virus lebih lanjut.

Gambar 1|Pengaruh S pada kinetika pertumbuhan in vitro Omicron. Skema virus. S, paku; N, nukleokapsid. b–e, sel ACE2/TMPRSS2/Caco-2 (b,d) dan sel Vero E6 (c,e) terinfeksi pada MOI 0.01, dan persentase sel N-positif (n=6 ulangan) (b,c) dan pelepasan partikel menular (n=3 ulangan) (d,e) ditentukan dengan flow cytometry dan uji plak, masing-masing. f, sel ACE2/TMPRSS2/Caco-2 terinfeksi campuran virus dengan perbandingan 1:1 untuk mendapatkan MOI akhir sebesar 0.005 untuk setiap virus . Sel-sel difiksasi pada waktu yang ditentukan dan dilakukan flow cytometry. Kiri, plot titik representatif; benar, persentase sel yang tidak terinfeksi, terinfeksi Omi-S/mCherry, sel yang terinfeksi Omicron/mNeoGreen (Omicron/mNG), dan sel yang terinfeksi ganda. Sel yang terinfeksi tunggal digunakan untuk kompensasi. Bilah kesalahan, rata-rata ± sd (n {{20}} ulangan). g, Ukuran plak. Kiri, gambar representatif dari plak pada sel ACE2/TMPRSS2/Caco-2. Benar, diameter plak diplot sebagai rata-rata ± sd dari 20 plak per virus. h, Sel epitel iAT2 manusia terinfeksi pada MOI 2,5 selama 48 jam atau 96 jam. Sisi apikal sel dicuci dengan 1x phosphate-buffered saline (PBS) dan kadar partikel virus menular diukur dengan uji plak. Bilah kesalahan, rata-rata ± sd (n=4 ulangan). Percobaan diulang dua kali, dengan setiap ulangan percobaan mengandung 3 (b – g) atau 4 (h) ulangan. Nilai P dihitung dengan uji t dua sisi tidak berpasangan dengan koreksi Welch. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 dan ****P < 0,0001; NS, tidak signifikan. Strategi gating untuk flow cytometry ditunjukkan pada Gambar Tambahan 1.

Kami pertama-tama membandingkan efisiensi infeksi Omi-S dengan virus leluhur yang mengandung D614G (GISAID EPI_ISL_2732373; dihasilkan oleh CPER; selanjutnya disebut sebagai tipe liar (WT)) dan isolat Omicron (USA-lh01/2021) dalam kultur sel (Gbr. 1a). Untuk ini, kami menginfeksi sel ACE2- dan TMPRSS2-mengekspresikan Caco-2 (selanjutnya, ACE2/TMPRSS2/Caco-2) dan Vero E6 dengan Omi-S, WT dan Omicron dengan multiplisitas infeksi (MOI) 0,01, dan memantau penyebaran virus dengan flow cytometry dan uji pembentukan plak. Virus WT dan Omi-S menyebar dengan cepat di sel ACE2/TMPRSS2/Caco-2, masing-masing menghasilkan 89% dan 80% sel yang terinfeksi, pada 24 jam pasca infeksi (HPI) (Gbr. 1b). Sebaliknya, Omicron bereplikasi lebih lambat, menyebabkan 48% sel terinfeksi pada 24 hpi. Pola serupa terlihat pada sel Vero E6, di mana 60% dan 41% sel masing-masing positif untuk WT dan Omi-S, pada 48 hpi, dibandingkan dengan 10% untuk Omicron (Gbr. 1c). Uji plak menunjukkan bahwa meskipun Omi-S dan Omicron menghasilkan tingkat partikel virus menular yang lebih rendah dibandingkan dengan WT, titer virus Omi-S secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan Omicron. Dalam sel ACE2/TMPRSS2/Caco-2, Omi-S menghasilkan 5.1-lipatan (P=0.0006) dan 5.5-lipatan (P {{49} }.0312) partikel yang lebih menular daripada Omicron masing-masing pada 12 hpi dan 24 hpi (Gbr. 1d). Demikian pula, pada sel Vero E6, titer virus menular Omi-S adalah 17-kali lipat (P=0.0080) dan 11-kali lipat (P=0.0078) lebih tinggi dibandingkan Omicron pada 24 hpi dan 48 hpi, masing-masing (Gbr. 1e). Perbedaan antara virus menjadi kurang jelas di kemudian hari karena sitotoksisitas yang lebih tinggi yang disebabkan oleh Omi-S dibandingkan dengan Omicron (Data Diperpanjang Gambar 3a). Peningkatan efisiensi replikasi Omi-S relatif terhadap Omicron dipertahankan ketika diuji pada berbagai MOI (Data Diperpanjang Gambar 3b). Kami selanjutnya mengkonfirmasi keunggulan kebugaran Omi-S dibandingkan Omicron dengan uji kompetisi langsung. Untuk ini, pertama-tama kami menghasilkan Omicron (mikron) rekombinan, yang, dalam pengujian kultur sel kami, meniru kinetika replikasi Omicron alami (Data Diperpanjang Gambar 4). Selanjutnya, kami membuat Omi-S yang mengandung mCherry dan Omicron yang mengandung mNeonGreen, dan menginokulasi sel ACE2/TMPRSS2/Caco-2 dengan virus-virus ini yang dicampur dengan perbandingan 1:1. Analisis aliran sitometri sel yang terinfeksi pada berbagai waktu infeksi menunjukkan bahwa Omi-S/mCherry jelas lebih unggul daripada Omicron/mNeonGreen dalam hal replikasi (Gbr. 1f). Terakhir, efisiensi infeksi yang lebih tinggi dari Omi-S juga tercermin dalam ukuran plak; meskipun virus WT menghasilkan plak terbesar (sekitar 4,1 mm), ukuran plak Omi-S (sekitar 2,2 mm) dua kali lipat (P <0,0001) lebih besar dibandingkan plak Omicron (sekitar 1,1 mm) (Gbr. 1g). Hasil ini menunjukkan bahwa meskipun mutasi pada protein S mempengaruhi efisiensi infeksi Omicron, mutasi tersebut tidak sepenuhnya menjelaskan fenotip Omicron.

Beberapa bukti menunjukkan bahwa protein S yang dimasukkan ke dalam Omi-S berperilaku sama seperti pada Omicron alami. Misalnya, seperti dijelaskan sebelumnya20,25, Omicron S memiliki belahan yang buruk dibandingkan dengan WT S; sedangkan 71% S dalam virion WT berada dalam bentuk terbelah, masing-masing hanya 45% dan 47% yang terbelah dalam Omi-S dan Omicron (Data Diperpanjang Gambar 5a). Pola pembelahan S yang sama terlihat jelas pada sel yang terinfeksi virus (WT, 63% terpecah; Omi-S, 33% terpecah; Omicron, 42% terbelah) (Data Diperpanjang Gambar 5b). Eksperimen ini juga mengungkapkan bahwa Omicron S tidak efisien dimasukkan ke dalam partikel virus dibandingkan dengan WT S (rasio S terhadap nukleokapsid (N): 3,40 untuk virus WT, 1,91 untuk Omi-S, dan 2,04 untuk Omicron) (Data Diperpanjang Gambar 5a). Demikian pula, baik Omi-S dan Omicron menghasilkan syncytia yang lebih kecil dibandingkan dengan virus WT, sebuah pengamatan yang sebelumnya telah dilaporkan untuk Omicron20,26 (Data Diperpanjang Gambar 5c). Akhirnya, konsisten dengan literatur yang diterbitkan25, Omi-S dan Omicron menunjukkan preferensi untuk entri yang dimediasi cathepsin, sebagaimana tercermin dari sensitivitasnya yang lebih tinggi terhadap inhibitor cathepsin E64d (Data Diperpanjang Gambar 6). Kami selanjutnya membandingkan kinetika replikasi WT, Omi-S, dan Omicron dalam sel epitel paru-paru, yang membentuk situs replikasi virus utama pada pasien COVID-19 (ref. 27,28). Oleh karena itu, kami menggunakan sel epitel alveolar paru tipe 2 (iAT2) yang berasal dari sel batang pluripoten yang diinduksi manusia (iPS). Sel AT2 mewakili populasi sel penting di bagian distal paru-paru dan merupakan salah satu target utama infeksi SARS-CoV-228,29. Kami menginfeksi sel iAT2, yang ditumbuhkan sebagai kultur antarmuka udara-cair (ALI), pada MOI 2,5 dan memantau sekresi keturunan virus pada sisi apikal sel pada 48 hpi dan 96 hp. Sesuai dengan hasil yang diperoleh dari garis sel, virus WT menghasilkan partikel virus menular tingkat tertinggi (Gbr. 1h). Di antara Omi-S dan Omicron, yang pertama menghasilkan titer virus menular sekitar lima kali lipat (P=0.0008) lebih tinggi pada 48 hp. Titer virus untuk WT dan Omi-S menurun pada 96 dpi dibandingkan dengan 48 hp karena efek sitopatik (CPE) dari infeksi. Namun, tidak ada CPE yang terlihat pada Omicron, sehingga menyebabkan produksi virion menular yang berkelanjutan. Secara keseluruhan, hasil ini menguatkan kesimpulan bahwa mutasi pada S tidak sepenuhnya memperhitungkan kapasitas replikasi Omicron yang dilemahkan dalam kultur sel.

manfaat cistanche untuk pria-memperkuat sistem kekebalan tubuh

Klik di sini untuk melihat produk Cistanche Meningkatkan Imunitas

【Minta lebih lanjut】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Aplikasi WhatsApp: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Peran minimal S dalam patogenisitas Omicron pada tikus

Untuk menguji apakah Omi-S menunjukkan kebugaran in vivo yang lebih tinggi dibandingkan dengan Omicron, kami menyelidiki hasil infeksi Omi-S relatif terhadap WT SARS-CoV-2 dan Omicron pada tikus K18-hACE2. Sesuai dengan literatur yang diterbitkan4,5, inokulasi intranasal pada tikus (berusia 12-20 minggu) dengan Omicron (104 PFU per tikus) tidak menyebabkan penurunan berat badan yang signifikan, sedangkan inokulasi dengan virus WT memicu penurunan berat badan secara cepat, pada semua tikus. kehilangan lebih dari 20% berat badan awal dalam 8 hari pasca infeksi (dpi) (Gbr. 2a). Khususnya, 80% tikus yang terinfeksi Omi-S juga kehilangan lebih dari 20% berat badannya sebesar 9 dpi (Gambar 2a dan Extended Data Gambar 7a). Evaluasi skor klinis (ukuran kumulatif penurunan berat badan, pernapasan abnormal, penampilan menyimpang, berkurangnya daya tanggap, dan perubahan perilaku) juga menunjukkan pola serupa; sedangkan tikus yang terinfeksi Omicron menunjukkan sedikit atau tidak ada tanda-tanda penyakit klinis, kesehatan tikus yang terinfeksi WT dan Omi-S memburuk dengan cepat, dengan virus WT menyebabkan penyakit yang lebih parah (P=0.0102) (Gbr. 2). 2b dan Data Diperluas Gambar 7b). Karena SARS-CoV-2 menyebabkan infeksi fatal pada tikus K18-hACE24 , kami membandingkan kelangsungan hidup tikus setelah infeksi virus. Sesuai dengan hasil penurunan berat badan dan skor klinis, WT dan Omi-S menyebabkan angka kematian masing-masing sebesar 100% (6/6) dan 80% (8/10). Sebaliknya, semua tikus yang terinfeksi Omicron selamat (Gbr. 2c). Temuan ini, yang konsisten dengan publikasi terbaru30, menunjukkan bahwa protein S bukanlah penentu eksklusif patogenisitas Omicron pada tikus K18-hACE2.

Selanjutnya, kami membandingkan penyebaran Omi-S dengan Omicron dan WT SARS-CoV-2 di paru-paru dan turbinat hidung tikus K18-hACE2. Tikus (12-20 minggu) ditantang secara intranasal dengan 104 PFU (tujuh tikus per virus), dan titer virus di paru-paru tikus diukur pada 2 dan 4 dpi. Konsisten dengan temuan in vitro, titer virus menular di paru-paru tikus yang terinfeksi WT lebih tinggi dibandingkan yang terdeteksi pada tikus yang terinfeksi dua virus lainnya (Gambar 2d). Namun yang menarik, tikus yang terinfeksi Omi-S menghasilkan partikel virus yang menular 30-kali lipat (P=00,0286) dibandingkan dengan tikus yang terinfeksi Omicron pada 2 dpi. Titernya menurun pada 4 dpi untuk tikus yang terinfeksi WT dan Omi-S, namun hal ini menunjukkan tren peningkatan pada tikus yang terinfeksi Omicron, menunjukkan kemungkinan infeksi ringan namun terus-menerus oleh Omicron pada tikus K18-hACE2. Ketiga varian yang diperoleh dari paru-paru tikus mempertahankan fenotip ukuran plak yang sama dengan inokulum asli, yang menunjukkan bahwa replikasi pada tikus tidak memiliki efek yang dapat dideteksi pada genotipe virus-virus ini (data tidak ditampilkan).

Untuk mengevaluasi patogenisitas virus di paru-paru dan turbinat hidung tikus K18-hACE2, kami melakukan analisis histopatologis jaringan ini pada 2 dpi. Seperti yang dilaporkan sebelumnya4,31, imunoreaktivitas hampir tersebar luas dari protein SARS-CoV-2 N terdeteksi di alveoli paru-paru tikus yang terinfeksi virus WT (Gbr. 2e). Sebaliknya, infeksi Omi-S dan Omicron menghasilkan fokus pewarnaan alveolar yang terlokalisasi dengan fokus Omicron yang lebih sedikit dibandingkan dengan Omi-S. Fenotipe yang paling jelas terlihat pada epitel bronkiolar, di mana Omi-S menyebabkan infeksi yang jelas dan melingkar secara rutin, dengan sekitar 10-15% bronkiolus positif mengandung protein N virus pada 2 dpi, sedangkan hanya 3-5% bronkiolus yang positif mengandung N. -positif untuk Omicron (Gbr. 2f). Virus WT menginfeksi sekitar 1% bronkiolus dan dalam semua kasus hanya mencakup satu sel epitel terisolasi per bronkiolus. Selain itu, infeksi bronkiolar dikaitkan dengan nekrosis epitel pada tikus yang terinfeksi Omi-S, sebagaimana ditentukan melalui analisis serial hematoxylin dan eosin (H&E), sedangkan tidak ada bukti histologis cedera saluran napas yang diamati pada tikus yang terinfeksi Omicron atau WT (Data Tambahan Gambar 8a,b). Turbinat hidung tikus yang diinokulasi dengan virus WT dan Omi-S, keduanya mengandung banyak sel positif SARS-CoV-2-, yang dikaitkan dengan efek sitopatik yang nyata, sedangkan Omicron menghasilkan sel positif sporadis yang langka, tanpa tanda-tanda epitel yang jelas. cedera (Data Diperpanjang Gambar 8c). Secara keseluruhan, temuan ini menunjukkan bahwa replikasi Omicron pada saluran pernapasan tikus secara substansial dilemahkan dibandingkan dengan Omi-S, mendukung kesimpulan kami bahwa mutasi pada S hanya sebagian bertanggung jawab atas melemahnya patogenisitas Omicron.

Mutasi pada S dan nsp6 menentukan redaman Omicron

Selain protein S, Omicron memiliki perubahan asam amino pada protein non-struktural 3 (nsp3), nsp4, nsp5, nsp6, nsp14, envelope (E), membran (M), dan protein N, jika dibandingkan dengan virus WT. (Data Diperluas Gambar 9a). Untuk mengidentifikasi protein non-spike yang terlibat dalam atenuasi Omicron, kami membuat panel besar virus chimeric berlabel fluoresen, masing-masing mengandung Omicron S dalam kombinasi dengan satu protein non-spike dari Omicron, dengan sisa protein berasal dari virus WT (Data Diperluas Gambar 9b). Ketika kami menggabungkan Omicron S dengan Omicron nsp6 (Omi-S/nsp6), kami mengamati penurunan yang kuat dalam replikasi virus, dengan kinetika infeksi yang meniru kinetika Omicron dalam kultur sel (Gambar 3a – d); tidak ada penurunan yang terlihat pada virus chimeric lainnya. Efisiensi replikasi Omi-S/nsp6 yang buruk juga dikuatkan oleh temuan kami bahwa Omi-S/nsp6 dan Omicron membutuhkan waktu hampir lima hingga enam hari untuk pulih dengan CPER, sedangkan semua varian lainnya pulih dalam dua hari (data tidak ditampilkan). Akhirnya, seperti Omicron, Omi-S/nsp6 jelas dikalahkan oleh Omi-S dalam uji kompetisi langsung (Gbr. 3e).

Gambar 2|Peran S dalam patogenisitas Omicron. a – c, tikus K18-hACE2 jantan dan betina (berusia 12–20 minggu) diinokulasi secara intranasal dengan 1 × 104 PFU WT (n=6 tikus), virus Omi-S (n=10 tikus) atau Omicron (n {{1{{40}}}} tikus). Dua stok virus yang dihasilkan secara independen digunakan dalam percobaan ini. Berat badan (a), skor klinis (b), dan kelangsungan hidup (c) dipantau setiap hari selama 14 hari. Tikus yang kehilangan 20% berat badan awalnya di-eutanasia. d,e, K18-hACE2 tikus diinokulasi secara intranasal dengan 1 × 104 PFU WT (n=14 tikus), Omi-S (n=14 tikus) dan Omicron (n {{ 20}} tikus). Sampel paru-paru tikus yang terinfeksi dikumpulkan pada 2 atau 4 dpi untuk menentukan titer virus (n=4 tikus) (d) atau untuk deteksi imunohistokimia (IHC) dari protein N (n=3 tikus) (e). Dalam e, disajikan gambar IHC representatif yang menunjukkan SARS-CoV-2 N (warna coklat) di alveoli (panah) dan bronkiolus (kepala panah) di paru-paru tikus pada 2 dpi. Skala bar, 100 µm. f, Persentase bronkiolus N-positif di paru-paru tikus yang terinfeksi (n=3 tikus) pada 2 dpi. Setiap titik mewakili tikus yang terinfeksi. Signifikansi statistik ditentukan dengan menggunakan uji t dua sisi, tidak berpasangan dengan koreksi Welch (a,b,d,f) dan uji log-rank (Mantel-Cox) (c). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 dan ****P < 0,0001; NS, tidak signifikan.

Di paru-paru tikus K18-hACE2, sedangkan Omi-S menyebabkan infeksi dan cedera bronkiolar yang luas, Omicron dan Omi-S/nsp6 menunjukkan penurunan infeksi tanpa bukti kerusakan epitel (Gbr. 3f). Konsisten dengan temuan ini, paru-paru tikus yang terinfeksi Omi-S/nsp6-menghasilkan titer virus yang setara dengan yang terlihat pada isolat rOmicron dan Omicron (Gbr. 3g). Akhirnya, 71% tikus yang terinfeksi Omi-S/nsp6 bertahan hidup (Gambar 3h) - berbeda dengan tingkat kelangsungan hidup yang hanya 20% yang diamati pada tikus yang terinfeksi Omi-S (Gambar 2c). Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa mutasi pada S dan nsp6 cukup untuk menentukan virulensi Omicron yang dilemahkan. Pengamatan ini mendukung dan memperluas temuan penelitian sebelumnya yang menunjukkan bahwa mutasi pada wilayah 5′-UTR–nsp12, tempat nsp6 berada, berkontribusi terhadap pelemahan Omicron pada tikus K18-hACE230.

Gambar 3|Mutasi pada S dan nsp6 mendorong patogenisitas Omicron.a–d, Kinetika replikasi virus reporter mNeonGreen yang terindikasi dalam sel ACE2/TMPRSS2/Caco-2 (MOI=0.01) ditentukan oleh aliran sitometri (n=3 ulangan) (a,c) dan uji plak (n=3 ulangan) (b,d). Eksperimen diulang dua kali. e, sel ACE2/ TMPRSS2/Caco-2 terinfeksi campuran virus dengan perbandingan 1:1 untuk mendapatkan MOI akhir sebesar 0.005 untuk setiap virus . Sel-sel difiksasi pada waktu yang ditentukan dan dianalisis dengan flow cytometry. Persentase sel yang tidak terinfeksi, terinfeksi tunggal, dan terinfeksi ganda ditampilkan. Sel yang terinfeksi tunggal digunakan untuk kompensasi. Titik data individual diplot bersama dengan rata-rata ± sd (n=3 ulangan). Percobaan diulang dua kali. f – h, tikus K18-hACE2 diinokulasi secara intranasal dengan virus 1 × 104 PFU. Sampel paru-paru tikus yang terinfeksi dikumpulkan pada 2 dpi untuk deteksi IHC protein N (n=3 tikus) (f) atau untuk penentuan titer virus (n=4 tikus) (g). Dalam f, gambar representatif pewarnaan H&E pada bronkiolus N-positif ditunjukkan pada sisipan. Nekrosis epitel bronkiolar ditunjukkan dengan panah. Tidak ada bukti nekrosis yang terlihat pada bronkiolus tikus yang terinfeksi Omicron atau Omi-S/nsp6. Bilah skala, 100 µm. Grafik kanan di f menunjukkan persentase bronkiolus N-positif di paru-paru tikus yang terinfeksi. Setiap titik mewakili tikus yang terinfeksi. h, Kelangsungan hidup tikus yang terinfeksi dipantau setiap hari selama 14 hari. Tikus yang kehilangan 20% berat badan awalnya di-eutanasia. Signifikansi statistik ditentukan dengan menggunakan uji t dua sisi, tidak berpasangan dengan koreksi Welch (a – g) dan uji log-rank (Mantel-Cox) (h). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 dan ****P < 0,0001; NS, tidak signifikan.

RBM protein S mendorong lolosnya vaksin Omicron

Sejumlah besar literatur telah memberikan bukti lepasnya Omicron dari imunitas humoral yang dipicu oleh vaksin14,19. Untuk menentukan wilayah S yang terkait dengan fenotip pelepasan kekebalan dari Omicron, pertama-tama kami membandingkan aktivitas netralisasi serum in vitro dari individu yang divaksinasi terhadap WT SARS-CoV-2 (USA-WA1/20 20), Omi-S, dan Omicron. Sera dikumpulkan dalam waktu dua bulan setelah dosis kedua vaksin mRNA-1273 (vaksin mRNA modern; n=12) atau BNT162b2 (vaksin mRNA Pfizer-BioNTech; n=12) dimasukkan (Data Tambahan Tabel 1). Kami melakukan uji netralisasi multisiklus menggunakan lingkungan di mana virus dan serum penetral selalu ada, meniru situasi pada individu yang seropositif. Semua serum Omicron dinetralkan dengan buruk, dengan pengenceran penetral setengah maksimal yang lebih rendah 11.1-kali lipat (kisaran: 4.4-hingga 81.2-lipat; P < 0.0001) (ND50) untuk Omicron dibandingkan dengan WA1 (Gbr. 4a,b). Faktanya, sekitar 80% sampel tidak sepenuhnya menetralkan Omicron pada konsentrasi tertinggi yang diuji (Data Diperpanjang Gambar 10). Khususnya, Omi-S menunjukkan nilai ND50 yang identik dengan Omicron (11.5-kali lipat lebih rendah dari WA1; P <0,0001) (Gbr. 4a,b), menunjukkan bahwa protein Omicron S, ketika dimasukkan ke dalam WT virus, berperilaku sama seperti di Omicron.

Gambar 4|Peran S dalam resistensi imun Omicron. Nilai ND50 untuk WA1, Omi-S, dan Omicron dalam serum dari individu yang menerima dua suntikan vaksin Moderna (donor 1–12) atau Pfizer (donor 13–24) (rincian serum lebih lanjut diberikan di Extended Tabel Data 1; kurva individual ditunjukkan pada Gambar Data yang Diperluas 10). b, Lintasan nilai ND50 terhadap WA1, Omi-S dan Omicron (data dari a diplot). Perubahan lipat pada nilai ND50 ditunjukkan (n=24 sampel serum). c – f, Skema virus chimeric (kiri; c,d) dan mutan (kiri; e,f). Penomoran asam amino untuk mutan WA1 di e didasarkan pada sekuens WA1 S, sedangkan penomoran mutan Omicron di f didasarkan pada sekuens Omicron S. Enam dari 24 serum (3 dari Moderna dan 3 dari Pfizer) diuji. Setiap sampel serum diwakili oleh titik dengan warna tertentu. Data diplot sebagai perubahan lipatan virus induk. Signifikansi statistik ditentukan dengan menggunakan uji-t dua sisi tidak berpasangan dengan koreksi Welch. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 dan ****P < 0,0001; NS, tidak signifikan.

Protein SARS-CoV-2 S terdiri dari dua domain: domain S1, yang berinteraksi dengan reseptor ACE2, dan domain S2, yang bertanggung jawab untuk fusi membran32. Di dalam domain S1 terdapat domain N-terminal (NTD) dan domain pengikat reseptor (RBD), yang berisi motif pengikat reseptor (RBM) yang melakukan kontak langsung dengan reseptor ACE233. NTD Omicron S memiliki 11 perubahan asam amino, termasuk 6 penghapusan dan satu 3-penyisipan panjang asam amino, sedangkan RBD berisi 15 mutasi, 10 di antaranya terkonsentrasi di RBM (Diperluas Data Gambar 1). Baik NTD maupun RBD menampung epitop penetral34–37, namun RBD bersifat imunodominan dan mewakili target utama aktivitas penetralisir yang ada dalam serum imun SARS-CoV-237,38. Untuk menentukan apakah fenotip resistensi netralisasi Omicron disebabkan oleh mutasi pada domain tertentu dari protein S, kami menghasilkan dua kelompok virus chimeric. Kelompok pertama terdiri dari virus WA1 yang membawa NTD, RBD atau RBM dari Omicron (Gbr. 4c), dan kelompok kedua terdiri dari virus Omi-S yang membawa NTD, RBD atau RBM dari WA1 (Gbr. 4d). Uji netralisasi menunjukkan bahwa mutasi pada RBM adalah penyebab utama resistensi Omicron terhadap imunitas humoral yang diinduksi oleh vaksin: mengganti RBM WA1 dengan RBM Omicron menurunkan ND50 sebesar 5.4-kali lipat (P < 0,0001), dan, sebaliknya, mengganti RBM Omi-S dengan WA1 meningkatkan ND50 sebesar 5.6-kali lipat (P=0.0003) (Gbr. 4c,d). Fakta bahwa tidak ada virus penukar RBM yang mencapai perbedaan sekitar 11-kali lipat yang terlihat antara WA1 dan Omi-S menunjukkan bahwa mutasi pada bagian lain dari S juga berkontribusi terhadap resistensi vaksin.

Untuk menyelidiki apakah mutasi spesifik pada Omicron RBM mendorong lolosnya vaksin, kami membuat dua panel tambahan dari virus rekombinan, satu dengan WA1 S yang membawa mutasi Omicron RBM, baik secara tunggal atau kombinasi (Gambar 4e), dan yang lainnya dengan Omicron S yang tidak memiliki mutasi yang sama. kumpulan mutasi (Gbr. 4f). Dua mutan WA1-mutan 3 (dengan substitusi E484A) dan mutan 4 (mengandung kelompok lima substitusi Q493R, G496S, Q498R, N501Y dan Y505H)-menunjukkan penurunan yang moderat namun signifikan secara statistik sebesar 1.4-kali lipat ( P=0.0002) dan 1.8-fold (P=0.0003) masing-masing dalam nilai ND50, dibandingkan dengan WA1 (Gbr. 4e). Hal sebaliknya diamati ketika mutasi ini dihilangkan dari Omicron S; mutan Omicron 3 (tidak memiliki substitusi E484A) dan mutan 4 (tidak memiliki Q493R, G496S, Q498R, N501Y, dan Y505H) memiliki 1.9-lipatan (P=0.0082) dan 3.{{38 }}lipat (P=0.0025) nilai ND50 lebih tinggi dibandingkan dengan Omicron (Gbr. 4f). Karena tidak ada satu pun mutan yang menangkap keseluruhan fenotip Omicron, kami berasumsi bahwa pelepasan vaksin adalah efek kumulatif dari mutasi yang didistribusikan sepanjang protein S. Ada kemungkinan bahwa mutasi mengubah konformasi Omicron S sedemikian rupa sehingga sebagian besar epitop penetral imunodominan terganggu dan menjadi tidak tersedia untuk netralisasi.

cistanche tubulosa-meningkatkan sistem kekebalan tubuh

Diskusi

Studi ini memberikan wawasan penting tentang protein virus yang berkontribusi terhadap patogenisitas SARS-CoV. Kami menunjukkan bahwa S, protein yang paling banyak bermutasi di Omicron, memiliki peran yang tidak lengkap dalam atenuasi Omicron. Dalam pengujian infeksi berbasis sel, virus Omi-S menunjukkan efisiensi replikasi menengah antara virus leluhur dan Omicron. Demikian pula, pada tikus K18-hACE2, Omi-S berbeda dengan Omicron yang tidak fatal dan menyebabkan kematian 80%; virus leluhur menyebabkan 100% kematian pada tikus ini. Khususnya, ketika kami menggabungkan mutasi S dengan mutasi pada nsp6, virus tersebut menunjukkan fenotip yang dilemahkan yang sebagian besar mirip dengan Omicron, yang menunjukkan bahwa kedua protein ini merupakan penentu utama patogenisitas Omicron. Penelitian di masa depan akan menguraikan mekanisme mutasi nsp6 mempengaruhi replikasi virus.

Salah satu potensi keterbatasan penelitian kami adalah penggunaan tikus K18-hACE2 untuk studi patogenesis dibandingkan model primata yang memiliki lebih banyak kemiripan dengan manusia39. Namun perlu dicatat bahwa tikus K18-hACE2 adalah model yang sudah mapan untuk menyelidiki fenotip mematikan SARS-CoV-24,31. Meskipun tikus ini mengalami kelainan paru-paru setelah infeksi SARS-CoV-2, angka kematian dikaitkan dengan keterlibatan sistem saraf pusat karena invasi dan penyebaran saraf virus31,40. Fakta bahwa infeksi tikus K18-hACE2 dengan Omi-S, tetapi tidak dengan Omicron, menimbulkan tanda-tanda neurologis (misalnya, postur membungkuk dan kurangnya respons) menunjukkan bahwa properti neuroinvasion dipertahankan di Omi-S, mungkin karena efisiensi replikasinya yang lebih tinggi, dan faktor penentu sifat ini terletak di luar protein S. Temuan ini konsisten dengan penelitian sebelumnya yang menunjukkan bahwa hamster yang terinfeksi Omi-S mengeluarkan lebih banyak virus dan kehilangan berat badan lebih banyak dibandingkan hamster yang terinfeksi Omicron. Hal ini menunjukkan bahwa mutasi di luar S berkontribusi terhadap melemahnya patogenisitas Omicron41.

Kami menemukan bahwa meskipun virus leluhur ini terutama bereplikasi di alveoli paru-paru dan jarang menyebabkan infeksi bronkiolus pada tikus K18-hACE2, baik Omi-S maupun Omicron menunjukkan peningkatan kecenderungan untuk bereplikasi di epitel bronkiolar, yang menunjukkan bahwa virus S. protein bertanggung jawab atas perubahan tropisme. Mekanisme di balik peralihan ini tidak diketahui, namun ada kemungkinan bahwa Omicron S lebih efisien dibandingkan WT S dalam menggunakan cathepsin B atau cathepsin L (ref. 25,42,43), yang membentuk jalur masuk virus aktif di bronkiolus dan saluran napas lainnya. sel41. Sebaliknya, masuknya SARS-CoV-2 ke dalam sel epitel alveolar terutama didorong oleh TMPRSS2 (ref. 28,44), yang mana Omicron S tidak dapat memanfaatkannya25,45, menyebabkan buruknya infeksi pada sel-sel ini4,5 ,25,43. Temuan ini mungkin menjelaskan melemahnya patologi paru yang disebabkan oleh Omicron.

manfaat cistanche-memperkuat sistem kekebalan tubuh

Omicron nsp6 memiliki dua lokasi yang berubah relatif terhadap prototipe isolat SARS CoV-2 Wuhan-Hu-1: penghapusan tiga asam amino (LSG, posisi 105–107) dan substitusi I189V (Gambar Data yang Diperluas .9). Beberapa fungsi nsp6 dalam replikasi virus corona telah dijelaskan; yang paling utama di antaranya adalah biogenesis vesikel membran ganda (DMV), yang mewakili tempat sintesis RNA virus46-50. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa DMV SARS-CoV-2 sebagian besar dihasilkan oleh kerja sama tiga protein virus: nsp3, nsp4, dan nsp6; meskipun nsp3 dan nsp4 cukup untuk pembentukan DMV, nsp6 menghubungkan DMV ini dengan retikulum endoplasma dan menyalurkan komunikasi penting antara struktur-struktur ini46. Apakah konstelasi mutasi pada Omicron nsp6 mempengaruhi pembentukan atau fungsi DMV memerlukan penyelidikan lebih lanjut. Nsp6 juga mengaktifkan produksi sitokin yang bergantung pada NLR dan piroptosis di paru-paru pasien COVID, yang berfungsi sebagai faktor virulensi utama47. Sebagai catatan, varian nsp6 yang dikaitkan dengan COVID-19 tanpa gejala menunjukkan berkurangnya kemampuan untuk menginduksi piroptosis47, sehingga memicu spekulasi bahwa mutasi pada Omicron nsp6 juga dapat memengaruhi piroptosis. Studi mekanistik terperinci diperlukan untuk membedah efek mutasi Omicron pada fungsi nsp6.

Saat ini tidak diketahui apakah mutasi pada S dan nsp6 bekerja sama satu sama lain untuk mendorong redaman Omicron. Mengingat bahwa Omicron S menunjukkan kecenderungan yang lebih tinggi terhadap bronkiolus, ada kemungkinan bahwa S bertanggung jawab atas perubahan tropisme virus, sedangkan mutasi non-spike-termasuk yang terjadi pada nsp6-hanya merupakan adaptasi terhadap perubahan lingkungan jaringan. Perlu disebutkan bahwa meskipun nsp6 tampaknya merupakan protein non-spike utama di balik pelemahan Omicron, kontribusi protein virus lainnya tidak dapat sepenuhnya dikesampingkan. Eksperimen in vitro yang meneliti peran mutasi non-spike semuanya dilakukan pada sel ACE2/TMPRSS2/Caco-2. Menggunakan jenis sel lain yang lebih kompeten terhadap kekebalan tubuh juga dapat mengungkap efek mutasi non-lonjakan lainnya. Selain itu, virus chimeric kami mengandung Omicron S yang dipasangkan dengan hanya satu protein non-spike pada satu waktu, yang membatasi interaksi epistatik jangka panjang antara mutasi pada beberapa protein virus.

manfaat cistanche untuk pria-memperkuat sistem kekebalan tubuh

Penelitian kami menunjukkan bahwa mutasi pada RBM Omicron S adalah penentu utama lepasnya Omicron dari antibodi penawar, meskipun mutasi di wilayah S lain juga berkontribusi. Dalam RBM, kami mengidentifikasi dua titik mutasi, yang memberikan Omicron S kemampuan untuk menolak netralisasi: satu mengandung substitusi E484A dan yang lainnya berisi sekelompok lima substitusi-Q493R, G496S, Q498R, N501Y, dan Y505H. Substitusi E484A telah terbukti lolos dari netralisasi dengan serum pemulihan51. Selain itu, pemodelan struktural menunjukkan bahwa beberapa antibodi monoklonal terapeutik membentuk jembatan garam yang sangat stabil dengan residu E484, seluruhnya kehilangan ikatannya ketika residu ini diubah menjadi A atau setelah perubahan Q493K dan Y505H52. Demikian pula, pemetaan residu RBM yang berinteraksi langsung dengan 49 antibodi penetralisir yang diketahui mengungkapkan N440, G446, S477, dan T478 sebagai interaksi frekuensi rendah, N501, Y505, dan Q498 sebagai interaksi frekuensi menengah, dan E484 dan Q493 sebagai interaksi frekuensi tinggi53 , sejalan dengan hasil uji netralisasi kami. Khususnya, meskipun potensi pengikatan antibodi Omicron S terganggu54, kapasitas pengikatan reseptornya masih utuh. Faktanya, RBD Omicron memiliki afinitas yang lebih tinggi terhadap ACE2 dibandingkan RBD Wuhan-Hu-1 dan Delta25. Hal ini menunjukkan bahwa mutasi pada Omicron S telah berevolusi sedemikian rupa sehingga menghambat pengikatan antibodi namun mempertahankan keterlibatan reseptor. Hal ini membuka kemungkinan untuk menargetkan wilayah S yang dikonservasi dan dibatasi secara struktural yang terlibat dalam pengakuan ACE2 untuk desain vaksin berspektrum luas guna mengendalikan pandemi COVID.

referensi

1. Liu, L. dkk. Penghindaran antibodi yang mencolok yang dimanifestasikan oleh varian Omicron dari SARS-CoV-2. Alam 602, 676–681 (2022).

2. Planas, D. dkk. Banyaknya pelepasan SARS-CoV-2 Omicron ke netralisasi antibodi. Alam 602, 671–675 (2022).

3. Schmidt, F. dkk. Netralisasi plasma varian SARS-CoV-2 Omicron. N.Inggris. J.Med. 386, 599–601 (2022).

4. Shuai, H. dkk. Replikasi dan patogenisitas SARS-CoV yang dilemahkan-2 B.1.1.529 Omicron. Alam 603, 693–699 (2022).

5. Halfmann, PJ dkk. SARS-CoV-2 Virus Omicron menyebabkan penyakit yang dilemahkan pada tikus dan hamster. Alam 603, 687–692 (2022).

6. Lewnard, JA dkk. Hasil klinis yang terkait dengan varian SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) dan infeksi subvarian BA.1/BA.1.1 atau BA.2 di California Selatan. Nat. medis. 28 Agustus 1933–1943 (2022).

7. Wolter, N. dkk. Penilaian awal terhadap tingkat keparahan klinis varian omicron SARS-CoV-2 di Afrika Selatan: studi keterkaitan data. Lancet 399, 437–446 (2022).

8. Ulloa, AC, Buchan, SA, Daneman, N. & Brown, KA Perkiraan tingkat keparahan varian SARS-CoV-2 Omicron di Ontario, Kanada. Selai. medis. Asosiasi. 327, 1286–1288 (2022).

9. Uraki, R. dkk. Karakterisasi isolat SARS-CoV-2 Omicron BA.4 dan BA.5 pada hewan pengerat. Alam 612, 540–545 (2022).

10. Uraki, R. dkk. Karakterisasi dan kerentanan antivirus SARS-CoV-2 Omicron BA.2. Alam 607, 119–127 (2022).

11. Dyer, O. Covid-19: Omicron menyebabkan lebih banyak infeksi tetapi lebih sedikit pasien yang dirawat di rumah sakit dibandingkan Delta, menurut data di Afrika Selatan. Sdr. medis. J.375, n3104 (2021).

12. Sigal, A. Penyakit yang lebih ringan dengan Omicron: apakah itu virus atau kekebalan yang sudah ada sebelumnya? Nat. Pendeta Imunol. 22, 69–71 (2022).

13. SIAPA. Melacak varian-2 SARS-CoV https://www.who.int/en/activities/tracking-SARS CoV-2-variants/ (2022).

14. Cele, S. dkk. Omicron secara luas namun tidak sepenuhnya lolos dari netralisasi Pfizer BNT162b2. Alam 602, 654–656 (2022).

15. Gu, H. dkk. Kemungkinan penularan varian omicron SARS-CoV-2 di hotel karantina, Hong Kong, Tiongkok, November 2021. Emerg. Menulari. Dis. 28, 460–462 (2022).

16. Iuliano, AD dkk. Tren keparahan penyakit dan pemanfaatan layanan kesehatan selama periode awal varian Omicron dibandingkan dengan periode penularan tinggi SARS-CoV sebelumnya-2 - Amerika Serikat, Desember 2020–Januari 2022. Morb. Makhluk hidup. Rep Mingguan 71, 146–152 (2022).

17. CDC. Pelacak Data COVID https://covid.cdc.gov/covid-data-tracker/#variant-proportions (2022).

18. Taylor, L. Covid-19: Omicron mencapai rekor infeksi global tertinggi mingguan. Sdr. medis. J.376, o66 (2022).

19. Dejnirattisai, W. dkk. SARS-CoV-2 Omicron-B.1.1.529 menyebabkan hilangnya respons antibodi penetralisir secara luas. Sel 185, 467–484 (2022).

20. Suzuki, R. dkk. Fusogenisitas dan patogenisitas varian SARS-CoV-2 Omicron yang dilemahkan. Alam 603, 700–705 (2022).

21. Smyth, DS dkk. Melacak garis keturunan samar SARS-CoV-2 yang terdeteksi di air limbah NYC. Nat. Komunitas. 13, 635 (2022).

22. Kirby, AE dkk. Catatan dari lapangan: bukti awal varian SARS-CoV-2 B.1.1.529 (Omicron) di air limbah masyarakat-Amerika Serikat, November–Desember 2021. Morb. Makhluk hidup. Rep Mingguan 71, 103–105 (2022).

23. Herrmann, A. dkk. Kloning genom SARS-CoV-2 bebas jalur dan mutagenesis menggunakan rekombinasi merah. Int. J.Mol. Sains. 22, 10188 (2021).

24. Liu, G. & Gack, MU Metode berbasis reaksi ekstensi polimerase sirkular yang dioptimalkan untuk analisis fungsional SARS-CoV-2. Pracetak di https://doi.org/10.1101/2022.11.26.518005 (2022).

25. Meng, B. dkk. Perubahan penggunaan TMPRSS2 oleh SARS-CoV-2 Omicron berdampak pada tropisme dan fusogenisitas. Alam 603, 706–714 (2022).

26. Willett, BJ dkk. SARS-CoV-2 Omicron adalah varian pelarian kekebalan dengan jalur masuk sel yang diubah. Nat. Mikrobiol. 7 Agustus 1161–1179 (2022).

27. Martines, RB dkk. Patologi dan patogenesis SARS-CoV-2 terkait dengan penyakit virus corona yang fatal, Amerika Serikat. Muncul. Menulari. Dis. 26 September 2005–2015 (2020).

28. Huang, J. dkk. Infeksi SARS-CoV-2 pada sel alveolar tipe 2 paru-paru manusia yang berasal dari sel induk berpotensi majemuk menimbulkan respons inflamasi epitel-intrinsik yang cepat. Sel Induk Sel 27, 962–973 (2020).

29. Mulay, A. dkk. Infeksi SARS-CoV-2 pada epitel paru-paru manusia primer untuk pemodelan COVID-19 dan penemuan obat. Rep Sel 35, 109055 (2021).

30. Liu, S., Selvaraj, P., Sangare, K., Luan, B. & Wang, TT Atenuasi independen protein lonjakan varian SARS-CoV-2 Omicron pada tikus laboratorium. Rep Sel 40, 111359 (2022).

31. Carossino, M. dkk. Neurodisseminasi fatal dan tropisme SARS-CoV-2 pada tikus K18-hACE2 hanya sebagian bergantung pada ekspresi hACE2. Virus 14, 535 (2022).

32. Huang, Y., Yang, C., Xu, XF, Xu, W. & Liu, SW Sifat struktural dan fungsional protein lonjakan SARS CoV-2: potensi pengembangan obat antivirus untuk COVID-19 . Farmakol Akta. Dosa. 41, 1141–1149 (2020).

33. Lan, J. dkk. Struktur domain pengikat reseptor lonjakan SARS-CoV-2 yang terikat pada reseptor ACE2. Alam 581, 215–220 (2020).

34. Chi, X. dkk. Antibodi manusia yang menetralisir berikatan dengan domain N-terminal protein Spike SARS-CoV-2. Sains 369, 650–655 (2020).

35. Voss, WN dkk. Pengenalan IgG yang lazim, protektif, dan konvergen terhadap epitop lonjakan SARS-CoV-2 non-RBD. Sains 372, 1108–1112 (2021).

36. Premkumar, L. dkk. Domain pengikat reseptor protein lonjakan virus merupakan target antibodi imunodominan dan sangat spesifik pada pasien SARS-CoV-2. Sains. imunol. 5, ebc8413 (2020).

37. Ju, B. dkk. Antibodi penetralisir manusia yang ditimbulkan oleh infeksi SARS-CoV-2. Alam 584, 115–119 (2020).

38. Piccoli, L. dkk. Memetakan situs penetralisir dan imundominan pada domain pengikat reseptor lonjakan SARS-CoV-2 dengan serologi resolusi tinggi yang dipandu struktur. Sel 183, 1024–1042 (2020).

39. Chang, MC, Hild, S. & Grieder, F. Model primata bukan manusia untuk penelitian SARS-CoV-2: pertimbangkan alternatif pengganti kera. Lab Anim. 50, 113–114 (2021).

40. Kumari, P. dkk. Neuroinvasi dan ensefalitis setelah inokulasi SARS CoV-2 intranasal pada tikus K18-hACE2. Virus 13, 132 (2021).

41. Merak, TP dkk. Perubahan jalur masuk dan jarak antigenik varian SARS-CoV-2 Omicron dipetakan untuk memisahkan domain protein lonjakan. Pracetak di https://doi.org/ 10.1101/2021.12.31.474653 (2022).

42. Padmanabhan, P. & Dixit, NM Memodelkan bagaimana perubahan penggunaan jalur masuk sel oleh varian SARS-CoV-2 Omicron dapat memengaruhi kemanjuran dan sinergi TMPRSS2 dan inhibitor cathepsin B/L. Pracetak di https://doi.org/10.1101/2022.01.13.476267 (2022).

43. Hui, KPY dkk. SARS-CoV-2 Replikasi varian Omicron pada bronkus dan paru-paru manusia secara ex vivo. Alam 603, 715–720 (2022).

44. Grau-Exposito, J. dkk. Evaluasi masuknya SARS-CoV-2, peradangan dan terapi baru pada sel jaringan paru-paru manusia. Patog PLoS. 18, e1010171 (2022).

45. Zhao, H. dkk. Varian SARS-CoV-2 Omicron menunjukkan aktivitas replikasi dan fusi yang kurang efisien jika dibandingkan dengan varian Delta pada sel yang diekspresikan TMPRSS2-. Muncul. Mikroba Menginfeksi. 11, 277–283 (2022).

46. ​​Ricciardi, S. dkk. Peran NSP6 dalam biogenesis organel replikasi SARS-CoV-2. Alam 606, 761–768 (2022).

47. Matahari, X. dkk. SARS-CoV-2 protein non-struktural 6 memicu piroptosis yang bergantung pada NLRP3-dengan menargetkan ATP6AP1. Kematian Sel Berbeda. 29 Agustus 1240–1254 (2022).

48. Cottam, EM, Whelband, MC & Wileman, T.Coronavirus NSP6 membatasi ekspansi autophagosome. Autofagi 10, 1426–1441 (2014).

49. Benvenuto, D. dkk. Analisis evolusi SARS-CoV-2: bagaimana mutasi protein non-struktural 6 (NSP6) dapat memengaruhi autofagi virus. J. Menginfeksi. 81, e24–e27 (2020).

50. Gosert, R., Kanjanahaluethai, A., Egger, D., Bienz, K. & Baker, SC Replikasi RNA virus hepatitis tikus terjadi di vesikel membran ganda. J.Virol 76, 3697–3708 (2002).

51. Liu, Z. dkk. Identifikasi mutasi lonjakan SARS-CoV-2 yang melemahkan netralisasi antibodi monoklonal dan serum. Mikroba Inang Sel 29, 477–488 (2021).

52. Shah, M. & Woo, HG Omicron: varian SARS-CoV-2 yang sangat bermutasi menunjukkan ikatan yang lebih kuat dengan ACE2 dan berpotensi lolos dari antibodi terapeutik COVID-19 yang disetujui. Depan. imunol. 12, 830527 (2021).

53. Struktur Ye, G., Liu, B. & Li, F. Cryo-EM dari ektodomain protein lonjakan omicron SARS-CoV-2. Nat. Komunitas. 13 Agustus 1214 (2022).

54. Carreno, JM dkk. Aktivitas serum penyembuhan dan vaksin terhadap SARS-CoV-2 Omicron. Alam 602, 682–688 (2022).